血小板单克隆抗体SZ—51单链抗体的基因构建及其在大肠杆菌中？…

探讨降低鼠源性单克隆抗体对人体的免疫原性；方法：应用基因工程技术扩增出ＳＺ－５１重链和轻链可变区ｃＤＮＡ与连接肽的寡核苷酸片段进行拼接构建了表达载体ｐＨＥＮ１－５１ｓｃＦｖ，并导入大肠杆菌ＨＢ２１５１中进行表达。结果：其表达产物可折叠成可溶性并具有抗原结合能力的单链抗体释放到细菌培养上清中。结论：该分泌型小肽抗体能特异地与α－颗粒膜蛋白结合具有原鼠源单抗一致的抗原结合特性。     

SZ-51单链抗体与金属硫蛋白的融合基因构建及其在大肠杆菌中的表达

近年来,对活化血小板膜糖蛋白１４０（ＧＭＰ１４０）的单抗ＳＺ５１进行了系列基因工程抗体的研究,首先克隆出抗体的可变区基因［１］,从而获得了系列基因组抗体［２］,使鼠源性抗体对人体的免疫原性大大降低。我们利用金属硫蛋白（ＭＴ）的低相对分子质量（６０...     

血小板单克隆抗体SZ-51单链抗体的基因构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：探讨降低鼠源性单克隆抗体（单抗）对人体的免疫原性。方法：应用基因工程技术扩增出SZ－51重链和轻链可变区cDNA与连接肽（Gly4Ser）3的寡核苷酸片段进行拼接构建了表达载体pHEN1-51scFv，并导入大肠杆菌HB2151中进行表达。结果：其表达产物可折叠成可溶性并具有抗原结合能力的单链抗体（scFv，小分子肽）释放到细菌培养上清中。结论：该分泌型小肽抗体能特异地与α－颗粒膜蛋白结合，具有与原鼠源单抗一致的抗原结合特性。     

小鼠2型金属硫蛋白基因的克隆

目的 构建含有小鼠Ⅱ型金属硫蛋白（MT）基因的真核表达载体,为进行MT抗氧化作用的体内功能实验奠定基础。方法 采用重叠延伸PCR技术设计两对引物,利用引物间的互补序列作为模板合成小鼠Ⅱ型MT基因。结果 将PCR产物经连接反应,连接产物转化JM109,摇菌后提取质粒,质粒的酶切鉴定及最后的测序结果均表明本实验所获得的小鼠Ⅱ型MT基因与GENEBANK中的目标基因序列完全一致。结论 本实验通过重叠PCR技术成功构建了小鼠Ⅱ型MT编码基因,重叠PCR技术是合成目的基因片段的有效的手段。     

单链抗体分子与链亲和素融合蛋白的制备

研究了抗人纤维蛋白单链抗体分子scFV-8E5与链亲和素融合蛋白的制备。链亲和素拼接在scFV-8E5 cDNA的3’端,制备的融合蛋白单体分子量约45kD。表达产物少数为周质间可溶型蛋白,多数为包涵体。无论是可溶型的蛋白产物或从包涵体中回收并复性的蛋白产物均有结合人纤维蛋白和生物素的功能。这个双特异性融合蛋白的成功制备证明了在scFV-8E5的3’端拼接其它效应分子的可行性。     

克隆IN—l重组单链抗体基因与促进中枢神经再生的研究

目的 利用基因工程技术，对IgMG型的IN-1的基因进行改良，以得到IN-1重组单链抗体（scFv)cDNA基因片段为促使受损的中枢神经再生和治疗弥漫性轴索损伤开辟一个崭新途径。方法 宿主菌为大肠杆菌DH5a，克隆质粒为pUC18。参照genebank中发表的IN-1抗体的轻链重链序列，重新设计适于在大肠杆菌中表达的目的基因片段，将该基因双链分成35个小片段合成，经退火、复性连接成目的片段后，克隆到经过BamHI和HindⅢ双本科切的克隆载体pUC18中，并转化大肠杆菌DH5a，抽提重组子pUC18/744进行克隆PCR、酶切鉴定及测序分析。结果 测序结果证明获得的基因序列与实验设计仅差一个碱基。结论 正确设计并合成了IN-1重组单链抗体（IN-1-scFv）的cDNA，为深入研究其生物活性奠定了基础，也为应用抗体工程治疗弥漫性轴索损伤开创了一个新思路。     

金属硫蛋白非融合性原核表达载体的构建

目的：构建表达金属硫蛋白（metallothionein，MT）的非融合性原核表达载体。方法：以大肠杆菌BL21中的PET-GST—MT质粒为模板，PCR扩增目的片段，双酶切，胶回收纯化，连接至pGEM—T载体扩增，双酶切，亚克隆至pBV220载体．转入大肠杆菌DH-5α中。结果：PCR产物大小符合要求．重组质粒PBV220-MT双酶切鉴定与其一致，测序结果正确。结论：成功构建MT原核表达载体，为下一步从DH-5α-pBV220-MT工程菌中表达并纯化非融合性MT打下基础     

重组金属硫蛋白2A质粒的构建与表达

目的构建重组金属硫蛋白2A(MT-2A)原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究MT-2A奠定基础。方法从人骨骼肌细胞cDNA文库中PCR扩增MT-2A基因DNA序列,构建重组表达质粒MT2A-pET32a,PCR与DNA测序法鉴定插入序列;重组细菌用IPTG诱导表达,His-bind亲和层析柱纯化MT-2A蛋白,Western blotting鉴定蛋白特性。结果扩增获得的MT-2A基因片段长186bp,DNA测序证实MT2A-pET32a重组质粒构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约为29×103,Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒MT2A-pET32a,在大肠埃希菌内诱导表达并纯化获得MT-2A。     

P—选择素凝集样区和绿色荧光蛋白融合基因的构建

目的 构建P-选择素凝集样区与绿色荧光蛋白融合基因（pEGFP-N1/L）,为进一步明确P-选择素不同表位与功能间的关系,为阐明P-选择素生理病理意义奠定基础。方法 应用PCR技术扩增质粒pCDM1/cDNA凝集素校区,用T4连接酶将其插入载体pEGFP-N1;经酶切和测序对插入片段进行分析、鉴定。结果 通过酶切和序列分析证实插入片段序列正确。结论 应用基因工程技术构建pEGFP-N1/L融合基因成功,为绿色荧光蛋白作为主生物标记分子来研究P-选择素分子的构效关系打下良好的基础。     

血小板生成素突变体的克隆和扩增及其融合蛋白在大肠杆菌中…

目的：通过获得编码血小板生成素成熟肽Ｎ端１￣１９６个氨基酸的突变体ｃＤＮＡ在大肠杆菌ＪＭ１０９中的表达，为Ｔｐｏ进一步的结构和功能研究提供材料来源。方法：用多聚酶链反应及ＤＮＡ重组技术，将ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９载体并测序，然后克隆到表达载体ｐＭＡｌ－ｃ２上。     

人ICA69基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达与应用初探

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达国人胰岛细胞自身抗原69kd蛋白（hICA69)，获得足量的、可供实验研究的ICA69抗原，用于I型糖尿病的早期诊断和联合筛查。方法：用PCR法扩增出编码hICA69的cDNA片段，直接克降到pSPORT1质粒上，经DNA序列测定后，再插入到GST融合蛋白表达载体pGEX-2T的EcoRI和SmaI位点之间，构成重组质粒p25-hICA69,将此质粒导入大肠杆菌，经IPIG诱导后获得GST-hICA69融合蛋白的表达产物，用间接ELISA法检测100例正常人和30例I型糖尿病人血清中抗ICA69抗体。结果：所获PCR产物经序列分析确证为1449bp，编码483个氨基酸，并正确地重组到pGEX-2T表达型质粒中，其在原核细胞中表达的融合蛋白具有免疫原性，并能应用于I型糖尿病病人血清中抗ICA69抗体的检测。结论：运用基因工程技术获得的表达产物的重组ICA69抗原。这一抗原的获得，将有助于提高I型糖尿病的预报率和确诊率。     

过氧化氢对金属硫蛋白Ⅰ／Ⅱ敲除小鼠脾细胞的氧化应激

背景：脑缺血再灌注早期,由于脾脏中有大量炎症因子浸润引发氧化应激损伤,导致脑缺血再灌注后脾细胞出现大量凋亡。目的：观察外源性过氧化氢对金属硫蛋白Ⅰ/Ⅱ敲除小鼠脾细胞活力的影响及N-乙酰-L-半胱氨酸对过氧化氢诱导的脾细胞氧化应激损伤的保护作用。方法：制备金属硫蛋白敲除小鼠脾细胞悬液,分别用不同浓度（0．1,0．2,0．5,1,2mmol／L）过氧化氢处理2h后,MTT比色法检测细胞活力。根据MTT结果选择不同浓度过氧化氢（0．5,1mmol／L）诱导脾细胞凋亡,实验分为6组：对照组、N-乙酰-L-半胱氨酸组、0．5mmol／L过氧化氢组、1mmol／L过氧化氢组、N-乙酰-L-半胱氨酸＋O.5mmoI／L过氧化氢组、N-乙酰-L-半胱氨酸＋1mmol／L过氧化氢组,2h后MTT比色法检测细胞活力,酶标仪法检测乳酸脱氢酶活力及紫外分光光度仪检测线粒体通透性转换孔的开放情况。结果与结论：随过氧化氢浓度增加脾细胞活力呈明显下降趋势（P〈0．01）,且0．2,0．5,1,2mmol／L过氧化氢组脾细胞活力下降幅度最大。与对照组相比,N-乙酰-L-半胱氨酸组脾细胞活力明显提高（P〈O．01）,且乳酸脱氢酶活力降低（P〈0．01）,线粒体通透性转换孔开放减少（P〈0．01）;分别于0．5,1mmol／L过氧化氢组相比,N-乙酰-L-半胱氨酸＋O．5mmol／L过氧化氢组、N-乙酰-L-半胱氨酸＋1mmol／L过氧化氢组脾细胞活力也明显提高（P〈0．01）,乳酸脱氢酶活力降低（P〈0．01）,线粒体通透性转换孔开放减少（P〈0．01）。结果表明,金属硫蛋白Ⅰ/Ⅱ敲除小鼠随着过氧化氢浓度的升高,脾细胞活力逐渐下降,呈浓度依赖性,尤其对0．2,0．5,1,2mmol／L过氧化氢刺激最为敏感。N-乙酰-L-半胱氨酸使乳酸脱氢酶释放和线粒体通透性转换孔的开放减少,脾细胞活力增强,以此减轻过氧化氢诱导的金属硫蛋白Ⅰ/Ⅱ敲除鼠脾细胞的氧化应激损伤。     

人CD40—Ig融合蛋白表达载体的构建及其在COS—7细胞的表达

ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ途径是除Ｂ７／ＣＤ２８途径之外的重要的共刺激信号转导途径,在Ｔ细胞活化过程中扮演着十分关键的角色。因而,该途径可能在同种移植排斥的诱导和效应阶段的不同时期发挥关键作用。本研究旨在获得人ＣＤ４０分子胞外区和人ＩｇＧ１Ｆｃ段的融合蛋白,以探索阻断ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ共刺激途径在免疫治疗中的潜在应用。首先,从人Ｂ淋巴瘤细胞系Ｄａｕｄｉ中提取细胞胞总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增人Ｃ     

病毒硫氧还蛋白基因在Neur02A细胞中的重组与表达

背景：目前对抗氧化基因硫氧还蛋白的研究逐步受到重视，但从基因治疗的角度对其研究较少。目的：采用硫氧还蛋白转染Neuro-2A细胞，观察细胞内表达相应蛋白因子对细胞的具体保护效果，并分析其发挥保护作用的可能机制。方法：以质粒PIRES2-EGFP-TRX转染Neuro-2A细胞，经RT-PCR鉴定，建立能够稳定表达硫氧还蛋白的细胞株。利用不同浓度的H202处理正常细胞及转染细胞，建立氧化应激模型。观察受到氧化损伤后两组细胞的形态学、存活率、还原型谷胱甘肽的浓度及细胞内DNA链断裂情况。结果与结论：经H2O2作用后，两组细胞形态均出现损伤，但转染组细胞比正常组细胞损伤减轻、细胞存活率升高、细胞内还原型谷胱甘肽水平增高、DNA链断裂程度减轻。说明人类硫氧还蛋白基因可以在Neuro-2A细胞中被重组并顺利表达，对细胞具有一定的保护作用；这一作用可能是通过清除氧自由基，维持细胞内还原型谷胱甘肽水平，从而保护细胞DNA免受氧化性损伤来实现的。     

垂体腺瘤中基质金属蛋白酶-2、层粘连蛋白受体基因蛋白的表达与侵袭性的关系

目的探讨基质属蛋白酶-2（MMP-2）、层粘连蛋白受体（LN-R）的表达与侵袭性垂体腺瘤的关系。方法用免疫组化的方法对60例垂体瘤患者组织标本中这三个指标的表达进行检测。免疫组化结果用半定量的方法进行分析。结果60例垂体瘤患者中，32例女性，28例男性。其中，30例为侵袭性垂体腺瘤，30例为非侵袭性垂体腺瘤。免疫组化显示侵袭性垂体腺瘤的MMP-2、LN-R的表达明显高于非侵袭性垂体腺瘤（P〈0．01）。结论MMP-2、LN-R的高表达与垂体腺瘤的侵袭性密切相关。MMP-2、LN-R可以作为判定垂体腺瘤侵袭性的有效指标。     

增强型绿色荧光蛋白基因与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1-3区域融合表达载体的构建

目的构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1—3区域（KDRn3）的融合基因真核表达载体，为研究KDRn3在抑制视网膜新生血管性疾病中的作用奠定基础。方法以质粒pcDNA3．1／KDRn3为模板，PCR扩增KDRn3基因，将目的片段克隆至pMD18-T载体，其产物双酶切后连接到质粒pEGFP-N1。结果酶切及琼脂糖电泳分析表明提取及纯化的重组质粒含有目的基因片段，大小正确。结论成功构建了EGFP与人KDRn3的融合基因真核表达载体pEGFP-N1／KDRn3。