自噬在ALA-PDT诱导C6胶质瘤细胞死亡中的作用机制

目的 探讨自噬在光敏剂5-氨基乙酰丙酸(aminolaevulinic acid,ALA)介导的光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)C6胶质瘤细胞死亡中作用机制.方法 ALA-PDT处理后不同时间,用自噬特异染料MDC和免疫荧光法观察自噬水平变化,Western blotting检测自噬相关蛋白cathepsin B的表达水平.结果 MDC染色和免疫荧光观察可见ALA-PDT后C6胶质瘤细胞内有大量含点状荧光颗粒的自噬泡和自噬体标志物LC3绿色荧光蛋白,Western-blot示自噬相关蛋白cathepsin B表达水平明显升高,其白噬水平随AIA-PDT后时间而逐渐增强.结论 ALA-PDT可诱导C6胶质瘤细胞发生自噬,其诱导胶质瘤细胞发生自噬的机制可能与溶酶体酶cathepsin B大量释放有关.     

抑制自噬晚期阶段增强榭皮素诱导的胶质瘤细胞凋亡

目的研究抑制自噬不同阶段对榭皮素作用于胶质瘤细胞的影响,并对其机制进行初步探讨。方法通过3-甲基腺嘌呤(3-MA)及转染Beclin 1 shRNA质粒抑制自噬早期阶段,通过氯喹(CQ)抑制自噬晚期阶段。噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞活性。通过透射电镜及Western Blot检测自噬水平。通过流式细胞技术及Western Blot检测细胞凋亡。结果榭皮素可以诱导胶质瘤细胞凋亡及自噬的发生。抑制自噬的早期阶段会减弱榭皮素对胶质瘤细胞的毒性作用,抑制自噬的晚期阶段可以增强榭皮素诱导的胶质瘤细胞凋亡。结论氯喹与榭皮素联合用药具有协同作用,可能对胶质瘤的治疗提供新的思路。     

组胺诱导胶质瘤原代培养细胞凋亡的实验研究

目的观察组胺诱导人脑胶质瘤原代培养细胞凋亡的作用，探讨组胺诱导人脑胶质瘤原代培养细胞凋亡与钙离子内流之间的关系。方法取手术中获得的新鲜脑胶质瘤组织，加入含10％小牛血清的1640培养液中培养；取生长良好的细胞分别加入含0．01mg／ml，0．05mg／ml和0．1mg／ml不同浓度组胺的培养液，进行细胞的原代培养。激光共聚焦显微镜检测细胞膜内游离钙离子浓度；流式细胞仪检测不同浓度组胺作用下细胞的凋亡率。结果加入含0.05mg／ml和0.1mg／ml组胺培养液的人脑胶质瘤原代培养细胞内游离钙离子浓度明显升高，诱导细胞凋亡，细胞凋亡的发生在一定范围内与加入的组胺呈剂量、时间依赖关系。结论组胺通过增加人脑胶质瘤原代培养细胞内游离钙离子浓度诱导细胞凋亡的发生。     

光动力疗法对C6胶质瘤细胞转化生长因子-B的影响

目的探讨C6胶质瘤细胞中转化生长因子-B（TGF—B）和光动力疗法（PDT）之间的关系,阐明PDT对C6胶质瘤的治疗效果的机制。方法以C6胶质瘤细胞系为对照组,实验组添加25nM血啉甲醚（HMME）,再用240J／cm2PDT照射,依据光照时间公式中光源输出的光斑面积,计算出照射时间,利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测PDT处理前后,C6细胞上清液中的TGF—B的表达;提取HMME—PDT实验组细胞上清液为条件培养基,对照组细胞上清液为非条件培养基,培养人血管内皮细胞（HUVEC）,使用MTT法观察HuVEC的增殖情况;建立Wistar大鼠脑胶质瘤模型,以HMME联合PDT疗法为HMME—PDT组,生理盐水治疗为非治疗组,免疫组化法观察胶质瘤血瘤屏障中CD31的表达。结果与未处理组c6比较,经HMME—PDT处理的C6细胞上清液TGF-B含量明显降低（P〈0．01）;经HMME—PDT处理的c6细胞条件培养基可以抑制HuVEC的增殖,与非条件培养基组比较,差异有统计学意义（P〈0．01）;与非治疗组比较,HMME—PDT组的大鼠脑胶质瘤血瘤屏障CD31表达明显降低（P〈0．01）。结论HMME联合PDT降低c6细胞旁分泌TGF—B,明显抑制胶质瘤血瘤屏障血管生成,为PDT从抑制胶质瘤细胞旁分泌角度,抑制胶质瘤血管新生奠定基础,具有重要的临床应用前景。     

PDGF-B链基因三链形成寡核苷酸对C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的观察PDGF—B链基因三链形成寡核苷酸(triplex—forming oligonucleotide，TFO)对C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法应用流式细胞技术观察TFO对C6胶质瘤细胞PDGF—B、PCNA表达的影响，应用流式细胞技术观察TFO对C6胶质瘤细胞凋亡的影响。结果TFO对C6胶质瘤细胞PDGF—B、PCNA的表达有明显抑制作用，而且抑制作用存在浓度依赖性。TFO有明显诱导C6胶质瘤细胞细胞凋亡作用，而且诱导作用存在浓度依赖性。结论TFO抑制C6胶质瘤细胞细胞增殖，同时诱导C6胶质瘤细胞细胞凋亡。     

丙戊酸诱导胶质瘤细胞自噬及其机制研究

目的对丙戊酸诱导胶质瘤细胞发生自噬性死亡的过程进行观察,并初步探讨其可能的机制。方法丙戊酸处理人脑胶质瘤细胞系U87、T98G和SF295,台盼蓝染色检测细胞活性并计算细胞存活率;流式细胞仪测定细胞周期,透射电子显微镜和荧光测定仪观察细胞超微结构及自噬水平,West-ern blotting检测经丙戊酸处理后细胞内LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt和p-p70S6K等蛋白质的表达水平。结果经不同浓度丙戊酸处理后,人脑胶质瘤细胞系U87、T98G和SF295细胞活性明显受到抑制,其胶质瘤细胞半数抑制浓度分别为(2.45±0.32)、(4.78±0.62)和(6.62±0.95)mmol/L,其中丙戊酸对人脑胶质瘤细胞系U87具有较明显的杀伤作用(P<0.05)。透射电子显微镜观察可见人脑胶质瘤细胞系U87细胞胞质内有大量自噬体和自噬溶酶体,其自噬水平随丙戊酸浓度的升高而逐渐增强。经丙戊酸处理后,人脑胶质瘤细胞系U87细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平明显升高,而p-Akt和p-p70S6K表达水平明显降低。结论丙戊酸可诱导胶质瘤细胞发生自噬,其诱导胶质瘤细胞发生自噬的机制可能与阻断Akt信号转导通路有关。     

环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨选择性环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对体外培养的C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法以不同浓度塞来昔布分别作用于C6胶质瘤细胞不同时间段,采用甲基噻唑蓝比色法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,并用光镜及透射电镜观察细胞形态学和超微结构的变化。结果经不同浓度塞来昔布作用后,C6胶质瘤细胞活性受到抑制,且呈剂量时间依赖性,实验组与对照组之间以及实验组各亚组之间均有显著性差异（P〈0.05）。细胞周期检测发现实验组S期细胞减少,G2期细胞显著增加,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）;同时,塞来昔布还可诱导C6胶质瘤细胞凋亡,凋亡率在实验组与对照组之间有显著性差异（P〈0.05）。结论选择性环氧化酶-2抑制剂塞来昔布可抑制C6胶质瘤细胞增殖,诱导C6胶质瘤细胞凋亡。     

2-甲氧基雌二醇对C6脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的作用

目的 探讨2-甲氧基雌二醇对C6脑胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法 以不同浓度的2-甲氧基雌二醇分别作用C6胶质瘤细胞不同时间,采用甲基噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,并用光镜及电镜观察细胞形态学变化。结果 经2-甲氧基雌二醇作用后,C6胶质瘤细胞活性受抑制,且呈时间依赖性,作用组与对照组之间的差异具有统计学意义（P〈0.05）。此外,2-甲氧基雌二醇还可诱导C6胶质瘤细胞凋亡,凋亡率在作用组与对照组之间存在显著差异（P〈0.05）;细胞周期检测发现作用组G1及S期细胞减少,G2期细胞增多,与对照组存在显著差异（P〈0.05）。结论 2-甲氧基雌二醇可抑制C6胶质瘤细胞生长,诱导C6胶质瘤细胞凋亡。     

ATRA诱导胶质瘤C6细胞凋亡过程中Bcl-2和Caspase-3表达的研究

目的研究全反式维甲酸（ATRA）诱导胶质瘤C6细胞凋亡过程中Caspase-3和Bcl-2表达情况,探讨ATRA诱导胶质瘤C6细胞凋亡的机制。方法用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法绘制ATRA不同浓度不同时间（6、12、24、48、72h）对胶质瘤C6细胞作用后细胞生长曲线,逆转录酶-多聚酶链反应（RT—PCR）检测凋亡相关基因Bcl-2和Caspase-3 mRNA水平的表达变化影响,Western blot分析Caspased和Bcl-2在胶质瘤C6细胞中的表达情况。结果胶质瘤C6细胞经ATRA诱导后,细胞的增殖明显受到抑制,通过RT-PCR结果证实Bcl-2 mRNA在ATRA作用下明显呈低表达而Caspase-3 mRNA的表达随时间延长逐渐增高,Western blot检测结果显示ATRA作用后,下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达并激活了凋亡蛋白Caspase-3的表达。结论ATRA对胶质瘤C6细胞的增殖具有抑制作用。     

染料木黄酮对C6胶质瘤细胞抑制作用的实验研究

目的通过观察染料木黄酮（genistein）抑制并诱导C6胶质瘤细胞凋亡的作用,探讨其对于胶质瘤治疗的可行性。方法采用MTT法、Hoechst33258荧光染色、流式细胞术和透射电镜方法,观察染料木黄酮抑制并诱导C6细胞凋亡作用。结果MTT法测得染料木黄酮对C6胶质瘤细胞的IC50值为18μg/ml,浓度为5～70μg/ml的染料木黄酮具有抑制C6胶质瘤细胞作用,且细胞抑制作用随药物浓度增加和作用时间延长而增加;流式细胞术、荧光染色以及电镜证实诱导凋亡及死亡是染料木黄酮抑制C6胶质瘤细胞的主要方式。结论异黄酮类化合物染料木黄酮具有诱导C6细胞凋亡和死亡的作用。提示染料木黄酮可以直接通过诱导C6胶质瘤细胞凋亡和死亡而发挥抗肿瘤作用。     

人参皂甙Rh2对人胶质瘤细胞U87MG凋亡的影响

目的 观察人参皂甙Rh2对胶质瘤细胞凋亡的影响并初步探讨其可能机制。方法 将培养的人胶质瘤细胞U87MG随机分为人参皂甙Rh2组、人参皂甙Rh2+尼莫地平组和对照组。人参皂甙Rh2组在常规培养细胞时加入20 μg/ml的人参皂甙Rh2，人参皂甙Rh2+尼莫地平组在人参皂甙Rh2组培养细胞时加入浓度为10 μmol/L的尼莫地平。利用流式细胞仪检测U87MG细胞凋亡，利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测U87MG细胞内钙离子浓度。结果 与对照组相比，人参皂甙Rh2促进U87MG细胞凋亡（P<0.05），且增加细胞内游离钙离子浓度（P<0.05）；尼莫地平显著减少人参皂甙Rh2引起的U87MG细胞凋亡（P<0.05）。结论 人参皂甙Rh2可以通过增加细胞内游离钙离子浓度促进U87MG细胞凋亡。     

内抑制素对人脑胶质瘤细胞增殖的实验研究

目的观察内抑制素对人脑胶质瘤细胞增殖的影响。方法①细胞培养：体外培养人脑胶质瘤细胞并进行光镜观察；②抑制因子试验：设立对照组与内抑制素实验组，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法来判定该抑制因子对人脑胶质瘤细胞有无抑制作用；③细胞内游离Ca2＋浓度测定：将特异性ca2＋荧光指示剂-Fluo-3用来负载人脑胶质瘤细胞，应用激光共聚焦显微镜检测细胞内游离钙的浓度。结果对照组光密度（OD）值明显高于各实验组（P〈0．05）；内抑制素能明显增加细胞内游离Ca2＋的浓度，并且随药物浓度的增加而增加。结论内抑制素能够抑制人脑胶质瘤细胞的增殖且呈剂量依赖性，同时也能够增加胶质瘤细胞内游离ca2＋的浓度。     

新生期反复惊厥对海马Beclin-1急性期表达的影响及干预

目的 研究新生期大鼠反复惊厥后海马中Beclin-1急性期的表达及3-甲基腺嘌呤(3-MA)的干预作用.方法 生后6d的SD大鼠108只按照随机数字表法分成3组,每组36只,惊厥组每日吸入三氟乙醚诱导惊厥发作5次,每次间隔30 min,连续9 d;对照组同样操作但不吸入三氟乙醚;3-MA组惊厥前腹腔注射3-MA(总量2μL),然后以同样方法吸入三氟乙醚诱导惊厥,方法同惊厥组.3组大鼠于最后一次惊厥后1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h断头取腩,每组每个时间点分别为6只大鼠.采用Western blot分别检测3组大鼠大脑海马中Beclin-1的表达.结果 与对照组同一时间点相比,惊厥组海马组织中Beclin-1的表达明显增多,差异均有统计学意义(P<0.05).与惊厥组同一时间点相比,3-MA组Beclin-1的表达明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 惊厥后自噬途径被激活,3-MA参与了自噬途径的涮控.     

重组腺病毒介导的p27Kip1基因治疗大鼠神经胶质瘤的实验研究

目的研究腺病毒介导的人p27Kip1基因(Ad-p27Kip1)对大鼠神经胶质瘤生长的抑制作用。方法建立大鼠胶质瘤模型,随机分成3组:Ad-p27Kip1组、Ad-LacZ和对照组,分别给予Ad-p27Kip1、Lacz重组复制缺陷性腺病毒(Ad-LacZ)和PBS瘤内注射,观察对肿瘤生长的抑制情况,并用免疫荧光法检测p27和细胞周期素(cyclinD1)的表达;原位末端标记法检测细胞凋亡情况。结果Ad-p27Kip1组肿瘤生长受到明显抑制(P<0.05),免疫荧光染色显示移植瘤p27表达明显增强(P<0.05),cyclinD1的表达受到明显抑制(P<0.05),且细胞凋亡显著多于Ad-LacZ组和对照组(P<0.05)。结论Ad-p27Kip1对大鼠胶质瘤的生长具有明显的抑制作用,其机制可能是增强p27表达、抑制cyclinD1表达。p27Kip1有望成为胶质瘤基因治疗的新策略。     

苦参碱联合替莫唑胺对大鼠脑胶质瘤MMP2、MMP9、VEGF表达的影响

目的探讨苦参碱联合替莫唑胺对大鼠脑胶质瘤基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法建立大鼠C6脑胶质瘤模型,采用MRI扫描、HE染色、免疫组织化学确定模型建立成功。将C6脑胶质瘤模型大鼠随机分成4组,每组各20只:(1)对照组,腹腔注射生理盐水(100 ml/kg);(2)苦参碱组,腹腔注射苦参碱(20 mg/kg);(3)替莫唑胺组,腹腔注射替莫唑胺(25 mg/kg);(4)联合组,腹腔注射苦参碱(20 mg/kg)和替莫唑胺(25 mg/kg);每天给药1次,连续14 d。药物治疗后14 d处死大鼠,取胶质瘤组织,采用免疫印迹法和实时荧光定量PCR检测MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白和m RNA表达情况。结果大鼠注射胶质瘤C6细胞后7 d,MRI扫描可见脑胶质瘤的存在,HE染色发现组织表现出神经胶质瘤的侵袭性生长和细胞核分解,免疫组织化学结果显示也证明大鼠存在脑胶质瘤。与对照组相比,苦参碱组、替莫唑胺组与联合组MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白和m RNA表达水平均显著降低(P0.05);联合组MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白和m RNA表达水平均显著低于苦参碱组和替莫唑胺组(P0.05),而苦参碱组MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白和m RNA表达水平均显著低于替莫唑胺组(P0.05)。结论苦参碱和替莫唑胺均可显著降低大鼠脑胶质瘤MMP-2、MMP-9、VEGF表达水平,而且,二者联用作用更强。     

VEGF165反义RNA抑制C6胶质瘤大鼠体内生长的实验研究

目的针对VEGF及其受体的抗血管生成治疗，已成为恶性胶质瘤治疗研究的新方向，为临床应用VEGF165反义RNA治疗胶质瘤提供实验室证据。方法本研究在建立大鼠C6胶质瘤模型基础上，利用脂质体法将pcDNA3-AVEGF165质粒导入C6胶质瘤细胞，以G418筛选阳性克隆。将阳性克隆及对照C6细胞定向移植人大鼠右脑尾状核，比较大鼠生存时间、肿瘤生长速率的变化，评判VEGF165反义RNA对脑胶质瘤生长的抑制作用。结果①成功将pcDNA3-AVEGF165质粒导入C6胶质瘤细胞，并筛选出阳性克隆株；②对照组和实验组C6细胞周期特征无明显变化；③VEGF165反义RNA对荷瘤大鼠有延长生存时间，延缓肿瘤生长速度的作用。结论VEGF165反义RNA对大鼠C6胶质瘤生长有明显抑制作用。     

苯乙酸对胶质瘤C6细胞凋亡和细胞内游离Ca2+浓度的影响

目的观察苯乙酸(PA)对胶质瘤C6细胞凋亡和细胞内游离Ca2 浓度的影响,探讨其作用机制。方法体外培养胶质瘤C6细胞,PA诱导分化后,用透射电镜和Annexin V/PI标记流式细胞仪检测细胞凋亡,Fluo-3/AM探针激光共聚焦显微镜检测细胞内游离Ca2 浓度的变化。结果电镜观察到凋亡细胞,PA对C6细胞早期凋亡率无影响,主要增加晚期凋亡率,随PA浓度的增加而增加。PA能明显增加细胞内游离Ca2 浓度,并且随药物浓度的增加而增加。结论PA能诱导C6细胞凋亡,呈剂量依赖性,PA诱导C6细胞凋亡的机制可能与增加细胞内游离Ca2 浓度有关。     

Lithium promotes recovery of neurological function after spinal cord injury by inducing autophagy

Lithium promotes autophagy and has a neuroprotective effect on spinal cord injury(SCI); however, the underlying mechanisms remain unclear. Therefore, in this study, we investigated the effects of lithium and the autophagy inhibitor 3-methyladenine(3-MA) in a rat model of SCI. The rats were randomly assigned to the SCI, lithium, 3-MA and sham groups. In the 3-MA group, rats were intraperitoneally injected with 3-MA(3 mg/kg) 2 hours before SCI. In the lithium and 3-MA groups, rats were intraperitoneally injected with lithium(LiCl; 30 mg/kg) 6 hours after SCI and thereafter once daily until sacrifice. At 2, 3 and 4 weeks after SCI, neurological function and diffusion tensor imaging indicators were remarkably improved in the lithium group compared with the SCI and 3-MA groups. The Basso, Beattie and Bresnahan locomotor rating scale score and fractional anisotropy values were increased, and the apparent diffusion coefficient value was decreased. Immunohistochemical staining showed that immunoreactivities for Beclin-1 and light-chain 3 B peaked 1 day after SCI in the lithium and SCI groups. Immunoreactivities for Beclin-1 and light-chain 3 B were weaker in the 3-MA group than in the SCI group, indicating that 3-MA inhibits lithium-induced autophagy. Furthermore, NeuN+ neurons were more numerous in the lithium group than in the SCI and 3-MA groups, with the fewest in the latter. Our findings show that lithium reduces neuronal damage after acute SCI and promotes neurological recovery by inducing autophagy. The neuroprotective mechanism of action may not be entirely dependent on the enhancement of autophagy, and furthermore, 3-MA might not completely inhibit all autophagy pathways.     

Calcium dependence of serotonin-evoked conductance in C6 glioma cells.

Whole-cell membrane currents and imaging of intracellular calcium concentrations ([Ca2+]i) were used to investigate the role of calcium in a response to serotonin of C6 glioma cells. Activation of a high-affinity serotonin receptor induced a transient rise in calcium concentration in these cells and activated a predominantly potassium conductance, with a small chloride component. Perfusion of the cytoplasm with an internal solution containing high calcium concentration induced similar but prolonged increase of membrane conductance. The responsiveness of C6 cells to serotonin was negatively correlated with the concentration of the unbound calcium chelator BAPTA when BAPTA-buffered calcium-containing intracellular solutions were used. Responses to serotonin persisted in the absence of external calcium, decreased gradually, and then recovered partially after replenishment of extracellular calcium. These findings substantiate the direct role of intracellular calcium in mediating the serotonin response, and indicate that serotonin-induced release of calcium from intracellular stores is sufficient for the activation of conductance in the C6 glioma cell line.