大鼠淋巴结树突状细胞的超微结构研究

应用电镜及细胞化学技术，观察大鼠淋巴树突状细胞的超微结构及５’－核苷酸酶的反应，发现有两种形态和分布树突状细胞，即小结树突细胞和交错突细胞，小结树突细胞是见于淋巴小结内一种形状不规则，具有多突的细胞，突起的形状呈多样且与周围淋巴细胞关系密切，５’－核苷酸酶呈阳性反应，交错突细胞位于副皮质区内，其超微结构特征为细胞一侧的细长指状折叠的突起，大形线粒体及其周围单层排列的粗面内质网，５’－核苷酸酶呈阴性     

用细胞因子体外富集人外周血树突状细胞及其特征

树突状细胞(DC)是免疫系统中一类强有力的抗原提呈细胞(APC),在始动机体免疫反应中起至关重要的作用。近年来,人们极大地关注DC用于免疫治疗的前景。然而,DC在人外周血中含量甚微(约占外周血单个核细胞的0.1％),给研究带来相当困难。本研究联合应用rhGM-CSF,rhIL-4和rhTNF-α从人外周血中体外培养富集获得高纯度DC群,通过DC的特有形态鉴别以及应用X-11单克隆抗体(抗人血DC表面特异抗原决定簇的单克隆抗体),借助于间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜观察,初步描述了所获取的DC群的特征。这些结果为进一步观察人外周血DC的超微结构和细胞化学特征及其临床研究DC功能提供了基础。     

脐带血树突状细胞的体外诱导及其特征鉴定

目的：探讨在体外无需预先分离CD34^＋造血祖细胞即可有效诱导脐带血单个核细胞而获得脐带血树突状细胞的方法，并对人脐带血树突状细胞的生物学功能进行鉴定。方法：实验于2003—12／2004—10在吉林省肿瘸防治研究所完成。健康孕妇正常胎儿脐带血由吉林省妇幼保健院提供，孕妇签署知情同意书。无菌采集健康孕妇正常胎儿脐带血50mL左右，肝素抗凝。生理盐水稀释后加入甲基纤维素使终浓度为1g／L，室温沉降45min，取上层富含细胞的血浆层，1500r／min离心10min，弃上清，沉淀加两倍体积的生理盐水稀释，以1：1体积叠加于淋巴细胞分层液上，分离出脐带血中的单个核细胞，体外培养24h后去除悬浮细胞，加入粒细胞-巨噬集落刺激因子、白细胞介素4联合刺激脐带血单个核细胞分化为脐带血树突状细胞。在光镜和透射电镜下观察培养的脐带血树突状细胞的形态学特征。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联法测量脐带血树突状细胞表面分子CD1α、人类白细胞抗原-DR的表达水平。四甲基偶氮唑蓝法测定不同细胞密度的树突状细胞刺激同种T淋巴细胞增殖的能力。结果：①不同诱导时间体外培养的脐带血树突状细胞形态学观察：倒置显微镜下，淋巴细胞经细胞因子诱导后第3d聚集成均匀散布的细胞聚体，部分细胞变形，胞体拉长；第7d可见不明显突起，细胞形态不规则，呈疏松贴壁生长或悬浮生长；14d集落样生长，具有典型的树突状细胞形态。透射电镜下可见树突状细胞呈不规则形，细胞表面粗糙，突起明显；细胞核呈肾形或马蹄形，核浆比增大；胞浆中富含线粒体，较少溶酶体。②细胞因子诱导前后脐血淋巴细胞表型的变化：诱导前脐带血淋巴细胞表面不表达CD1α，诱导后CD1α的表达上升为（22．00&;#177;4．36）％；人类白细胞抗原-DR由诱导前的（3．67&;#177;2．08）％表达上升为（61．67&;#177;7．02）％。③脐带血树突状细胞对T淋巴细胞增殖能力的影响：脐带血树突状细胞具有明显刺激同种T淋巴细胞增殖的功能，且其数量的不同对T淋巴细胞的刺激能力亦不同。脐带血树突状细胞与淋巴细胞比值为1：10对平均刺激指数为3．95，比值为1：100时平均刺激指数为2．16。结论：采取粒细胞-巨噬集落刺激因子、白细胞介素-H4联合刺激可成功诱导出形态典型、纯度较高的脐带血树突状细胞，且体外培养后具有明显的刺激同种T淋巴细胞增殖的能力。     

外周血树突状细胞的制备和表型分析

目的：探讨体外分离人外周血单个核细胞（PBMC）和诱导生成树突状细胞（dendriticcell,DC）。方法：从外周血分离PBMC,加入细胞因子诱导DC,流式细胞仪测定CD86和HLA-DR,分析其成熟度和激活度。结果：HLA—DR和CD86在PBMC中几乎无表达,经GM-CSF和IL-4诱导后低表达;加入TNF-α后高表达。结论：GM-CSF和IL-4诱导培养PBMC,可获得大量不成熟DC,加入TNF-α后,DC成熟度高,激活性好。     

脐带血树突状细胞的体外诱导及其特征鉴定

目的:探讨在体外无需预先分离CD34 造血祖细胞即可有效诱导脐带血单个核细胞而获得脐带血树突状细胞的方法,并对人脐带血树突状细胞的生物学功能进行鉴定。方法:实验于2003-12/2004-10在吉林省肿瘤防治研究所完成。健康孕妇正常胎儿脐带血由吉林省妇幼保健院提供,孕妇签署知情同意书。无菌采集健康孕妇正常胎儿脐带血50mL左右,肝素抗凝。生理盐水稀释后加入甲基纤维素使终浓度为1g/L,室温沉降45min,取上层富含细胞的血浆层,1500r/min离心10min,弃上清,沉淀加两倍体积的生理盐水稀释,以1∶1体积叠加于淋巴细胞分层液上,分离出脐带血中的单个核细胞,体外培养24h后去除悬浮细胞,加入粒细胞-巨噬集落刺激因子、白细胞介素4联合刺激脐带血单个核细胞分化为脐带血树突状细胞。在光镜和透射电镜下观察培养的脐带血树突状细胞的形态学特征。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联法测量脐带血树突状细胞表面分子CD1α、人类白细胞抗原-DR的表达水平。四甲基偶氮唑蓝法测定不同细胞密度的树突状细胞刺激同种T淋巴细胞增殖的能力。结果:①不同诱导时间体外培养的脐带血树突状细胞形态学观察:倒置显微镜下,淋巴细胞经细胞因子诱导后第3d聚集成均匀散布的细胞聚体,部分细胞变形,胞体拉长;第7d可见不明显突起,细胞形态不规则,呈疏松贴壁生长或悬浮生长;14d集落样生长,具有典型的树突状细胞形态。透射电镜下可见树突状细胞呈不规则形,细胞表面粗糙,突起明显;细胞核呈肾形或马蹄形,核浆比增大;胞浆中富含线粒体,较少溶酶体。②细胞因子诱导前后脐血淋巴细胞表型的变化:诱导前脐带血淋巴细胞表面不表达CD1α,诱导后CD1α的表达上升为(22.00±4.36)%;人类白细胞抗原-DR由诱导前的(3.67±2.08)%表达上升为(61.67±7.02)%。③脐带血树突状细胞对T淋巴细胞增殖能力的影响:脐带血树突状细胞具有明显刺激同种T淋巴细胞增殖的功能,且其数量的不同对T淋巴细胞的刺激能力亦不同。脐带血树突状细胞与淋巴细胞比值为1∶10时平均刺激指数为3.95,比值为1∶100时平均刺激指数为2.16。结论:采取粒细胞-巨噬集落刺激因子、白细胞介素-4联合刺激可成功诱导出形态典型、纯度较高的脐带血树突状细胞,且体外培养后具有明显的刺激同种T淋巴细胞增殖的能力。     

49例肿瘤患者外周血树突状细胞亚群与细胞免疫功能的研究

目的 检测晚期肿瘤患者外周血树突状细胞数量和T细胞亚群的表达,评价肿瘤患者的免疫功能.方法 应用流式细胞术检测49例晚期肿瘤患者外周血树突状细胞亚群的数量,免疫表型分别为:髓样树突状细胞,CD85K+CD33+CD(16+14)-;浆细胞树突状细胞,CD85K+CD123+CD(16+14)-;以及T淋巴细胞亚群的表达...     

CpG ODN1826刺激人外周血树突状细胞对胃癌细胞杀伤效应的研究

目的探讨CpGODN1826在体外增强树突状细胞（dendriticcells,DC）抗胃癌作用的影响。方法分离正常人外周血DC,用GM-CSF和IL-4培养至第5天分组：GM-CSF＋IL-4组、GM-CSF＋IL-4＋TNF-α组、GM-CSF＋IL-4＋LPS组和GM-CSF＋IL-4＋CpGODN组。自外周血单个核细胞（PBMC）诱导分离DC,流式细胞仪检测其表面标志,MTT法测定其刺激同种异体淋巴细胞增殖的影响,检测其活性及对胃癌细胞的杀伤效应,ELISA检测各组分泌IL-12情况。结果体外培养第10天,CpGODN组出现大量典型的DC形态;流式细胞仪检测CpGODN组显著高表达CD40、CD1a、CD80、CD86、MHC-Ⅱ和分泌IL-12;在体外能强烈刺激同种异体混合淋巴细胞的增殖,显著增强DC杀伤MKN-45细胞的活性。结论 CpGODN可显著地诱导人外周血DC分化成熟,增强DC对胃癌细胞的杀伤作用。     

人外周血树突状细胞的体外诱导培养

目的研究rhGM-CSF和rhIL-4培养体系对树突状细胞(Dendritie Cell,DC)的诱导培养.方法分离正常人或多发性骨髓瘤(MM)患者外周血中单个核细胞,体外培养树突状细胞.观察培养的DC的形态变化,并应用流式细胞仪分析DC表面的免疫分子的表达.结果100ng/ml rhGM-CSF和500U/ml rhIL-4能使正常人或多发性骨髓瘤患者外周血中单个核细胞分化发育为高表达CD80、CD86、HLAⅠ类和HLAⅡ类抗原的DC.结论rhGM-CSF和rhIL-4能使树突状细胞定向分化成为抗原提呈细胞,为DC疫苗治疗肿瘤感染性疾病奠定了基础.     

超声介导SonoVue增效Survivin基因转染脐血来源树突状细胞的实验研究

目的探讨超声联合微泡造影剂Sono Vue增效脂质体介导的Survivin基因体外转染脐血来源树突状细胞的方法。方法体外培养扩增脐血来源的树突状细胞,在不同强度超声波和不同剂量造影剂Sono Vue作用下,观察脂质体介导的凋亡抑制因子Survivin基因与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的融合重组质粒pEGFP-C1-Survivin在树突状细胞的定向转染。激光共聚焦显微镜定性观察细胞转化情况,流式细胞仪观察树突状细胞的表型变化及定量观察细胞转化效率,台盼蓝染色检测超声作用于细胞的安全性。结果脐血来源的树突状细胞以超声机械指数1.0、作用时间60s基因转染时对细胞比较安全,Sono Vue浓度为10%时达到最佳的基因转染效率。流式细胞仪检测转染前后树突状细胞的表型无明显变化,平均转化阳性率可达(51.4±2.5)%,高于单纯脂质体转染的效率(P<0.05)。结论超声联合微泡造影剂Sono Vue可提高脂质体介导的Survivin基因体外转染树突状细胞的效率,为肿瘤的基因及免疫治疗研究提供了新的思路。     

人外周血树突状细胞的体外诱导培养

目的研究rhGM-CSF和rhIL-4培养体系对树突状细胞(DendriticCell,DC)的诱导培养。方法分离正常人或多发性骨髓瘤(MM)患者外周血中单个核细胞,体外培养树突状细胞。观察培养的DC的形态变化,并应用流式细胞仪分析DC表面的免疫分子的表达。结果100ng/mlrhGM-CSF和500U/mlrhIL-4能使正常人或多发性骨髓瘤患者外周血中单个核细胞分化发育为高表达CD80、CD86、HLAⅠ类和HLAⅡ类抗原的DC。结论rhGM-CSF和rhIL-4能使树突状细胞定向分化成为抗原提呈细胞,为DC疫苗治疗肿瘤感染性疾病奠定了基础。     

人外周血来源树突状细胞的诱导及培养方法的研究

目的探讨从人外周血中大量培养树突状细胞(DC)的方法,并在表型、形态、结构等方面进行鉴定。方法采用5步法从人外周血中大量培养DC:①Ficoll不连续密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC);②RPMI-1640培养基离心洗涤去除血小板;③利用DC前体细胞的短暂粘附性去除悬浮细胞及粘附性较强的细胞;④用重组人白介素4(rhIL-4)、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)自外周血单个核细胞诱导分离DC;⑤用重组人肿瘤坏死因子诱导产生成熟的DC。用荧光显微镜检测DC表面分子的表达,在扫描电镜下观察DC的形态。结果获得了具有典型特征的DC前体细胞,在GM-CSF和rhIL-4协同诱导9 d后,荧光显微镜下可见DC表面CD83、CD40、HLA-DR的表达。扫描电镜观察可见:DC细胞形态不规则,从胞体辐射状伸出数个粗细不等的突起,有的长度可达胞体的2～3倍,长突起存在分叉及汇合现象。在长突起的基部存在大量短小的圆形或椭圆形突起。结论人外周血来源DC的5步培养法可获得较高数量的典型DC,且该法稳定、简便、经济,为DC的临床免疫治疗提供了实验依据。     

人外周血单核细胞体外诱导树突状细胞的形态学观察与功能研究

目的：探讨从人外周血单核细胞体外培养扩增的树突状细胞(dendritic cell,DC)形态学特征及其活性。方法：人外周血常规分离单个核细胞，粘附6h后去除悬浮细胞，以细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)进行诱导培养7d，并进行形态学特征，细胞表型和淋巴细胞刺激能力鉴定。结果：培养1周即可得到大量DC，形态学观察可见细胞形态不规则，细胞表面大量突起，为典型的DC特征，免疫组化和间接免疫荧光显示CDla阳性表达率达80％～95％，并能刺激同种淋巴细胞增殖反应。结论：人外周血单核细胞可经GM-CSF、IL-4诱导培养成DC，具有典型的树突状细胞的形态学特征及抗原呈递能力。     

健康人外周血树突状细胞体外培养及表型鉴定

目的 分离人外周血单个核细胞,经体外诱导培养获取成熟树突状细胞(DC),并对树突状细胞表型表达鉴定,为进一步研究DC功能提供基础.方法 取健康成人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞,2 h贴壁后加入粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-4,第6天加入肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激DC成熟,倒置显微镜观察每日细胞形态;分别于第1天、第6天、第8天用流式细胞仪对其进行表型鉴定;同种异体混合淋巴细胞反应观察对T细胞的抗原提呈能力 倒置显微镜下DC细胞形态不规则,表面有毛刺状突起,呈DC典型形态学特征;成熟DC细胞表面CD1a、CD80、CD83、人类白细胞抗原(HLA)-DR表达明显增加,混合淋巴细胞反应OD值增加.结论 用GM-CSF、IL-4和TNF-α可以诱导健康成人外周血单个核细胞,培养出成熟的DC细胞,为进一步研究DC功能提供基础.     

体外纯化培养外周血来源的树突状细胞的研究

目的建立来源于外周血的树突状细胞(DCs)的纯化培养方法并观察DCs的形态及功能。方法以Fi-coll密度梯度离心法从正常人外周血中分离出外周血单个核细胞(PBMNC)后,用体外培养的手段,采用培养黏附法或经免疫磁珠筛选法,获得单核细胞;分别加入不同浓度的细胞因子(重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子重组人白介素4重组人肿瘤坏死因子α)诱导培养,培养12 d诱导出DCs;用光镜和电镜观察培养的DCs,用流式细胞仪检测DCs表面的细胞表型(CD80、CD83、CD86、CD1α、HLA-DR),MTT法检测DC对T细胞的刺激增殖效应。结果在体外诱导出外周血来源的成熟DCs,电镜和光镜分析表明具有DCs的典型形态,所培养的细胞表面高表达CD80、CD83、CD86、CD1α、HLA-DR,并具有刺激异基因淋巴细胞增殖的能力。结论应用外周血来源的单个核细胞,采用培养黏附法或免疫磁珠分选法分选出的单核细胞,细胞因子培养12 d可得到成熟正常的DCs。     

脐血CD34+细胞和外周血单核细胞两种来源的树突状细胞特性的比较研究

目的　体外大量扩增和纯化具有典型表型、形态和功能的树突状细胞（ＤＣ）,以进行相关基础研究和临床应用。方法　采用免疫磁珠法分离脐血ＣＤ３４ ＋ 细胞及外周血去Ｂ、去Ｔ淋巴细胞的单个核细胞（ 单核细胞） ,然后以ＧＭＣＳＦ、ＩＬ４、ＴＮＦα、Ｆｌｔ３ 配基（ＦＬ）、ＳＣＦ等不同的细胞因子配伍,分别诱生ＤＣ,通过流式细胞仪、电镜、光镜分析其特性,同时检测其刺激同种Ｔ细胞增殖的能力。结果　脐血与外周血诱生ＤＣ的方案不同,由脐血ＣＤ３４＋ 细胞诱导ＤＣ 时,ＧＭＣＳＦ＋ ＴＮＦα＋ ＳＣＦ＋ ＦＬ 组合可使ＣＤ１ａ＋ 细胞比例增至（２７ ．１８ ±１－５６）％ ,明显高于单独应用ＧＭＣＳＦ组［（０．６５±０ ．３８）％ ］ 。外周血单核细胞诱导的ＤＣ,则ＧＭＣＳＦ＋ 高剂量ＩＬ４（１０００ Ｕ／ｍｌ） 组合效率最高,诱生的ＣＤ１ａ ＋ 细胞可达（２１ ．８０ ±０－３２） ％ 。两种来源的ＤＣ在表型及形态上差异无显著性,两者同样具有刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。结论　从脐血和外周血均可诱生ＤＣ,根据应用目的的不同对其进行选择,这为ＤＣ用于临床治疗选择不同细胞来源提供了实验基础。     

冻融人脐血树突状细胞疫苗的抗肝癌活性

目的：观察人肝癌裂解抗原致敏的冻融人脐血树突状细胞(dendriti cells,DC)诱导的CTL抗肝癌活性,并观察与细胞因子联用的效应。方法：应用CD34^+干细胞试剂盒和免疫磁珠标记法分选人脐血CD34^+干细胞,细胞因子扩增培养为成熟DC,液氮冻存;人肝癌裂解抗原致敏冻融DC制备疫苗,进行DC疫苗及其与细胞因子联用的体外抗肿瘤实验,MTT检测各自诱导的CTL活性,并作统计学处理。结果：肝癌抗原致敏的人脐血冻融DC疫苗能诱导高效的CTL活性(P＜0．01),与新鲜DC疫苗差异无显著意义(P＞0．05)。冻融DC疫苗与1μg／mL GM-CSF联用,或与500U／mL TNF-a联用,诱导的CTL活性均明显增高(P＜0．05)。结论：肝癌抗原致敏的人脐血冻融DC疫苗能诱导具有高度针对靶细胞的特异性CTL活性,与细胞因子联用有一定的协同作用。     

外周血单核细胞来源树突状细胞体外扩增及诱导抗乳腺癌免疫的研究

目的研究外周血来源树突状细胞(DC)的体外扩增及诱导特异性抗乳腺癌细胞的免疫效应。方法(1)从外周血中分离单个核细胞后,获得单核细胞(monocyte,Mo)。粒-单集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导分化扩增培养7d后,应用流式细胞术进行表型分析。(2)诱导单核细胞分化的第3天加入人乳腺癌细胞株3A0的冻融抗原培养4d后,获得负载肿瘤抗原的成熟DC;将致敏DC与从外周血中分离的同种异体T淋巴细胞共培养3d,获得细胞毒T淋巴细胞(CTL);四甲基偶氮唑蓝法检测CTL及上清液对人乳腺癌细胞株3A0、人胚肾细胞株293T(对照细胞)、人肝癌细胞株HCCC-9810的细胞毒作用。结果(1)外周血来源Mo在GM-GSF和IL-4作用下,第7天后可分化生成成熟的DC,高表达DC特异性抗原CDla、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)HLA-DR、CD83。(2)DC可负载并递呈肿瘤抗原,激活同种异体T淋巴细胞,诱导肿瘤特异性CTL产生。不同浓度CTL及上清液对乳腺癌细胞3A0有特异性杀伤、抑制作用(P<0.05)。结论外周血中Mo可体外分化扩增为成熟的功能性DC,并诱导出特异性杀伤乳腺癌细胞的免疫效应。     

人外周血树突状细胞低温保存的优化研究

目的探寻冻存树突状细胞(DCs)优化的冷冻保护剂组合。方法配制含不同浓度二甲基亚砜(DM-SO)的3种冷冻保护剂组合,A组:5%DMSO+6%羟乙基淀粉(HES)+4%人血清白蛋白(HAS);B组:10%DMSO+40%FCS;C组:12%DMSO+40%FCS,比较3组冷冻保护剂对人外周血CD14+单个核细胞诱导产生的成熟树突状细胞(mDCs)的冻存效果:采用两步法将mDCs冻存于-80℃冰箱过夜后转移至-196℃液氮气相中放置24 h,再将冻存的mDCs复苏后继续培养,并检测、比较冻存前后DC的形态、存活率、细胞表型及其对同种异体T细胞刺激活性的差异。结果 3组不同组合冷冻保护剂冷冻保存的mDCs复苏后其存活的细胞的形态没有发生明显改变,仍保留其成熟表型,并具备对T细胞的刺激活性。结论 3种不同浓度的DMSO冷冻保存mDCs,5%DMSO+6%HES+4%HSA组合更适宜。