白血病患者WT1基因的表达及其临床意义

目的：探讨ＷＴ１基因在白血病细胞中的表达及其临床意义。方法：应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法测定Ｋ５６２、ＨＬ－６０、ＴＦ－１及Ｕ９３７四株白血病细胞系，４５例白血病患者，１５名正常人外周血及１０例非血液病患者正常骨髓细胞ＷＴ１基因的表达。结果：Ｋ５６２、ＨＬ－６０及ＴＦ－１三株白血病细胞系均高度表达ＷＴ１，而Ｕ９３７细胞系未测到ＷＴ１。急性髓系白血病（ＡＭＬ）２５例中２１例、急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）１１例中８例、慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）急性变者２例、慢性及加速期ＣＭＬ患者７例中１例ＷＴ１表达阳性。１５名正常人外周血及１０例非血液病患者正常骨髓细胞ＷＴ１基因表达阴性。结论：ＷＴ１基因在大多数急性白血病中表达，与白血病的病程发展可能有关，可作为检测白血病微量残留病的特异性标记。     

急性白血病患者WT1基因的表达及其与预后的关系

WT1基因是对遗传性肾胚胎肿瘤( Wilm s tumor)的分子遗传学进行研究时而发现的 ,研究表明 11p13的基因缺失与 Wilms肿瘤相关。1990年 Call等克隆了此相关基因的 c DNA并命名为Wilms瘤基因 1( WT1)〔1〕。WT1基因已被认为在肿瘤的发生中起一定的作用。近年的研究集中于 WT1基因在白血病发病中的意义 ,但其在急性白血病 ( AL)预后方面的作用研究尚不多见。我们就此进行探讨 ,报告如下。1　对象和方法1.1　研究对象 :患者组选择 1999年9月— 2 0 0 2年 7月收治的住院及门诊AL 者 ,79例中男 34例 ,女 45例 ;年龄4～ 6 9岁 ,平均 37.78岁…     

急性白血病患者多药耐药相关蛋白基因表达及临床意义

目的：研究急性白血病（ＡＬ）多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）基因表达与临床耐药的关系。方法：应用半定量逆转录－聚合酶链反应，检测了６５例ＡＬ患者骨髓和１５名正常人外周血单个核细胞中ＭＲＰ基因的表达。以ＭＲＰ／β２微球蛋白（β２Ｍ）评价ＭＲＰ的表达水平，将ＭＲＰ／β２Ｍ≥０．３表示为ＭＲＰ阳性。结果：复发难治组ＭＲＰ的平均表达水平及阳性率最高，与正常对照组、初治组、长期生存组的ＭＲＰ平均表达水平及阳性率相比均有显著差异（Ｐ＜０．０５），而长期生存组与正常对照组之间无统计学差异。初治组ＭＲＰ阳性病例与ＭＲＰ阴性病例的首次完全缓解率（分别为２５％和８４％）之间有显著差异。ＭＲＰ表达水平在ＦＡＢ各亚型间略有差异。同时检测了６５例ＡＬ患者ｍｄｒ－１基因的表达，发现临床耐药组ＭＲＰ和ｍｄｒ－１的平均表达水平及阳性率均明显高于临床非耐药组，ＭＲＰ和ｍｄｒ－１基因的表达水平之间无相关性（ｒｓ＝０．１６８３）。结论：ＭＲＰ基因过度表达可导致临床耐药，是预后的重要不利因素。     

WT1基因与白血病研究现状

ＷＴ１是Ｗｉｌｍｓ’瘤抑癌基因，在人类白血病细胞中表达水平很高，对其生长分化有重要作用。本文综述了ＷＴ１基因的结构，功能以及与白血病的关系。     

实时定量RT-PCR检测急性白血病患者骨髓细胞WT1基因表达

目的探讨急性白血病 (AL)患者骨髓细胞WT1基因表达水平。方法建立实时定量RT PCR方法 ,检测了 10 8例AL患者和 2 3例非白血病患者骨髓细胞WT1基因及内参照 β 胆色原脱氢酶 (GAPDH)基因的表达水平。结果初诊与复发AL患者骨髓细胞WT1基因中位表达水平经GAPDH校正后分别为 75 .10和 89.5 6 ,明显高于完全缓解组和对照组 (分别为 2 .0 7和 1.5 1) ,对照组与完全缓解组之间及初诊与复发组之间无统计学差异 ;70例初诊AL中急性淋巴细胞白血病、M1、M2 、M3 亚型WT1基因表达水平明显高于M5,即粒系表达明显高于单核系 ,且WT1基因表达水平与白细胞计数、骨髓原始细胞比例、mdr1基因表达无相关性 ,但与染色体核型有关。对其中 2例患者动态检测WT1基因表达可提示白血病复发情况。结论WT1基因在AL患者骨髓细胞高表达 ,可作为白血病疗效评价及监测残留病灶的指标。     

白血病患者WT1基因表达的研究

目的：探讨WT1基因与白血病发病的关系和临床意义。方法：采用逆转录－巢式聚合酶链反应（RT－巢式PCR）方法检测了K562和HL－60两个白血病细胞系、49例急性白血病（AL）患者、33例慢性髓系白血病（CML）患者和25例正常对照的WT1基因表达。结果：K562和HL－60两个白血病细胞系、29例初治或复发AL患者中有21例、20例完全缓解（CR）期AL中有1例、18例CML急变期中有15例、5例CML加速期中有1例、10例CML慢性期患者中有1例表达WT1基因。WT1基因表达见于所有AL亚型，其相对水平与急性白血病的CR率有相关性。≥1．0的患者CR率低及生存期短。在CML中WT1基因表达表现出明显的阶段性，与慢性粒细胞白血病临床阶段及病情进展有关。结论：WT1基因表达与白血病发生有关，WT1基因高表达的患者CR率低、无病生存期短，可作为判断急性白血病预后和监测微量残留病的一项指标，也可作为CML急变的一项诊断指标。     

WT1、NKD1基因在急性髓系白血病中的表达及其与预后的关系

目的 探讨Wilms(WT1)基因、裸角质膜同源蛋白(NKD1)基因在急性髓系白血病中的表达及其与预后的关系.方法 将2018年2月至2019年6月该院收治的100例急性髓系白血病患者纳入研究作为观察组,选取同期于该院治疗的造血系统非恶性肿瘤(缺铁性贫血)患者100例作为对照组.纳入研究者均进行WT1、NKD1基因检测...     

急性白血病患者肺耐药蛋白基因表达及其临床意义

目的 探讨急性白血病（ＡＬ）患者肺耐药蛋白（ＬＲＰ）基因表达临床耐药的关系。方法 应用产定量逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,并以β２微球蛋白（β２ＭＧ）作内对照,检测了６１例ＡＬ患者及１５名正常对照者ＬＲＰ基因的表达,奖ＬＲＰ／β２ＭＧ≥０．３定为ＬＲＰ阳性。结果 初治组ＬＲＰ的阳性率为３２．４％,ＬＲＰ阳性与ＬＲＰ阴性患者的首次完全缓解（ＣＲ１）率分别为３３．３％和８４．０％,两者的差异有     

GATA-2在白血病患者中的表达及其意义

目的 探讨白血病患者GATA－2基因的表达及其临床意义。方法 应用RT－PCR对各类白血病患者GATA－2的表达进行检测,慢性粒细胞白血病（CML）和急性早幼粒细胞白血病（APL）同时检测bcr/abl和PML／RARα的表达。结果 初治／复发的急性髓系白血病（AML）和急性淋巴细胞白血病（ALL）GATA－2的阳性率分别为93％和70％,慢性粒细胞白血病慢性期（CML－CP）为83％。正常人骨髓和外周血未检测到GATA－2。缓解期AML患者GATA－2的表达与初治／复发AML相比,差异无显著性;移植治疗后患者GATA－2的表达率显著下降;移植治疗后的CML患者在bcr/abl转阴后仍可检出GATA－2,而移植治疗后APL患者PML／RARα和GATA－2都为阴性。结论 GATA－2基因转录产物在正常人骨髓和外周血中低表达,在各类白血病中高表达。缓解期骨髓中仍有GATA－2的高表达,移植治疗后GATA－2表达显著下降。GATA－2高表达反映了患者体内残存的白血病干细胞,自体或异基因骨髓移植可以更好地清除白血病干细胞。     

多重实时荧光定量PCR同时检测急性白血病患者WT1和MDR1基因表达水平方法的建立

目的 构建可同时检测AL患者WT1和MDR1基因表达水平的多重实时荧光定量PCR方法.方法 提取K562细胞的总RNA,并逆转录扩增WT1和MDR1的cDNA,通过Bam H Ⅰ及BglⅡ酶切后连接成WT1和MDR1重组片段,对WT1和MDR1重组片段进行PCR扩增,PCR产物纯化后与pMD18载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,构建载有WT1和MDR1基因的标准品重组质粒,用限制性核酸内切酶法和PCR法鉴定质粒.用FAM荧光标记MDR1探针、VIC荧光标记WT1探针,建立能在1个试管中同时检测WT1和MDR1基因表达水平的多重实时荧光定量PCR反应体系.应用该体系检测47例AL患者及32例对照者WT1和MDR1基因表达水平,比较两组之间WT1和MDR1基因表达水平的差异,并随访7例AL患者不同病程中WT1和MDR1基因表达水平的变化与临床预后的关系.结果 经EcoR1酶切及PCR法证实WT1和MDR1基因重组质粒已成功构建.所建立多重实时荧光定量PCR方法的灵敏度为102拷贝/μl;所建立标准曲线的R2分别为0.999和0.998.AL患者WT1和MDR1基因的表达水平中位数分别为37 000(163～6 370 000)拷贝/μg RNA和76 200(179～18 000 000)拷贝/μg RNA,显著高于对照组的258(0～643)拷贝/μg RNA和333(0～779)拷贝/μg RNA,差异有统计学意义(Z=6.755、6.736,P＜0.01).对应用相同的诱导和巩固化疗方案治疗的7例AL患者进行随访,3例持续缓解患者中,WT1和MDR1的表达水平在初治时分别为2 170和86 900、1 130和5 860、1 170和586拷贝/μg RNA,治疗后WT1和MDR1的表达水平明显下降,分别为370和560、138和980、150和690拷贝/μg RNA,此3例患者获长期完全缓解.在3例完全缓解后复发患者中,WT1和MDR1表达水平在初治时分别为1 600和11800、24 800和968、48 200和1 100 000拷贝/μg RNA,在化疗获得完全缓解后均降低,但在随后治疗过程中,WT1、MDR1表达量又逐渐升高,分别为20 314和25 660、184 364和31 530、15 680和878 000拷贝/μg RNA,此3例患者最终均出现临床复发.另外1例未缓解患者初治时WT1和MDR1表达水平分别为81 600和1 200 000拷贝/μg RNA,化疗后WT1、MDR1表达水平不仅未下降,反而有所上升,分别为124 100和7 632 400拷贝/μg RNA,此例患者始终未获缓解.结论 本研究成功构建了可同时检测WT1和MDR1基因表达水平的多重实时荧光定量PCR方法.同时检测AL患者WT1和MDR1基因表达水平的变化可能有助于判断预后.

Abstract：

Objective To set up a multiplex real time quantitative PCR method to detect the expression of WT1 and MDR1 gene simultaneously in acute leukemia patient. Methods Total RNA was extracted from k562 cell line and was reverse transcribed to cDNA by the outer primers of WT1 and MDR1 respectively. The cDNA of WT1 and MDR1 were purified and digested by Bam H Ⅰ and Bgl Ⅱ , and then the two fragments were ligated to form the recombinant fragment WT1 + MDR1. The outer forward primer of WT1 and outer reverse primer of MDR1 were used to amplify the recombinant fragment WT1 + MDR1. The PCR product was purified and cloned into pMD18-T vector, and then transferred into E. coli DH-5α. A new kind of WT1-MDRl-contained standard plasmid was obtained from the positive colony. The recombinant plasmid was verified by digestion with restriction enzyme and PCR amplification. A multiplex real time quantitative PCR method was set up with FAM-labeled MDR1 probe and VIC-labeled WT1 probe in one reaction tube. The WT1 and MDR1 gene expression was detected in forty-seven AL patients and thirty-two controls by this method. Seven patients were followed-up to elucidate the relationship between the gene expression levels and clinical prognosis. Results The recombinant plasmid was confirmed by EcoR1 digestion and PCR amplification. The multiplex real time quantitative PCR technique could reach the sensitivity of WT1 and MDR1 gene up to 102 copy/μl. The standard curve slopes were 0. 999 and 0. 998. The WT1 [ 37 000( 163-6 370 000 )copies/μg RNA ] and MDR1 [ 76 200( 179-18 000 000 )copies/μg RNA ]expression levels of AL patients were significantly higher as compared to the controls [ 258( 0-643 ) copies/μg RNA and 333( 0-779 )copies/μg RNA ]( Z= 6. 755,6. 736, P ＜ 0. 01 ). Following up seven patients with similar regimen of chemotherapy, the WT1 and MDR1 expression correlated to the clinical course. Three AL patients with WT1 and MDR1 expression levels (2 170 and 86 900, 1 130 and 5 860, 1 170 and 586 copies/μg RNA )significantly decreased after chemotherapy and kept in the low range ( 370 and 560,138 and 980, 150 and 690 copies/μg RNA ), and had a favorable outcome. Three AL patients with WT1 and MDR1 expression levels ( 1 600 and 11 800, 24 800 and 968, 48 200 and 1 100 000 copies/μg RNA )decreased after initial chemotherapy, but increased significantly afterwards (20 314 and 25 660,184 364 and 31 530, 15 680 and 878 000 copies/μg RNA ),and suffered clinical relapse. One patient with high WT1 and MDR1 expression levels ( from 81 600 and 1 200 000 copies/μg RNA to 124 100 and 7 632 400 copies/μg RNA )showed the persistence of disease. Conclusions A multiplex real time quantitative PCR method to detect WT1 and MDR1 gene simultaneously is constructed successfully. The expression of WT1 and MDR1 may provide useful information for AL patients prognosis.     

荧光定量PCR检测急性髓细胞白血病患者BAALC基因及临床意义

目的研究急性髓细胞白血病（AML）患者BAALC（brain and acute leukemia cytoplasmic）基因的表达水平及其临床意义。方法构建实时定量PCR检测BAALC基因表达的技术，并定量检测63例初治AML患者BAALC基因的表达水平及分析其与临床疗效的关系。结果建立的实时定量PCR方法的标准曲线相关系数大于0．99。49例（78％）初治AML患者存在BAALC基因表达；BAALC基因高表达患者发病时外周血WBC计数、Hb浓度、PLT计数及骨髓白血病细胞比例分别为：（26．3±18．1）×10^9／L、（78．3±21．8）g／L、（76．9±64．5）×10^9／L和（61．2±22．3）％，低表达患者发病时外周血WBC计数、Hb浓度、PLT计数及骨髓自血病细胞比例分别为：（30．2±21．7）×10^9／L、（81．6±30．9）g／L、（73．9±57．2）×10^9／L和（54．3±16．3）％，两组间差异无统计学意义（P〉0．05）；正常核型初治AML患者中BAALC高表达率为68％（25／37），高于非正常核型AML患者[23％（6／26）]，差异有统计学意义（Х^2=12．093，P=0．001）；正常核型初治AML患者中BAALC基因高表达患者化疗的完全缓解率（CR）为65％（20／31），低于低表达患者[84％（27／32）]，差异有统计学意义（Х^2=6．573，P=0．013）。结论BAALC基因高表达是正常核型AML患者一个重要不良预后因素。     

急性白血病患者周期蛋白D1mRNA表达及其临床意义

目的　检测急性白血病患者周期蛋白 (cyclin)D1mRNA的表达 ,并探讨其与临床的关系。方法　采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测 6 5例急性白血病患者及 5名正常人骨髓细胞cyclinD1mRNA。结果　正常骨髓未检测到cyclinD1mRNA表达 ;急性白血病患者阳性率 2 6 2 % ,急性淋巴细胞白血病与急性非淋巴细胞白血病之间差异无显著性 ;复发组患者的cyclinD1mRNA阳性率 (6 3 6 % )明显高于初治组 (2 1 4% )及缓解组 (8 3% )。结论　急性白血病患者中有cyclinD1mRNA过度表达的情况 ,且与临床复发关系较为密切。     

肺耐药蛋白基因在急性白血病中的表达及临床意义

目的　检测急性白血病患者肺耐药蛋白 (Lungresistanceprotein ,LRP)基因mRNA表达 ,探讨其与多药耐药和预后的关系。方法　采用半定量逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测 47例急性白血病患者及 7例正常对照骨髓细胞LRP基因的表达。结果　正常骨髓细胞LRP基因表达阴性 ,2 5例初治急性髓细胞白血病 (AML)患者中 1 7例LRP基因表达阳性 ,1 2例初治急性淋巴细胞白血病 (ALL)中仅 1例阳性 ,1 0例复发难治患者 8例阳性 ,初治AML组及复发难治组较正常对照组相比表达率明显升高 ,差异有显著性 (P =0 .0 0 1 ) ,LRPmRNA表达水平与初次化疗不敏感及预后差有关 ,LRPmRNA阳性患者的完全缓解率明显低于表达阴性者 (分别为 3/1 1 ,4/5 ,P <0 .0 5)。结论　LRP基因表达水平与急性髓细胞白血病化疗效果及预后密切相关 ,是一项新的耐药指标 ,检测LRP的表达可以指导治疗 ,估计预后