ZNRD1基因的克隆及其反义核酸对胃癌耐药细胞阿霉素蓄积的影响

为获得ZNRD1基因的编友区序列，构建反义真核表达载体，通过检测ZNRD1基因反义核酸转染对胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR阿霉素（ADM）积蓄能力的影响，评价ZNRD1在抗胃癌细胞多药耐药性方面的应用前景。用PCR方法扩增目的基因序列，PCR产物经DNA序列测定证实后，采用分子克隆技术，将所获目的基因全长cDNA片段按反方向克隆入真核表达载体pcDNA3.1^ 的多克隆位点之间，对重组质粒进行酶切鉴定。用脂质体介导法将ZNRD1反义核酸转染SGC7901／VCR，流式细胞仪（FACS）检测SGC7901／VCR细胞内阿霉素的蓄积量。结果应用PCR反应扩增出特异性片段，经DNA序列,下实与文献报道的ZNRD1基因编码区序列一致；构建了反义真核表达载体pcDNA3.1-ZNRD1；转染SGC7901／VCR细胞后，可提高细胞内ADM蓄积量。ZNRD1反义核酸转染后，胃癌多药耐药细胞株SGC7901／VCR对抗肿瘤药物ADM的积蓄作用提高，提示ZNRD1反义核酸具有提高耐药细胞株细胞内药物浓度、恢复其药物敏感性、逆转多药耐药性的作用。     

载体介导的siRNA对SGC-7901胃癌细胞中hPOT1表达的抑制作用

目的构建人端粒保护蛋白（hPOT1）基因的短链干扰核糖核酸（siRNA）表达载体，观察其在胃癌细胞中抑制hPOT1基因表达的作用，为进一步研究hPOT1在胃癌细胞生长增殖中的作用打下基础。方法设计并化学合成64nt编码hPOT1 siRNA基因片段的寡核苷酸，退火成双链后将其连接到pSUPER质粒的H1 RNA启动子下游，构建psiRNA-hPOT1重组质粒。经酶切、测序鉴定后，用脂质体介导的基因转染方法，转人SGC-7901胃癌细胞，用半定量RT-PCR检测hPOT1表达水平的变化。结果测序结果表明重组质粒psiRNA-hPOT1 64个碱基成功插人到预定位置，并且序列完全一致。hPOT1 siRNA表达载体psiRNA-hPOT1转入胃癌细胞后，可明显抑制SGC-7901细胞hPOT1的表达。结论构建的hPOT1基因的siRNA表达载体psiRNA-hPOT1重组质粒能显著抑制hPOT1基因在SGC-7901胃癌细胞中的表达。     

电压门控钾通道Kv1.5反义核酸对胃癌细胞SGC7901生长的抑制作用

目的构建电压门控钾通道Kv1．5分子的反义核酸(Kv1．5AS)的真核表达载体,建立Kv1．5AS转染的胃癌SGC7901细胞亚系,探讨Kv1．5分子对胃癌细胞生长的抑制作用。方法通过DNA重组技术,将Kv1．5全长eDNA片段从pBKKvl．5载体反向亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1,构建表达Kv1．5反义核酸的重组载体pcDNA3．1-Kv1．5AS。借助脂质体将pcDNA3．1-Kv1．5AS转导入胃癌细胞SGC7901。通过MTT实验绘制细胞生长曲线,肿瘤细胞集落形成实验检测集落形成率,流式细胞仪进行细胞周期分析,并利用Western blot检测Kv1．5和CyclinD1蛋白在基因转染细胞中的表达。结果限制性酶切鉴定结果提示,重组载体peDNA3．1-Kvl．5AS构建成功。Western blot结果表明,转染pcDNA3．1-Kv1．5AS后,Kv1．5蛋白在SGC7901细胞中的表达显著降低。与转染空载体的对照细胞相比,转染Kv1．5AS表达载体后,SGC7901细胞生长变缓,集落形成率显著降低,细胞发生了G1期阻滞。Western blot结果证实,CydinD1蛋白在Kv1．5AS转染细胞中表达降低。结论电压门控钾通道Kv1．5反义核酸可抑制胃癌细胞SGC7901的生长。     

稳定表达人MAGE-1基因的小鼠细胞系的建立与鉴定

目的：克隆人黑素瘤抗原-1（MAGE-1）基因，构建真核表达载体，建立稳定表达人MAGE-1的小鼠细胞株。方法：提取人肝癌细胞的总RNA，RT-PCR法获得人MAGE-1cDNA，将测序正确的MAGE-1基因克隆至真核表达载体pcDNA3中，进行酶切鉴定和序列测定。将重组质粒pcDNA／MAGE和空载体pcDNA3分别转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2／0中，经G418筛选获得稳定表达株，用RT-PCR和Western印迹检测MAGE-1基因的转录及蛋白表达。结果：从肝癌细胞中成功克隆到人MAGE-1基因，经测序证明基因正确，酶切和序列测定表明，人MAGE-1基因的真核表达质粒已成功构建。将此重组质粒转入的SP2／0细胞可稳定表达人MAGE-1基因。结论：成功构建可稳定表达人MAGE-1基因的小鼠转基因细胞，为MAGE-1的免疫治疗研究奠定了基础。     

S100A2全长基因真核表达载体pEGFP-N2-S100A2的构建及其在胃癌细胞系BGC-823中的表达

 目的 克隆S100A2 cDNA,构建pEGFP-N2-S100A2重组表达载体,转染胃癌细胞系BGC-823,为探讨其对胃癌细胞系的影响奠定实验基础.方法 应用RT-PCR 和DNA 重组技术构建pEGFP-N2-S100A2 融合蛋白表达载体,质粒经测序正确后,用脂质体转染BGC-823 细胞.结果 重组质粒经限制性酶切鉴定得到与S100A2全长基因长度一致(294 bp) 的酶切产物; 测序分析证实,重组质粒中含有一与GenBank 上登录的S100A2基因(NM-005978) 序列完全一致的序列,表明成功地完成了表达载体的构建; 荧光显微镜下可见转染的BGC-823 细胞有绿色荧光蛋白的表达.结论 构建完成真核表达载体pEGFP-N2-S100A2,S100A2基因在BGC-823细胞内成功表达.     

登革3型病毒NS1基因重组质粒DNA的构建及其免疫原性观察

目的：构建登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒，观察其免疫原性，为登革新型疫苗的研究提供依据。方法：从感染鼠脑中提取登革3型病毒RNA，经RT－PCR获得NS1基因片段，然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒NDA转入COS7细胞，通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达，将重组质粒DNA免疫BALB／c小鼠，观察其免疫原性。结果：通过酶切鉴定和序列测定证实了NS1基因片段已经插入真核表达载体，用免疫荧光法证明转染了重组质粒的COS7细胞的胞浆中有特异荧光。重组质粒DNA免疫小鼠后可观察到诱发产生的细胞免疫应答。结论：含有登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒可以在COS7细胞中进行表达，而且能够诱导小鼠产生细胞免疫应答。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体，并检测其在COS-7细胞中的表达。方法：将目的基因4-1BBL克隆人pUCl9载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2-EGFP，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-m4-1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞，以RT-PER和观察细胞内荧光的方法检测m4-1BBL的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人4-lBBL全长cDNA编码序列，转染实验表明4-lBBL基因能在COS-7细胞中表达。结论：鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究奠定了基础。     

血管内皮生长因子C正、反义真核表达载体的构建及鉴定

目的克隆血管内皮生长因子C（VEGF-C）基因,构建VEGF-C正、反义真核表达载体,鉴定并分析其基因序列。方法从处于对数生长期的人SGC-7901细胞中提取组织总RNA,用RT-PCR方法扩增出VEGF-C基因的正、反义全长cDNA。利用大肠杆菌转化并制备质粒pCI-neo和pcDNA3。分别用XbaI＋EcoRⅠ及HindⅢ＋EcoRⅠ双酶切两组质粒和VEGF-C cDNA,并将正、反义VEGF-C cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3和pCI-neo中。酶切鉴定、质粒双向测序鉴定重组基因。结果扩增出VEGF-C基因全长cDNA,大小约1.3kb。克隆出正、反义重组质粒为pcDNA3-sense VEGF-C,pCI-neo-antisense VEGF-C,电泳结果显示条带大小约6.8kb。碱基测序证实重组质粒中导入的DNA片段碱基序列与预期的设计路线相符且两片段互补、方向相反。结论正确克隆VEGF-C基因,成功构建了VEGF-C正、反义真核表达载体,为下一步研究反义VEGF-C转染VEGF-C基因高表达的肿瘤细胞后对其体外生长的影响创造了条件,也为进一步研究VEGF-C在胃癌新生淋巴管的形成和转移中的作用奠定了基础。     

小鼠膜联蛋白A1真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建小鼠膜联蛋白A1(annexin-A1,ANXA1)真核表达载体,并检测其在NIH3T3细胞中的表达和定位.方法 采用PCR法从小鼠肝cDNA文库扩增ANXA1基因编码序列,并将其克隆至带有血凝素(HA)标记的真核表达载体pcDNA3-HA上,经PCR、酶切和测序鉴定后,将重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1瞬时转染NIH3T3细胞,采用细胞免疫荧光法检测目的 基因表达情况.结果 菌液PCR、双酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1构建正确,并可在NIH3T3细胞的胞质、胞核和胞膜中广泛表达.结论 成功构建了pcDNA3-HA-ANXA1真核表达载体,该载体中的HA-ANXA1融合基因能在哺乳动物中有效表达并正确定位,为下一步深入研究ANXAl相关的信号通路奠定了基础.     

硫氧化还原蛋白对胃癌细胞化疗敏感性的调节作用

目的 探讨硫氧化还原蛋白(Trx)对胃癌细胞化疗敏感性的调节作用。方法 通过RT-PCR从人胃癌耐药细胞系SGC7901／VCR细胞中克隆Trx全长cDNA,构建Trx正反义真核表达载体,并借助脂质体将正义载体转入胃癌细胞SGC7901、反义载体转入胃癌耐药细胞SGC7901／VCR,利用MTT试验在体外检测基因转染细胞及其对照细胞对化疗药物的敏感性。结果 转染Trx正义载体后,SGC7901细胞对长春新碱、顺铂、阿霉素的敏感性显著降低;转染Trx反义载体后,SGC7901／VCR细胞对长春新碱、顺铂、阿霉素的敏感性显著升高。结论 Trx可能参与了胃癌细胞多药耐药性的形成,改变Trx的表达水平可以调节胃癌细胞的化疗敏感性。     

MG_7Ag在胃癌细胞系SGC7901及其耐药亚系中的表达及功能

探讨MG_7Ag在胃癌药敏细胞系SGC 790 1及其耐药亚系SGC 790 1/VCR 0 3、SGC 790 1/VCR 0 7、SGC 790 1/VCR 1 0中的表达及功能。采用免疫细胞化学方法及流式细胞仪观察MG7Ag在胃癌药敏细胞及其耐药细胞系的表达 ;用MTT法检测单克隆抗体MG7对药物敏感性的影响 ;以阿霉素作为荧光标记用流式细胞仪观察MG7对细胞内药物浓度的影响。结果表明 ,MG7Ag在耐药细胞系的表达较药敏细胞明显增加 ,且随耐药指数的增加呈逐渐增加的趋势 ;胃癌药敏细胞及其耐药细胞与MG7共同孵育后 ,对长春新碱的药物敏感性减低 ;MG7与耐药细胞共同孵育后 ,细胞内阿霉素的浓度减低。MG7Ag可能作为一个新的与胃癌耐药相关的分子 ,在维持胃癌耐药细胞系SGC 790 1/VCR的耐药表型中起重要作用     

MGr1-Ag表达上调及下调的胃癌细胞株的建立及鉴定

为研究胃癌细胞耐药相关新基因MGr1 Ag对胃癌耐药细胞多药耐药性的调节作用及其机制。克隆MGr1 Ag的全长cDNA并构建其正反义真核表达载体 ,以脂质体介导法将正、反义真核表达载体分别转染入人胃癌细胞系MGC80 3与人胃癌多药耐药细胞系SGC790 1/VCR中。结果显示 ,经RT PCR扩增出大小约为 1.0kb的基因片段 ,成功克隆入pUCm T载体 ,经DNA测序证实为MGr1 Ag基因。将其克隆入pCDNA3 .1/V5 His后 ,经限制性核酸内切酶酶切鉴定 ,获得携有MGr1 Ag基因真核表达载体pCD NA3 1/V5 His MGr1 Ag及其反义表达载体pCDNA3 .1/V5 His anMGr1 Ag。以脂质体介导法将MGr1 Ag的正、反义真核表达载体分别转染入MGC80 3与SGC790 1/VCR中 ,经Westernblot证实 ,成功建立了MGr1 Ag表达上调及下调的胃癌细胞株 ,为研究MGr1 Ag参与耐药的分子机制奠定了基础     

端粒植入对胃癌SGC-7901细胞生物学行为的影响

目的研究外源端粒片段植入对胃癌细胞生物学行为的影响，初步探讨端粒影响细胞生物学活性的作用机制。方法大规模制备含有端粒片段的质粒pSXneo-1．6-T2AG3，采用LipofectAMIN^TM2000介导的转染方式，将质粒转染胃癌细胞SGC-7901，检测细胞周期、细胞形态、细胞生长曲线和细胞周期相关基因表达的改变。结果端粒片段能够成功导入SGC-7901细胞，获得稳定的细胞株。端粒片段植入后细胞生长变慢，异型性减少，S期细胞减少，G0／G1和G2M期细胞比例增加，增殖指数减小，P21mRNA表达明显高于SGC-7901细胞（P〈0．05），caspase-3 mRNA在各组细胞的表达无显著差异（P〉0．05）。结论携带了1600bp端粒TTAGGG重复序列的真核表达载体pSXneo-1．6-T2AG3能够稳定转染至人胃癌SGC-7901细胞中，使细胞增殖减慢，P21 mRNA表达上调，但对caspase-3 mRNA表达无明显影响。     

p38信号途径与胃癌细胞职霉素耐药相关

研究p38MAPK信号转导途径在胃癌耐药机制中的意义。用免疫共沉淀法及Wwstern boltting实验分另研究阿霉素处理胃癌细胞SGC7901及癌细胞SGC7901／VCR细胞后,p38激酶活性及量的变化。结果显示,阿霉素处理胃癌多药耐药SGC7901／VCR细胞15min后,p38MAPK活性增强,呈时间依赖性,而p38MAPK量无明显变化,提示肿化疗药物阿霉素可诱导肿瘤耐药细胞p38激酶活性降低,且可诱导非耐药细胞p38激酶活性增强。     

外源性p27KIP1基因抑制SGC7901细胞的增殖

研究p27^KIP1基因对胃癌细胞的细胞周期及细胞增殖的影响。采用脂质体转染法将p27^KIP1全长cDNA转入胃癌细胞系SGC7901中，通过免疫屯迹分析以及RNA斑点杂交方法检测p27^KIP1基因在蛋白质和mRNA水平的表达，细胞活力实验及软琼脂集落形成实验显示转染p27^KIP1基因对细胞增殖的作用；流式细胞仪观察目的的基因对该细胞的细胞周期的影响。结果显示，转染p27^KIP1的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均有高水平p27^KIP1的表达；细胞活力检测显示在外加Zn离子48h后细胞生长被抑制42％；转染p27^KIP1的SGC7901细胞的集落形成率较对照组明显减少（P＜0．01）；p27^KIP1的过表达能够显著地增加G1期的细胞数，由33．68％增加到69．29％（P＜0．01）。研究表明，p27^KIP1基因可抑制SGC7901细胞由G1期向S期过渡，从而抑制细胞增殖。     

大蒜素对人胃腺癌SGC-7901细胞株端粒酶活性和细胞凋亡的影响

为观察大蒜素对胃腺癌SGC 790 1细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响。采用不同浓度的大蒜素处理SGC 790 1细胞后 ,用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的改变 ;用TRAP PCR ELISA法检测端粒酶活性的变化。结果显示 ,大蒜素能够改变细胞周期的分布 ,增加G2 /M期细胞比例 ;呈剂量依赖性诱导其凋亡 ;大蒜素对端粒酶活性的抑制作用也有时间和剂量依赖性。提示大蒜素能够抑制端粒酶的活性 ,促进细胞凋亡     

胃癌细胞中Rab25相互作用蛋白的鉴定及功能学研究

目的 通过串联亲和纯化联合质谱技术(TAP-MS)筛选胃癌细胞中Rab25相互作用蛋白.方法 利用慢病毒转染技术构建稳定表达StrepⅡ-6His-EGFP-Rab25融合蛋白的SGC7901细胞系;通过StrepⅡ-6His标签进行串联亲和纯化获得与Rab25相互作用的蛋白复合物,并通过质谱检测蛋白复合物的组成;随后构建了Rab25蛋白质相互作用网络,并通过免疫共沉淀技术验证其在胃癌细胞中相互作用的真实性.结果 通过TAP-MS技术共鉴定出26个Rab25的相互作用蛋白,主要参与癌症通路、微管运动、细胞凋亡、NOTCH通路等过程;运用免疫共沉淀方法验证了Itgb1与Rab25相互作用的真实性,并通过Transwell试验证实Rab25和Itgb1协同促进SGC7901细胞的侵袭.结论 通过鉴定胃癌细胞中Rab25的相互作用蛋白网络,为胃癌的治疗提供一个新的线索.