弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 体外扩增弓形虫RH株膜表面抗原SAG1编码基因，构建原核表达质粒，并表达SAG1编码基因序列。方法 收集、纯化RH株速殖子，提取RNA，据已知的SAG1基因序列，在设计合成的1对引物中引入EcoRI和HindⅢ酶切位点。应用RT—PCR技术，扩增SAG1基因片段，插入原核表达质粒pET28a中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，重组子经EcoRI和HindⅢ双酶切、PCR鉴定，转化宿主菌BL21，并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株RNA中扩增出1011bp的SAG1基因片段，构建重组质粒pET28a／SAG1，酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符；IPTG诱导，SDS—PAGE显示表达产物的大小约34．8kD．结论 成功地从弓形虫RH株RNA中获取SAG1基因，构建了pET28a／SAG1重组质粒并获得了高效表达，为免疫学诊断和蛋白质疫苗的研究创造了条件。     

人血浆蛋白S成熟肽基因在大肠杆菌中的融合表达

目的 构建人血浆蛋白S的原核表达载体并诱导其表达。方法 自行设计引物，采用PCR法，以现有人血浆蛋白S真核表达载体为模板，扩增人血浆蛋白S成熟肽的编码序列。PCR产物经EcoRI和BamHI双酶切后，克隆至GST融合表达载体pGEX-2T中，在E．coli BL21中诱导GST-人血浆蛋白S融合蛋白的表达。结果 对重组质粒的序列分析表明，插入片段的序列与Gen Bank登录的人血浆蛋白S基因编码序列完全一致。10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达分子量约为96kD的产物．并可通过GST亲和层析柱纯化。结论 人血浆蛋白S编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-2T，并在E．coli BL21中获得表达。     

人血管内皮生长因子DNA克隆和在大肠杆菌中的表达

克隆人血管内皮生长因子165(Vascular endothelail growth factor165，VEGF165)并在大肠杆菌中诱导表达。用RT-PCR法从人白血病细胞株TF1扩增VEGF165 DNA片段，将该片段插入质粒pUCmT中并测序鉴定。将测序正确的pUCmT-VEGF165与PET20b( )均用EcoRI和SalI双酶切，回收纯化目的基因片段与表达载体，构建VEGF165的原核表达载体PET20b( )-VEGF165，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，IPTG诱导表达，表达产物用Ni-NTA Resin纯化，SDS-PAGE及Western Blot鉴定重组蛋白。结果表示：1．测序结果示扩增的VEGF165序列与文献报道相符；2．SDS-PAGE电泳示IPTG诱导后出现分子质量约23kd的重组蛋白条带；3．Western Blot分析表明重组蛋白可与兔抗人VEGF单克隆抗体特异性结合。成功克隆、表达及纯化VEGF165，为研究其功能奠定基础。     

乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达

目的用基因工程的方法获得乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)编码区的基因片段,构建重组质粒并在大肠杆菌中表达抗原蛋白。方法用PCR法扩增HBcAg基因片段,构建含有HBcAg基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)plys中以IPTG诱导重组蛋白的表达,并用Western blot对重组蛋白进行检测。结果重组HBcAg在大肠杆菌中得到表达,Western blot检测显示在预期位置出现特异性条带。结论成功构建HBcAg原核表达系统并获得重组HBcAg,为该重组蛋白的相关功能研究奠定了基础。     

人白细胞介素-29 cDNA克隆及其在大肠杆菌系统的表达

目的：克隆人细胞因子IL-29全长cDNA及其在大肠杆菌中表达,制备抗IL-29多克隆抗体。方法：分离外周血单核细胞;VSV感染后,提取总RNA,通过一步RT-PCR获得IL-29全长cDNA。DNA测序正确后,将IL-29cDNA的编码框序列构建到原核表达载体pET28a(+)中。卡那霉素平板筛选及PCR鉴定,挑出阳性克隆进行扩增、转化大肠杆茵进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western blotting鉴定,亲和层析分离纯化得到Mr为23000组氨酸标签重组人IL-29融合蛋白。纯化的IL-29免疫家兔制备抗IL-29多克隆抗体。结果：成功获得人IL-29全长cDNA,并以包涵体形式表达于大肠杆茵中。免疫家兔后获得特异抗IL-29的多克隆抗体。结论：获得rhlL-29细胞因子及其多克隆抗体,为其进一步研究及应用奠定基础。     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列,设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段,应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中,进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α）,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白,用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆,经酶切和核酸测序鉴定,得到正确的重组质粒pET-PCT,并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带;用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体,基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化,为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。     

重组人转化生长因子β 1在大肠杆菌中的表达及其活性检测

目的运用基因重组的方法,对人转化生长因子β1(TGF－β1)进行基因克隆,并在大肠杆菌中表达。同时检测其生物活性。方法以pBV220作为原核细胞表达载体,用限制性内切酶将pBSksTGF－β1中的TGF－β1cDNA片段定向重组到pBV200的多克隆位点上,经酶切分析,筛选构建了原核细胞表达性质粒pTGF－β1。将该质粒分别转化至大肠杆菌中,建立TGF－β1原核表达体系pTGF－β1－DH5α和pTGF－β1－JM109,进行温度诱导表达。结果表达产物经SDS－PAGE分析,Westernblot、SDS、PAGE光密度扫描检测证实,该体系可高效表达TGF－β1,其表达产物约占菌体可溶性蛋白的23％。用NRK细胞对表达产物进行活性检测证明,本研究生产的TGF－β1具有该蛋白的野生活性。结论TGF－β1原核表达体系的建立为TGF－β1的生产提供了高效的表达工程菌株,为进一步研究其分离纯化工艺提供了重要的实验模型。     

重组人转化生长因子β_1在大肠杆菌中的表达及其活性检测

目的运用基因重组的方法,对人转化生长因子β 1(TGF－β 1)进行基因克隆,并在大肠杆菌中表达。同时检测其生物活性。方法以 pBV220作为原核细胞表达载体,用限制性内切酶将 pBSksTGF－β 1中的 TGF－β 1cDNA片段定向重组到 pBV200的多克隆位点上,经酶切分析,筛选构建了原核细胞表达性质粒 pTGF－β 1。将该质粒分别转化至大肠杆菌中,建立 TGF－β 1原核表达体系 pTGF－β 1-DH5α和 pTGF－β 1-JM109,进行温度诱导表达。结果表达产物经 SDS-PAGE分析, Western- blot、 SDS、 PAGE光密度扫描检测证实,该体系可高效表达 TGF－β 1,其表达产物约占菌体可溶性蛋白的 23％。用 NRK细胞对表达产物进行活性检测证明,本研究生产的 TGF－β 1具有该蛋白的野生活性。结论 TGF－β 1原核表达体系的建立为 TGF－β 1的生产提供了高效的表达工程菌株,为进一步研究其分离纯化工艺提供了重要的实验模型。     

狗钠-钙交换体基因在大肠杆菌中的克隆和表达

[目的]在大肠杆菌中表达NCX cDNA从418到996位核苷酸之间的片段。[方法]用RT-PCR方法从狗脑组织中扩增得到NCX cDNA片段,将其用载体pGEM-T Easy克隆和亚克隆,DNA序列分析正确后再插入融合表达载体pET-28b( )中,构建原核表达菌株并诱导表达。[结果]含重组表达载体的E．coli BL21(DE3)经IPTG诱导,15％SDS-PAGE呈现一约26kD的特异表达带。[结论]表达了含目的片段的融合蛋白,为抗NCX抗体制备及其对于NCX功能影响的研究提供了条件。     

CDCP1胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体。方法以 A549的 mRNA 为模板,应用所设计的引物通过 RT-PCR 法扩增 CDCP1胞外段基因;将 PCR 产物与 pGEX-KG 载体连接,获得重组质粒 pGEX-KG/CDCP1;经双酶切、PCR 及 DNA 序列测定进行鉴定;IPTG 诱导表达。结果①RT-PCR 扩增得到约270 bp 大小的 CDCP1胞外段基因目的片段;②目的片段正确插入到 pGEX-KG 中;③经 IPTG 诱导表达,可见在相对分子质量约35kD 处出现明显的诱导蛋白条带,与预期一致。结论成功构建了携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中获得大量表达。     

IGF-1a的克隆与表达

目的构建IGF-1a,并将其表达及纯化。方法用多重PCR技术获得人IGF-1a基因,采用酶切与连接的方法,将其连接至pET28a载体,用IPTG诱导转化pET28a-Cpn10-IGF-1a表达载体的大肠杆菌,以镍金属鳌合亲和层析法纯化融合蛋白质。结果构建了IGF-1a的表达载体pET28a-Cpn10-IGF-1a,DNA序列测定结果表明构建正确;以镍金属鳌合亲和层析获得纯度为98%的蛋白质。结论用分子克隆技术正确克隆IGF-1a,并成功表达与纯化IGF-1a蛋白。     

血红素加氧酶1分子克隆及表达载体的构建

背景:近年来许多研究发现血红素加氧酶1具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用,并且在心肌缺血-再灌注损伤等应激反应中有重要的保护作用,从而成为研究热点.目的:克隆大鼠血红素加氧酶1全长基因,并将其于真核表达载体PIRES2-EGFP相连接,构建血红素加氧酶1的真核表达载体.设计、时间及地点:实验于2008-03/06在苏州大学生物技术研究所完成.材料:成年雄件SD大鼠,由苏州大学动物实验中心提供,用于脾脏细胞总RNA的提取;克隆载体PMDl8-T购自Takara公司;表达载体PIRES2-EGFP由苏州大学生物技术研究所保存.方法:分离大鼠脾脏获取脾脏细胞,Trizol法提取脾脏细胞的总RNA,经反转录一聚合酶链反应扩增获得血红素加氧酶1基因,将扩增出来的产物与克隆载体PMDl8.T连接,转化TOP10感受态细菌,挑取阳性克隆经PCR及酶切鉴定后测序确证.测序正确后抽提质粒作为模板进行PCR,Sal-Ⅰ和BamH-Ⅰ同时双酶切PCR产物和载体PIRES2-EGFP,再在T4 DNA连接酶的作用下进行连接,构建其真核表达载体.主要观察指标:血红素加氧酶1基因的克隆和DNA测序结果证实序列是否正确;PIRES2.EGFP/血红素加氧酶1真核表达载体的构建以及测序证实目的基因成功插入载体.结果;①实验完成了大鼠血红素加氧酶1基因的克隆,所获得的序列与GeneBank中收录的大鼠血红素加氧酶1序列完全一致.②构建真核表达载体PIRES2-EGFP/血红素加氧酶1,测序正确说明血红素加氧酶1基因成功插入表达载体PIRES2-EGFP中.结论:实验成功克隆了大鼠血红素加氧酶1基因全长,并构建了其真核表达载体.     

人白细胞介素—3cDNA5‘端的修饰及其在大肠杆菌中的高效表达

人白细胞介素－３是一种作用于早期造血干细胞的重要调节因子。为了实现ＩＬ－３魇核细胞中的高效表达，设计合成了一对ＰＣＲ引物，采用ＰＣＲ方法对ｈＩＬ－３ｃＤＮＡ５端进行插入和定点修饰，在不改变编码氨基酸的前提下，提高Ａ和Ｔ的含量，并昼采用大肠杆菌使用频率高的密友子。以期提高Ｎ末端起始区的翻译效率。ＰＣＲ产物经酶切后定向克隆入ｐＧＥＭ５Ｚｆ质粒。     

急性白血病患者白血病细胞TRF1和Tankyrase 1 mRNA表达的研究

一些端粒结合蛋白在调节端粒长度和功能方面起着重要作用。TRF1是端粒长度的负调节因子，与肿瘤的发生、发展有密切关系。为此，我们建立了定量实时RT-PCR法，对急性白血病患者的白血病细胞TRF1、Tankyrase 1 (TRF1-interacting ankyrin-related ADP-ribose polymerase 1)及c-myc基因mRNA表达进行了研究。     

人ICA69基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达与应用初探

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达国人胰岛细胞自身抗原69kd蛋白（hICA69)，获得足量的、可供实验研究的ICA69抗原，用于I型糖尿病的早期诊断和联合筛查。方法：用PCR法扩增出编码hICA69的cDNA片段，直接克降到pSPORT1质粒上，经DNA序列测定后，再插入到GST融合蛋白表达载体pGEX-2T的EcoRI和SmaI位点之间，构成重组质粒p25-hICA69,将此质粒导入大肠杆菌，经IPIG诱导后获得GST-hICA69融合蛋白的表达产物，用间接ELISA法检测100例正常人和30例I型糖尿病人血清中抗ICA69抗体。结果：所获PCR产物经序列分析确证为1449bp，编码483个氨基酸，并正确地重组到pGEX-2T表达型质粒中，其在原核细胞中表达的融合蛋白具有免疫原性，并能应用于I型糖尿病病人血清中抗ICA69抗体的检测。结论：运用基因工程技术获得的表达产物的重组ICA69抗原。这一抗原的获得，将有助于提高I型糖尿病的预报率和确诊率。     

人Ⅱ型丙氨酸氨基转移酶表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的　构建基因工程菌株 ,以获得重组人II型丙氨酸氨基转移酶 (ALT2 )蛋白。方法　逆转录PCR法从人肌肉组织总RNA中扩增ALT2基因片段 ,插入原核表达载体pET - 2 8a ,构建成融合表达质粒pET2 8 ALT2 ,将其转化大肠杆菌BL2 1DE3,IPTG诱导表达。SDS PAGE、活力测定、活性染色及westernblot鉴定表达产物。结果　重组质粒pET2 8 ALT2测序和酶切结果与预期完全符合。IPTG诱导后 ,阳性菌体裂解物上清ALT2活性很高 ,PAGE出现一分子量 5 80 0 0蛋白条带 ,可被抗ALT1抗血清识别 ,酶活性染色显示有ALT活性。结论　已成功将ALT2基因克隆到pET 2 8a载体 ,ALT2蛋白得到可溶性高效表达。     

人Smith D1抗原在原核细胞中的表达与纯化及临床应用

目的获得人Smith D1（Sm D1）抗原基因，并进行原核表达及建立斑点免疫金渗虑（dot immunogold filtration assay，DIGFA）检测方法。方法采用基因工程技术，通过PCR从人白血病HL-60细胞cDNA文库中扩增人Sm D1抗原基因，构建pGEX-5T-Sm D1重组表达载体，在大肠杆菌B1221中通过异丙基硫代半乳糖苷酶（IPTG）诱导表达Sm D1蛋白。利用初步纯化的Sm D1抗原建立DIGFA。结果重组质粒测序和酶切结果显示Sm D1抗原基因正确插入pGEX-5T，重组蛋白、复性及纯化产物经12％十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），在相对分子质量为39000处有一明显的蛋白表达条带，免疫印迹法分析表明，重组蛋白具有人Sm D1抗原的抗原性。DIGFA与色疫印迹法检测结果的差异无统计学意义（P〉0．05），二者的符合率为91．7％。DIGFA敏感度为100％，特异度为83．3％结论通过基因工程技术制备获得初步纯化的谷胱苷肽转移酶（GST）-Sm D1融合蛋白，用该抗原建立的DIGFA与免疫印迹法相似，且具有快速、简便和可靠等优点。     

人CyclinD1在毕赤酵母中的表达

目的 克隆人肝癌组织中的Cyclin D1基因,并在毕赤酵母中表达Cyclin D1蛋白。方法 从人肝癌组织中提取RNA,逆转录PCR扩增获得Cyclin D1 cDNA,将PCR产物进行TA克隆和DNA序列分析; 阳性TA克隆Cyclin D1片段再亚克隆入毕赤酵母表达载体Ppic9k,甲醇诱导表达。结果 逆转录PCR扩增得到约483 bp的DNA片段,TA克隆和DNA序列分析结果显示重组片段为人的CyclinD1基因,Cyclin D1 cDNA亚克隆入Ppic9k载体的NotI和EcoRI位点之间; 甲醇诱导得到分子量约36KD的蛋白。结论 成功克隆人肝癌组织中的Cyclin D1基因,并且在毕赤酵母中成功表达。