骨髓间充质干细胞促进大鼠小体积肝移植后肝再生的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞能否促进大鼠小体积肝移植后移植肝的再生.方法 体外分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞.在30％大鼠部分肝移植的模型基础上,实验分为对照组(30％ PLT)和骨髓间充质干细胞干预组(30％PLT+ MSC).比较两组肝移植术后的存活率,分析肝功能的变化,通过免疫组化来观察移植肝标本Cyclin D1和PCNA的表达,并对移植肝组织结构进行电镜观察.结果 骨髓间充质干细胞的干预,能够改善小体积肝移植术后肝功能状况,减轻组织学损伤,并能够提高存活率,30％ PLT组与30％ PLT+ MSC组一周存活率分别为16.7％和58.3％.而在Cyclin D1和PCNA的免疫组化表达中,30％ PLT组表达明显抑制,30％ PLT+ MSC组表达上调.结论 骨髓间充质干细胞可以存进大鼠小体积肝移植后移植肝的再生,改善肝功能,并提高存活率.     

间充质干细胞移植对大鼠移植肝脏缺血再灌注损伤的影响

目的 研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植促进大鼠减体积肝移植术后肝脏缺血再灌注损伤修复及再生的作用.方法 本研究①取同龄健康Wistar大鼠骨髓进行BMSCs体外培养,用第3代细胞制备悬液.②建立同龄健康Wistar大鼠50%减体积肝移植模型,分为实验组(BMSCs经门静脉植入)和对照组(生理盐水经门静脉注射)观察大鼠术后生存状态,术后不同时间留取血清和肝组织标本,采用免疫组化、流式细胞等方法进行检测.结果 成功体外分离培养BMSCs和建立50%减体积肝移植模型;大鼠肝移植术后2 h,自由活动和饮水.实验组丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)不同时间点与相应的对照组相比差异有统计学意义(均P＜0.05).实验组细胞周期:术后第2、3天时肝组织的G0/G1期细胞比例显著低于对照组(分别F=22.061,44.572,均P＜0.01).增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数增高,术后第2、3和7天时比较,差异有统计学意义(分别F=30.716,28.281,8.975,均P＜0.05).结论 移植肝局部植入BMSCs后,可以促进大鼠肝细胞增殖和加快减体积肝移植术后缺血再灌注损伤的修复.     

表达HGF的骨髓间充质干细胞促进小移植肝早期肝再生

目的 建立大鼠小体积肝移植模型,输注表达人肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),研究其在移植早期对小移植肝促再生作用.方法 将已建立的表达hHGF和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的MSCs,分别命名为HGF/MSCs,GFP/Mscs.建立大鼠30%肝移植模型.受体分为4组,实验组输注5×106HGF/MSCs;对照组则分别输注相同体积的生理盐水(PS),5×106 GFP/MSCs或1.0×109 pfu含hHGF的重组腺病毒液(Ad-HGF).分别于术后1,3,5,7 d各组随机抽取5只大鼠处死.取血检测血清ALT和hHGF.记录移植物湿重.取肝组织检测hHGF、c-met表达,以及肝细胞凋亡和增殖活性.另每组15只,分组同上,用于观察生存期.结果 PS组大鼠7 d生存率33.3%;组织学及血清学检查示术后肝脏损伤重,汇管区单核细胞浸润多;而实验组大鼠7 d生存率为73.3%.肝脏损伤轻,炎性细胞浸润少;实验组移植肝再生较PS组明显增加.结论 大鼠部分肝移植后,输注HGF/MSCs能够保护小体积移植肝,促进小移植肝再生,提高7 d生存率.     

骨髓间充质干细胞在肝脏疾病治疗中的应用

原发性肝癌大多于肝纤维化、肝硬化的基础上发生,最终导致肝功能衰竭和全身转移.手术切除是肝癌的首选治疗方式,介入治疗和肝移植也是治疗终末期肝癌的手段.然而,肝部分切除和介入治疗往往制约于肝功能的失代偿.肝移植由于缺乏供体和价格昂贵临床亦难以广泛开展.近十多年来,骨髓间充质干细胞(BMSC)研究在医学领域取得了令人瞩目的成就.本文就骨髓间充质干细胞在肝脏疾病治疗中的应用作一综述.     

异基因骨髓间充质干细胞移植治疗小鼠前列腺癌的实验研究

目的观察非清髓性异基因骨髓间充质干细胞移植对小鼠前列腺移植瘤的治疗效果。方法应用全骨髓培养法培养BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞,通过流式细胞术检测第四代细胞中CD44阳性细胞率,并通过油红染色鉴定由骨髓间充质干细胞分化的脂肪细胞。应用C57小鼠源性前列腺癌株RM-1(2×10~6/只)制成C57BL小鼠皮下移植瘤模型,分为对照组和异基因骨髓间充质干细胞移植组,每组10只。应用FC方案(氟达拉滨30mg/m~2,-d~(1-5);环磷酰胺300mg/m~2,-d~(1-3))对非对照组小鼠进行非清髓性预处理。异基因干细胞移植组小鼠经尾静脉注入骨髓间充质干细胞1×10~6个/只。记录并比较两组小鼠的肿瘤体积及生存时间。结果全骨髓培养法培养的第四代细胞中CD44阳性率为84.29%,油红染色证实由骨髓间充质干细胞自然分化的脂肪细胞存在。与对照组相比,异基因骨髓间充质干细胞移植显著的抑制了小鼠前列腺癌的生长(P=0.047),并明显延长了异基因骨髓间充质干细胞移植组小鼠的生存时间(P=0.00001)。结论异基因骨髓间充质干细胞移植显著的抑制了小鼠前列腺癌的生长,延长了受体小鼠的生存时间,预示了将骨髓间充质干细胞作为抑癌基因载体的良好前景。     

肝干细胞来源、定向分化及其转化机制

本文综述了近年来胚胎、造血、肝内祖细胞和小肝细胞样祖细胞、骨髓、间充质来源干细胞定向向肝细胞分化的研究进展,并阐述了干细胞转化为肝细胞的机制是融合还是转化.对此深入研究可望为肝干细胞移植和基因治疗带来希望,进而为临床肝移植面临的供肝短缺提供可选择的补充治疗方法.     

肝干细胞来源、定向分化及其转化机制

本文综述了近年来胚胎、造血、肝内祖细胞和小肝细胞样祖细胞、骨髓、间充质来源干细胞定向向肝细胞分化的研究进展,并阐述了干细胞转化为肝细胞的机制是融合还是转化.对此深入研究可望为肝干细胞移植和基因治疗带来希望,进而为临床肝移植面临的供肝短缺提供可选择的补充治疗方法.     

骨髓间充质干细胞对肝癌影响作用的研究进展

肝癌术后患者常因肝脏组织代偿和恢复功能受限,术后急性肝衰竭的发病率及病死率较高.骨髓间充质干细胞可以在肝脏微环境下直接分化为新的肝细胞,通过分泌营养因子促进组织修复、参与免疫调节、抗纤维化和抑制肝星状细胞和肝原细胞的活性等,对肝损伤及肝功能不全具有较好的疗效.然而骨髓间充质干细胞同时具有致瘤性和促进肿瘤生长的作用.利用骨髓间充质干细胞预防和治疗肝癌术后肝衰竭的发生是否安全可靠,这是目前研究的热点问题.本文就骨髓间充质干细胞对于原发性肝癌影响作用的研究进展进行综述,以期为干细胞的临床应用提供理论基础.     

经门静脉注射骨髓间充质干细胞对大鼠转化生长因子-βR1、-βR2的影响

目的探讨经门静脉注射骨髓间充质干细胞对急性肝功能衰竭大鼠肝脏组织中转化生长因子-β受体(TGF-βR)1和TGF-βR2的影响。方法选择清洁级雄性SD大鼠60只,随机分为正常对照组、急性肝功能衰竭组和骨髓间充质干细胞治疗组,每组20只大鼠。正常对照组不给予任何处理。急性肝功能衰竭组和骨髓间充质干细胞治疗组大鼠均先制备急性肝功能衰竭模型,然后骨髓间充质干细胞治疗组经门静脉注射骨髓间充质干细胞,急性肝功能衰竭组给予等体积的生理盐水。治疗后第7天,观察各组大鼠的存活情况,采用HE染色法观察各组大鼠肝脏组织的病理学变化,TUNEL法检测各组大鼠的肝细胞凋亡情况,Western blot法检测各组大鼠肝脏组织中TGF-βR1和TGF-βR2蛋白表达情况。结果 (1)急性肝功能衰竭组术后1周存活率明显低于正常对照组(P0.05),骨髓间充质干细胞治疗组术后1周存活率明显高于急性肝功能衰竭组(P0.05)。(2)急性肝功能衰竭组的肝细胞呈弥漫性坏死,小叶结构模糊不清,见大量桥接样坏死;骨髓间充质干细胞治疗组炎性细胞浸润减少,肝小叶结构逐渐恢复,周围可见正常肝细胞。(3)急性肝功能衰竭组和骨髓间充质干细胞治疗组肝细胞凋亡指数均明显高于正常对照组(P0.05),而骨髓间充质干细胞治疗组的细胞凋亡指数较急性肝功能衰竭组明显降低(P0.05)。(4)急性肝功能衰竭组的肝脏组织中TGF-βR1和TGF-βR2蛋白相对表达量明显高于正常对照组(P0.05);骨髓间充质干细胞治疗组的肝脏组织中TGF-βR1和TGF-βR2蛋白相对表达量较急性肝功能衰竭组明显降低(P0.05)。结论骨髓间充质干细胞在肝细胞损伤恢复中能抑制肝细胞凋亡,其机制可能与调节TGF-βR1和TGF-βR2蛋白的表达有关,但其具体调节通路需要进一步的研究。     

骨髓间充质干细胞定向分化肝细胞及肝内移植研究

目的 观察体外诱导骨髓问充质干细胞分化及肝纤维化形成环境中移植情况。方法 首先行骨髓间充质干细胞提取、分离和培养，加入肝细胞生长因子（HGF，20μg／L）和表皮生长因子（EGF，1．5mg／L）诱导定向分化。肝纤维化形成的大鼠随机分成2组，每组10只。使用5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记诱导的骨髓间充质干细胞，经门静脉向肝纤维化形成的SD大鼠肝脏移植，对照组用BrdU标记未经诱导的骨髓间充质干细胞。2周后通过免疫组织化学方法检测大鼠肝脏标记细胞的分布及BrdU^＋／ALB^＋细胞数量。结果 体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化的细胞CK8及ALB表达阳性。移植2周后大鼠肝脏均可检测到BrdU标记细胞，与对照组相比诱导后骨髓问充质干细胞组BrdU^＋／ALB^＋细胞数较多，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 经体外诱导骨髓间充质干细胞能分化为肝细胞，移植在大鼠肝纤维化形成环境中，白蛋白表达细胞数更多。     

大鼠小体积肝移植物再灌注早期EGR-1的表达及其意义

目的探讨早期生长因子(EGR-1)在大鼠小体积肝移植物早期损伤中的表达及意义。方法雄性SD大鼠随机分成3组:假手术组(SO组),小体积肝移植物组(30%供肝组),全肝移植物组(100%供肝组)。采用两袖套法建立肝移植模型,比较再灌注24 h内3组肝功能指标变化、肝脏组织病理学改变及肝移植物内EGR-1和内皮素-1(ET-1)表达的变化。结果假手术组AST水平明显低于其余两组(P0.01),而100%供肝组AST水平低于30%供肝组,其中6,24 h时点上,两者差异具有统计学意义(P0.01)。光镜检查显示24 h 30%供肝的肝窦明显扩张,肝窦内衬细胞崩解、分离。假手术组未见EGR-1和ET-1表达,30%供肝组EGR-1和ET-1表达明显强于100%供肝组。结论小体积肝移植物早期损伤与EGR-1高表达及受其调控的ET-1表达上调有关。     

20%小体积的大鼠肝脏移植模型

目的 应用显微外科技术建立20%小体积移植物的大鼠原位肝脏移植模型.方法 原位移植建立20%小体积大鼠肝脏移植模型.雄性Lewis大鼠40只,供体20只,受体20只.供肝经门静脉用4℃ UW液灌注.肝上下腔静脉用端端吻合连续缝合的方法.肝下下腔静脉和门静脉分别用套管方法固定.套叠缝合法重建肝动脉.胆管重建采用内支架管端端连接的方法.观察移植物的存活率.免疫组化检测肝细胞摄取溴脱氧尿核苷的情况.结果 共施行肝脏移植手术20例,移植手术成功率为100%.20%小体积肝脏移植物的存活率为93.8%(＞14 d).组织学检查移植后的肝脏组织结构良好.移植术后72 h溴脱氧尿核苷染色阳性的肝细胞计数明显增多.结论 20%小体积大鼠肝脏移植物可启动完成移植后的肝脏再生.显微外科技术是移植模型成功的关键.该模型稳定性强,适合于部分肝脏移植领域的基础研究.     

依达拉奉减轻大鼠小体积肝移植物缺血再灌注损伤

目的 探讨依达拉奉减轻大鼠小体积肝移植物缺血再灌注损伤的作用及其可能机制.方法 采用成年雄性SD大鼠作为肝移植的供、受者,随机将受者分为依达拉奉组和对照组,每组8只.依达拉奉组受者移植前30 min经阴茎背静脉注射依达拉奉3 mg/kg,对照组受者仅给予等量生理盐水.采用改良的二袖套法建立大鼠40%(供肝重量与受者全肝重量比)小体积供肝肝移植模型.术后6 h时,处死两组受者,使用全自动生化分析仪检测血清天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测移植肝组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量,使用相应的检测试剂盒检测移植肝组织中MDA含量以及SOD和MPO的活性.同时,取移植肝组织进行病理学检测,观察肝组织病理损伤情况.结果 术后6h,依达拉奉组受者血清AST和ALT水平分别为(825.50±72.87)U/L和(687.40±72.21)U/L,对照组分别为(1188.03±124.04)U/L和(988.66±91.07)U/L,依达拉奉组明显低于对照组,两组间比较,差异均有统计学意义(P<0.01).与对照组比较,依达拉奉组受者移植肝组织中MDA和TNF-α含量明显下降,MPO活性也明显下降,而SOD活性则明显增加,两组间比较,差异均有统计学意义(P<0.01).移植肝组织病理学检查发现,对照组肝细胞发生明显的空泡样变性伴局部坏死灶,肝小叶结构破坏,门脉周围水肿、充血,炎症细胞浸润明显;依达拉奉组肝损伤明显减轻,小叶结构保存完整,肝细胞变性、坏死轻微,炎症细胞浸润明显减少.结论 依达拉奉能够明显减轻大鼠小体积肝移植物缺血再灌注损伤,其机制可能与增强抗氧化能力、抑制脂质过氧化以及减轻炎症反应密切相关.     

大鼠30%小体积肝移植模型手术技巧

目的 建立稳定、理想的大鼠30%体积肝移植模型.方法 二袖套法和体内切肝法建立非动脉化30%体积肝移植模型,对100只SD大鼠施行50例30%体积肝移植(10例前期操作,不列入统计),对手术操作技巧和细节、术后存活及原因等进行探讨.结果 手术成功率100%(40/40),术后1周、2周存活率均40%(16/40),死亡原因主要为肝功能失代偿、胆管梗阻或胆漏、肝上下腔静脉血栓形成、肝叶坏死和腹腔感染等.结论 30%体积肝移植模型改进后供肝残面出血率低,机械损伤小,供肝再灌注色红均匀,存活率好,可作为小体积肝移植有关实验研究的动物模型.

Abstract：

Objective To establish a reliable and ideal model of 30% size graft liver transplantation in rats. Methods The model of 30% size graft liver transplantation in vivo was established by using male SD rats according to Kamada's two-cuff method. The operative techniques and ditails, and survival rate were explored and analyzed. Results The rate of successful surgery was 100% (40/40). The one- and two-week survival rate both were 40% (16/40), and the causes of deaths included liver function decompensation, bile duct stenosis or bile leakage, thrombosis of super inferior vena cava, liver necrosis and celiac infection.Conclusion Improved model of 30% small-for-size liver transplantation had a low hemorrhage rate of residual liver surface, reduced mechanical damage in small-for-size graft, high success rate and survival rate, and was an ideal animal model on the study of experiments related to the small-for-size liver transplantation.     

两种不同方法的大鼠小体积肝移植模型建立的比较

目的　探索一种大鼠小体积肝移植模型简单有效的建立方法。方法　选取体重相近的SD大鼠作为供受体 ,采用体外和体外两种方法切除部分肝叶以获取小体积供肝 ,按Kamada两套管法做供肝植入。比较两种方法的技术并发症。结果　体外法在术后肝断面出血、渗血 ,肝后下腔静脉狭窄和继发血栓 ,术中因出血引起的低血压休克 ,相近肝叶静脉误扎引起的回流障碍等并发症发生方面较体内法多。两者总的并发症发生率分别为 35 % (6 / 16 )和 5 % (4 / 78) (P <0 0 5 ) ,而两种方法在无肝期 ,冷缺血时间及总的手术时间上无统计学差异。结论　选取体重相近的供受体进行体内切除减体积是大鼠小体积肝移植模型建立的可行有效方法     

缺血预处理对大鼠小体积供肝的保护作用及机制

目的探讨缺血预处理（IPC）对大鼠小体积供肝的保护作用及其机制。方法120只SD大鼠随机分为3组（每组20对）：无热缺血组（NWI）、缺血再灌注组（WI）和缺血预处理组（IPC）。用双袖套法建立大鼠小体积肝移植模型。各组10只受体大鼠于术前1d、术后1、2、3、5d取血，用自动生化分析仪检测AST和ALT。NWI组于供肝灌注前及植入后0．5、1、2、3h，WI组于热缺血前及植入后0．5、1、2、3h，IPC组于IPC前、IPC后及植入后0．5、1、2、3h取肝组织，用硝酸还原法检测其NO浓度。结果IPC可降低大鼠小体积肝移植术后血清AST和ALT浓度，提高再灌注早期肝脏组织NO的浓度，降低再灌注晚期肝脏组织NO的浓度（P〈0．05）。结论NO在大鼠肝脏的缺血再灌注损伤中可能具有双重作用。IPC对大鼠小体积供肝的缺血再灌注损伤有保护作用。其机制可能是通过促进供肝再灌注后早期NO合成，改善肝脏微循环，同时抑制供肝再灌注后晚期NO合成，减轻过量NO的损伤作用，从而保护移植肝脏功能。     

附加门体分流术对小体积移植肝保护作用的实验研究

目的 研究附加门体分流术对小体积移植肝的保护效果.方法 建立巴马小型猪小体积肝移植模型,将15只小型猪平均分为3组:(1)A组,小体积肝移植组(对照组);(2)B组,远端脾肾分流术+小体积肝移植组;(3)C组,肠腔H形分流术+小体积肝移植组.手术后观察动物7 d存活率,动态监测肝功能生化指标、自由门静脉压、门静脉血流量(PBF)以及移植肝组织病理学改变.结果 动物7 d存活率分别为:A组1/5,B组3/5,C组5/5.A组动物移植肝复流后自由门静脉压立即升高,高峰达(28.6±2.07)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),复流1 h后单位肝组织PBF达(3.56±0.1 1)ml·min-1·g-1;移植肝组织病理学改变严重,包括肝细胞气球样变或肝细胞坏死、肝窦淤血、肝实质出血.B、c组中动物肝功能酶学指标有所改善.移植肝复流后自由门静脉压显著低于A组水平(P<0.05),PBF保持相对平稳.移植肝组织病理学病变明显减轻.结论 附加门体分流术可能可以避免小体积移植肝的损伤.     

大鼠小体积肝移植后肝细胞再生的研究

目的 探讨小体积肝移植术后肝再生的情况。方法 建立大鼠30％原位肝移植模型,实验分为肝切除（PH）组、全肝移植（0LT）组和30％小体积肝移植（30％POLT）组,观察1w生存率,并于术后1、2、3、7d检测肝细胞增殖活性、肝功能和肝组织学变化。结果 各组1w生存率均为100％;30％POLT组术后2d达到增殖高峰,峰值与PH组无差异（P〉0．05）;其肝功能酶学指标在术后1、3d明显升高,组织学见肝细胞核分裂极其活跃。结论 冷缺血1h的30％供肝和肝切除后肝脏具有同样的增殖活性,仅增殖高峰稍晚;较短的冷缺血时间以及熟练的手术技术可能对小体积供肝的再生起重要作用。