慢病毒载体介导的基因转导技术对人脐血CD34+细胞基因表达谱的影响

目的 研究慢病毒载体(lentivirus vector)基凶转导技术对脐血CD34+细胞基因表达的影响.方法 将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的第三代自身失活(self-inactivating,SIN)慢病毒载体导入CD34+细胞,提取被病毒感染细胞的总RNA,应用cDNA微阵列技术对慢病毒载体感染的脐血CD34+细胞及正常对照细胞进行差异基因表达谱分析.结果 在23000个被检测基因中,与无基因导人的对照组细胞比较,基因导入细胞中表达的上调基因共2个,分别为IGSF4和HEC基因,下调基因共6个,分别为HNRPAO、ZNF205、FLNA、CLK3、LDB1、ACTA1.进一步对筛选出的差异表达基因进行半定量RT-PCR分析证实基因表达水平变化不明显.结论 本实验中应用的慢病毒载体对脐血CD34+细胞基凶表达无明显影响,有望成为临床基因治疗有效且安全的工具.     

双耐药基因导人脐血干/祖细胞降低联合化疗骨髓毒性作用的临床前研究

目的探讨转染醛脱氢酶基因(ALDH3)和多药耐药基因(mdr-1)的人脐血CD     

人脐血造血干,祖细胞体外培养的实验研究

采用体外细胞培养的方法，检测了脐血、骨髓、外周血ＣＦＵ－ＧＭ，ＢＦＵ－Ｅ。结果表明脐血中ＣＦＵ－ＧＭ，ＢＦＵ－Ｅ数量高于成人外周血，同骨髓相比，ＣＦＵ－ＧＭ数量无显著差异，ＢＦＵ－Ｅ低于骨髓。同时观察到脐血中ＣＦＵ－ＧＭ大集落比例明显高于骨髓；ＣＦＵ－ＧＭ集落产率时间曲线较骨髓延迟３～４天；Ｓ期ＧＭ－ＣＦＣ所占比例明显低于骨髓，可能提示脐血造血细胞中早期造血细胞比例高于骨髓。实验中还发现脐血红系集落生长同骨髓十分相似，二者均含ＣＦＵ－Ｅ和ＢＦＵＥ集落，而外周血中只含ＢＦＵ－Ｅ集落。我们统计了２７份脐血血量及所含有核细胞数。根据骨髓移植的有核细胞数标准（２×１０￣８／ｋｇ），一份脐血的有核细胞数很难达到此要求，但已达到目前国外小儿异体脐血移植成功病例的有核细胞数值。     

圹增人脐血造血干／祖细胞重建SCID小鼠造血的实验研究

目的 探讨Ｆｌｔ－３配基（ＦＬ）、Ｔｐｏ、ＳＣＦ等细胞因子组合对人脐血干／祖细胞的扩增及自我更新能力的维持作用。方法 用ＦＬ＋Ｔｐｏ＋ＳＣＦ－ＩＬ－６＋ＩＬ－３＋Ｇ－ＣＳＦ组合,体外扩增脐血ＣＤ３４＾＋细胞１４天,将其移植给亚致死剂量照射的ＳＣＩＤ小鼠。结果 扩增的脐血造血细胞可顺利植入ＳＣＩＤ小鼠并重建造血,１８只小鼠移植后存活６周的有８只,其骨髓中仍可检测到人的造血细胞,死亡率５６％,与对照组     

不同细胞因子组合对体外培养人脐带血造血干细胞的扩增效果

目的:观察细胞因子对培养的人脐带血造血干细胞的扩增效果,寻求体外最佳细胞因子组合。方法:实验于2002-06/2004-04在承德医学院基础研究所及承德医学院附属医院中心实验室完成。①以足月顺产健康新生儿的脐带血(由承德医学院附属医院妇产科提供,新生儿家属均签署实验知情同意书)作为实验标本。无菌条件下平均采血量30～60mL,梯度离心分离脐带血单个核细胞。②细胞体外扩增DMEM培养体系(含体积分数0.2的胎牛血清)为0.25μg/L干细胞因子,0.25μg/L白细胞介素3,0.5μg/L白细胞介素6,0.25μg/L粒-巨噬细胞集落刺激因子,0.8μg/L粒细胞集落刺激因子,0.05μg/L血小板生成素,0.8μg/LFLt-3配基。此7种细胞因子及剂量按不同组合分为6组:干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6组、干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 粒-巨噬细胞集落刺激因子组、干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 粒细胞集落刺激因子组、干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 粒-巨噬细胞集落刺激因子 粒细胞集落刺激因子组、干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 血小板生成素 FLt-3配基组、干细胞因子 血小板生成素 FLt-3配基组。各组单个核细胞终浓度为1×108个L-1。③培养第7,14,21天进行细胞形态学观察;培养第0,5,10,14,18,21天观察不同细胞因子组合对脐带血干细胞扩增的效果;应用流式细胞仪对培养前后细胞表面标志CD34 进行检测。结果:①脐带血干细胞形态学观察结果:体外培养第14天,细胞胞体小,胞浆量少,胞核体积大,多不规则,为早期造血干细胞。②细胞体外扩增培养情况:应用干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 血小板生成素 FLt-3配基这一细胞因子组合,脐带血干细胞可保持>98%的细胞存活率;培养第7天出现典型早期造血干细胞,第21天细胞总数达到高峰(F=60.228,P<0.01)。③细胞表面标志CD34 的动态变化:干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 血小板生成素 FLt-3配基这一细胞因子组合为生长刺激剂,应用后体外培养的造血干细胞于第14天达高峰,与培养前比较差异有显著性意义(F=20.782,P均<0.01),之后逐渐下降。结论:应用干细胞因子 白细胞介素3 白细胞介素6 血小板生成素 FLt-3配基细胞因子组合可长期维持脐带血干细胞的体外生长,且体外培养第14天是临床移植的最佳时机。     

双耐药基因导入脐血干／祖细胞降低联合化疗骨髓毒性作用的临床前研究

目的　探讨转染醛脱氢酶基因 (ALDH3)和多药耐药基因 (mdr 1)的人脐血CD3 4 细胞能否同时增强对活性环磷酰胺 (4 HC)和mdr 1基因靶药的抗性。方法　构建含ALDH3和mdr 1双耐药基因的逆转录病毒表达质粒G1Na ALDH3 IRES MDR1,经LipofectAMINE介导转染包装细胞 ,采用含 4 HC和长春新碱 (VCR)的培养基克隆选择后收集重组病毒上清于单向型GP E86与双嗜型PA317包装细胞行乒乓交互感染 ,将含ALDH3和mdr 1双耐药基因重组病毒的上清在细胞生长因子刺激下重复感染经免疫磁珠分离系统 (MACS)纯化后的人脐血CD3 4 细胞 ,用PCR、RT PCR、Southernblot、Northernblot、FACS和MTT等方法检测外源ALDH3与mdr 1基因在CD3 4 细胞中的转移和表达。结果　MACS分离纯化后的人脐血CD3 4 细胞纯度平均达 91% ,回收率为 72 % ,含双耐药基因重组病毒的上清最高滴度为 6 .5× 10 5CFU/ml,应用集落计数、PCR和FACS方法测定基因转导效率分别为 18.0 %、2 0 .0 %和16 7% ,未检测到辅助病毒存在 ,有P170功能的细胞占 16 0 % ,经双耐药基因修饰的脐血CD3 4 细胞对 4 HC的IC50 较对照组提高 3.5倍 ,对VCR和柔红霉素的IC50 较未转染细胞分别高 6 .8和 5 .5倍。结论　逆转录病毒载体介导双耐药基因转导脐血造血干 /祖细胞获高效共表     

扩增人脐血造血干/祖细胞重建SCID小鼠造血的实验研究

目的　探讨Ｆｌｔ３ 配基（ＦＬ） 、Ｔｐｏ、ＳＣＦ等细胞因子组合对人脐血干／ 祖细胞的扩增及自我更新能力的维持作用。方法　用ＦＬ＋ Ｔｐｏ＋ ＳＣＦ＋ＩＬ６ ＋ＩＬ３＋ ＧＣＳＦ组合,体外扩增脐血ＣＤ３４ ＋ 细胞１４天,将其移植给亚致死剂量照射的ＳＣＩＤ小鼠。结果　扩增的脐血造血细胞可顺利植入ＳＣＩＤ小鼠并重建造血,１８ 只小鼠移植后存活６ 周的有８ 只,其骨髓中仍可检测到人的造血细胞,死亡率５６ ％ ,与对照组（ 死亡率１００％） 比较,χ２ ＝１０．０８,Ｐ＜０．０１。结论　ＦＬ＋ Ｔｐｏ＋ ＳＣＦ＋ＩＬ６ ＋ＩＬ３ ＋ ＧＣＳＦ组合在有效扩增造血细胞的同时可保留造血干／祖细胞的自我更新及造血重建能力。     

提高脐血造血干细胞移植归巢的研究进展

脐血造血干细胞(hematopoietic stemcell,HSC)移植成为目前造血干细胞移植(HSC transplantation,HSCT)的主要形式之一。与其他来源的移植用干细胞相比,脐血HSC具有以下的优势:起效时间快;受Ⅰ或Ⅱ型人白细胞抗原(HLA)错配导致的供体细胞扩增减少的影响小;免疫原性低;移植     

体内转染人突变DHFR原小鼠骨髓对致死量照射小鼠造血重建和 …

目的 将转染了人突变ＤＨＦＲ基因的小鼠骨髓移植给经致死剂量照射的小鼠,观察棋 对受者造血功能的重建和保护作用。方法 分离转染人突变ＤＨＦＲ基因小鼠骨髓有核细胞,移植给经致死剂量照射的同系小鼠,以甲氨蝶呤（ＭＴＸ）筛选．观察受体小鼠血象、生存率和ＣＦＵ－ＧＭ的改变,并用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交分析外源基因在小鼠染色体ＤＮＡ中的整合与表达情况。对照组以正常同系小鼠为供体。结果 在大剂量ＭＴＸ筛     

耐药基因转染保护骨髓造血干细胞

化疗是当今肿瘤治疗的主要手段之一。化疗药物的应用可产生许多近期和远期的毒性反应。实验研究表明，化疗耐药基因转移可保护骨髓干细胞免受化疗药物的损害和预防化疗相关性肿瘤的发生。     

脐血间充质干细胞的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血间充质干细胞(MSC)的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法用液体培养法分离脐血贴壁细胞,采用ELISA方法检测贴壁细胞条件培养液中细胞因子的表达;用流式细胞术分析其免疫表型特征;在成软骨细胞诱导培养条件下诱导细胞分化,并用RTPCR方法检测分化后细胞原胶原Ⅱ型基因的表达。采用分阶段共培养方法观察脐血贴壁细胞对CD34+细胞体外扩增的支持作用。结果脐血单个核细胞纤维样细胞集落形成率为(3.5±0.7)/106。脐血MSC体外至少可以扩增15代。没有分化的脐血MSC表型为CD13、CD29、CD90、CD105、CD166、SH2、SH3和SH4阳性,CD45、CD34和CD14阴性;脐血MSC培养上清中干细胞因子、IL6和肿瘤坏死因子α检测阳性。在成软骨细胞诱导培养基培养条件下,脐血MSC原胶原Ⅱ型基因mRNA表达阳性。脐血MSC与CD34+细胞共掊养14d,CD34+细胞扩增率高于未共培养组4倍。结论脐血MSC具有类似于成体骨髓MSC的特征,对造血干细胞增殖有明显的支持作用。     

人脐血CD34+CD38-细胞免疫表型和染色体核型特征分析

目的 分离脐血干／祖细胞(CD34^ CD38)进行体外长期培养，观察分析其增殖、细胞表面分子标志和染色体核型的特征。方法 用流式细胞仪分选CD34-FITC和CD38-PE标记的CD34^ CD38脐血原始细胞，在含细胞生长因子IL-3、IL-6、GM-CSF、EPO、SCF和胰岛素样生长因子的干细胞培养基中培养6个月，用流式细胞术检测体外培养30d的干／祖细胞表面标记，并用G显带方法分析其染色体核型。结果 在一定培养条件下，经7～12d培养，脐血干／祖细胞(CD34^ CD38)开始增殖。培养6个月后，每孔接种1个细胞，细胞数增殖至250～350个；每孔接种10个细胞，细胞数可增殖至400～500个。每孔接种1个细胞其细胞增殖峰持续时间(8～9代)比接种10个细胞(6～7代)长：经体外长期培养增殖，细胞仍强烈显示十／祖细胞表面分子标记(CD34^ CD38^-)；细胞染色体数目、结构未见异常。结论 脐血干／祖细胞(CD34^ CD38^ )经体外特异性培养增殖，可为大量脐血干／祖细胞移植提供细胞来源。     

两步法从脐血CD34+细胞获得大量树突细胞的初步研究

目的　探索利用先扩增后诱导的“两步法”从脐血 (CB)CD34 细胞高效大量地获得树突细胞 (DC)。方法　免疫磁珠法从CB分选获得CD34 细胞 ,以干细胞因子 (SCF)、IL 3、Flt 3配体 (FL)、Tpo组合刺激 ,扩增 7d、10d和 14d(依次为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组 )后以GM CSF IL 4 TNF α诱导 8d或 5d获得DC ,通过相差显微镜、电镜观察形态 ,流式细胞仪检测表型 ,混合淋巴细胞培养、ELISA法检测培养液上清IL 12含量评价其功能。结果　CBCD34 细胞经SCF IL 3 FL Tpo刺激扩增 7d、10d和 14d后细胞总数分别扩增了 (5 3.39± 2 0 .5 9)倍、(30 7.17± 119.5 9)倍和 (1117.2 5± 335 .4 9)倍。经GM CSF IL 4 TNF α诱导 8d后所得CD1a 细胞是扩增前细胞数的 (2 1.4 0± 16 .70 )倍、(14 3.2 0± 6 0 .35 )倍和(15 0 .80± 4 2 .16 )倍 ,Ⅱ、Ⅲ组明显多于Ⅰ组 (P <0 .0 5 ) ,但Ⅱ、Ⅲ组间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。所得DC的形态、表型及刺激异基因T细胞增殖能力、IL 12分泌量 ,三组无显著性差异 (P >0 .0 5 )。当诱导时间缩短至 5d时 ,各组DC功能均显著下降 (P <0 .0 5 )。结论　CBCD34 细胞扩增 7～ 10d再诱导 8d可以高效大量获得具有正常功能的DC ,而扩增时间超过 10d并不能显著增加DC产量 ,诱导时间少于8d将降低所得DC     

间充质干细胞对脐血CD34+细胞体外扩增和黏附分子表达的影响

目的研究间充质干细胞(MSC)对脐血CD34+细胞体外扩增能力和黏附分子表达的影响.方法从正常人骨髓中分离扩增MSC,通过免疫表型和向成骨细胞及脂肪细胞分化能力对其鉴定;将脐血CD34+细胞接种到MSC或其他培养液中,比较不同培养条件对造血细胞扩增能力、集落形成能力及黏附分子表达的影响.结果MSC表达Thy-1、SH2、SB10、CD44、CD13、CD49e和CD29,不表达CD34、CD45、HLA-DR、CD14和CD31,经过诱导可以向成骨细胞和脂肪细胞分化;实验组在MSC和细胞因子作用下,扩增8 d后有核细胞、CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD62L+细胞和CFU-Cs分别扩增145.57±17.89,37.47±13.78,69.78±50.07,10.74±5.89和20.73±5.54倍,均显著高于对照组;扩增后CD34+细胞的ALCAM、VLA-α4、VLA-α5、VLA-β1、HCAM、PECAM和LFA-1表达较扩增前无明显变化,虽然ICAM-1和L-选择素表达下降,但实验组CD34+CD62L+和CD34+CD54+细胞的绝对数显著增加.结论MSC可为造血干细胞体外扩增提供适宜的微环境,有助于抑制HSC分化并保持其造血重建潜能和归巢能力.     

非血缘脐血移植的展望

近年,非血缘脐血移植(UCBT)的广泛开展,为恶性及非恶性血液病患者的治疗提供了更多选择.本文将从脐血的选择、预处理方案、植入前综合征(PES)、植入失败和复发的处理等方面,对UCBT的最新进展及前景进行总结.     

mdr-1和DHFR双基因共转染人CD34+细胞拓宽造血细胞耐药谱的体外研究

目的　探讨将多药耐药基因 (mdr 1)和二氢叶酸还原酶基因 (DHFR)同时导入人CD3 4 细胞 ,以拓宽造血细胞耐药谱 ,改善骨髓耐受联合化疗的可行性。方法　将以造血细胞中高表达的逆转录病毒载体FMCF为基本结构骨架 ,通过引入IRES序列构建获得含mdr 1和DHFR(L2 2Y)双耐药基因的逆转录病毒载体pSF DIM ,通过脂质体介导包装 ,单嗜性和双嗜性包装细胞上清交叉感染提高病毒滴度。低温离心病毒上清转染人脐血CD3 4 细胞 ,用流式细胞仪检测P gp的表达 ,基因组PCR检测外源性耐药基因的整合 ,CFU GM培养观察耐药性变化。结果　逆转录病毒载体pSF DIM转导人脐血CD3 4 细胞后 ,P gp的表达较未转基因组增加了 10 .98% ;基因组PCR同时检测到两种外源性耐药基因的整合 ;与未转基因组比较 ,在 48nmol/L甲氨蝶呤和 10ng/ml及 12ng/ml紫杉醇 (商品名Taxol)浓度水平 ,CFU GM集落形成显著增加 (P <0 .0 5 )。结论　重组双耐药基因逆转录病毒载体pSF DIM可以有效介导mdr 1和DHFR双耐药基因进入人脐血CD3 4 细胞并且获得共表达 ,拓宽了造血细胞耐药谱     

脐带间充质干细胞对CD34+细胞在小鼠体内归巢的影响及其机制研究

目的 探讨脐带来源间充质干细胞(MSC)对脐血来源CD34+细胞在NOD/SCID小鼠体内归巢的影响及其可能的机制.方法 将CD34+细胞与MSC细胞共移植入经放射线照射后的NOD/SCID小鼠,采用流式细胞术和RT-PCR检测移植后20 h NOD/SCID小鼠骨髓及脾脏中人CD34+细胞,计算其相应的骨髓和脾脏的归巢效率.将脐血CD34+细胞与脐带MSC体外共培养,检测MSC细胞对CD34+细胞趋化功能的影响;并于培养4、7 d检测培养后CD34+细胞表面CD49e、CD31、CD62L、CD11a等归巢相关黏附分子表达情况.结果 ①移植后20 h采用流式细胞术成功在小鼠骨髓和脾脏中检测到人CD45+细胞.共移植组CD34+细胞骨髓归巢率[(7.2±1.1)%]高于单移植组[(5.4±0.9)%](P<0.05).②RT-PCR结果 显示共移植组小鼠骨髓细胞和脾脏细胞,单移植组小鼠脾脏细胞扩增得到人GAPDH基因片段,而单移植组小鼠骨髓细胞未见明显扩增条带.③MSC存在时,CD34+细胞的体外迁移能力为(35.7±5.8)%,显著高于CD34+细胞自发迁移率[(3.5±0.6)%,P<0.05].④CD34+细胞与MSC体外共培养后细胞表面CD49e、CD31和CD62L黏附分子的表达水平高于CD34+细胞单独培养组.结论 MSC细胞与CD34+细胞共移植有利于CD34+细胞向骨髓、脾脏等造血器官归巢,这可能与MSC促进CD34+细胞迁移以及维持CD34+细胞表面归巢相关黏附分子的表达相关.     

人脐血单个核细胞体外分化为神经细胞

目的　探讨核转录因子 (NF) κB配体受体激动因子 (receptoractivatorofNF KappaBligand ,RANKL)和脑源性神经营养因子 (brain derivedneurotrophicfactor,BDNF)体外诱导人脐血细胞 (humanum bilicalcordbloodcells,HUCBC)分化为神经元和神经胶质细胞的可行性。方法　采集足月妊娠、正常分娩的新鲜脐血 ,取单个核细胞 (MNC) ,利用人可溶性NF κB配体受体激动因子 (sRANKL)、BDNF作为分化诱导因子进行体外诱导 ,维甲酸 (RA)诱导分化作为对照 ,倒置显微镜动态观察细胞生长、分化情况 ;培养 10d后 ,应用免疫细胞化学染色法检测培养细胞的胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)和神经元特异核蛋白 (NeuN)表达情况 ,进行细胞性质鉴定。结果　诱导分化 10d后 ,RANKL、BDNF和BDNF +RANKL组的NeuN阳性细胞数分别为 (97.0± 13.5 )个 ,(85 .0± 5 .6 )个 ,(16 7.0± 19 7)个 ,分别是对照组 [(5 5 .7±8.5 )个 ]的 1.7,1.5 ,3.0倍 ,GFAP阳性细胞数分别为 114 .7± 18.0 ,2 33.3± 2 1.7,2 89.0± 2 4 .9,分别是对照组的 1.4 ,2 .9,3.6倍。RANKL向神经元方向诱导分化的作用与BDNF相当 ,向神经胶质细胞分化的作用不及BDNF。RANKL和BDNF对HUCBC向神经细胞分化具有协同作用 ,二者联合应用明显促进HUCBC向神经元和神经胶质细胞分化     

Survivin基因在脐血CD_(34)~+干/祖细胞中的表达及意义

目的　探讨Survivin基因在人脐血CD34 +干 /祖细胞中的表达及意义。方法　采用链霉亲和素 生物素 过氧化酶 (SABC)技术和RT PCR技术对人脐血CD34 +细胞中Survivin蛋白及mRNA进行了检测。结果　Survivin基因在新鲜脐血CD34 +细胞中有表达 ,蛋白表达率为 9.4± 1.2 ,SurvivinmRNA为弱阳性。在体外培养过程中 ,造血生长因子可上调Survivin基因的表达 ,其中以SCF、FL、Tpo组合作用最显著 ,体外培养 3d后 ,Survivin蛋白表达率为 2 5 .2± 5 .3 ,SurvivinmRNA表达增强 ,去除细胞因子后 2 4hSurvivin表达下降。结论　Survivin基因不是癌细胞特异性抗凋亡蛋白 ,在正常人造血干 /祖细胞中有表达 ,对正常人造血过程有调节作用。