Accutase和胰蛋白酶消化传代对人胚纹状体来源神经干细胞凋亡的影响

目的探讨Accutase和胰蛋白酶消化神经干细胞(NSCs)后对其凋亡过程的影响。方法来自人类12~16周自然流产胚胎纹状体组织,分离并体外培养NSCs,将体外培养的第3~5代神经球,分别用胰蛋白酶、Accutase消化,消化过程中仅振荡打散,避免巴斯德吸管反复吹打。将神经球打散成的单细胞悬液接种。用Annexin V/碘化丙啶染色、Hoechst 33342活细胞染色镜下观察等方法,在培养传代后2和24 h时间点检测神经干细胞凋亡率。结果两种酶消化后立即用台盼蓝染色判断细胞活性,Accutase消化后活细胞比例为(91.65±4.43)%,胰蛋白酶仅有(83.10±6.76)%,二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。体外培养的第3~5代人胚纹状体NSCs形成的神经球传代后2 h,Accutase和胰蛋白酶传代的细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.01),而到24 h时间点,Accutase消化的细胞凋亡率经Annexin V/碘化丙啶、Hoechst 33342活细胞染色两种方法检测已经达到50%,而胰蛋白酶消化后的细胞凋亡率在此时间点维持在15%~20%。Accutase消化后的NSCs生长4 d后,克隆形成率和神经球直径分别为(7.83±1.32)%和(43.5±9.76)μm,均显著低于胰蛋白酶传代组的(19.22±3.66)%和(58.4±18.73)μm(P<0.01)。结论虽然台盼蓝染色显示Accutase消化神经球后的细胞存活比胰蛋白酶更多,但消化后24 h内,Accutase消化的细胞凋亡率显著升高,最终神经球新克隆形成率低,直径更小。胰蛋白酶消化振荡打散神经球后的凋亡率较Accutase具有明显优势;神经球消化后台盼蓝即时染色的结果不足以预示后期NSCs凋亡率。     

神经干单细胞获得的一种方法

目的寻找一种有效获得神经干细胞单细胞的方法。方法运用胰蛋白酶，EDTA和不同浓度酵素对人胚神经干细胞球进行消化，免疫细胞化学染色鉴定及其分化。结果运用一定浓度的酵素可以获得大量成活的单个神经干细胞。而运用胰蛋白酶，EDTA消化后成活细胞少。结论运用一定浓度的diapase消化神经干细胞球是可获得大量成活的神经干细胞单个细胞的方法。     

酵素-Ⅱ分离人神经干细胞球

目的：寻找一种有效分离神经干细胞球并获得大量单个神经干细胞的方法。方法：取20周胎龄人胚胎脑组织分离单细胞,应用DMEM／F12培养基培养形成神经干细胞球,取神经干细胞球,分别以2．50g／L、1．25g／L胰蛋白酶及0．6u／ml、1．2u／ml、1．8u／ml、2．4u／ml酵素-Ⅱ(DispaseⅡ)消化,观察消化过程及细胞形态,对消化后的单个细胞进行培养,观察细胞生长情况,并进行免疫细胞化学染色鉴定。结果：各浓度DispaseⅡ均能较完全地消化神经干细胞球,其中1．2u／ml、1．8u／ml DispaseⅡ消化后的细胞生长状况最佳。胰蛋白酶消化后细胞有较大的损伤,成活细胞少。消化后的细胞Nestin抗体染色结果( ),证实为神经干细胞。结论：一定浓度的DispaseⅡ消化神经干细胞球后,可获得大量成活单个神经干细胞。     

大鼠脊髓神经干细胞的体外培养及鉴定

目的:体外培养大鼠胚胎脊髓神经干细胞,观察其生长、增殖和分化特点.方法:利用倒置显微镜、MTT法、免疫细胞化学等方法检测神经干细胞的增殖、分化情况.结果:分离的脊髓神经干细胞呵形成大量悬浮的神经球,并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈nestin阳性.在添加10%胎生血清7 d后,神经球细胞可分化为有神经元、星形胶质细胞特异性抗原表达的细胞.结论:体外培养大鼠胚胎脊髓可得到大量神经干细胞,并能分化为神经元和星形胶质细胞.     

一种新的将神经球分散为单细胞悬液的方法

目的比较3种将神经球打散成单细胞悬液的方法对神经干细胞活性的影响。方法将16~20周人胚胎神经干细胞体外培养扩增形成神经球,分别用胰蛋白酶消化法、巴斯德管吹打法和消化振荡法,将神经球打散成单细胞悬液,通过台盼蓝染色测定细胞活性及接种后增生情况,观察3种方法对神经干细胞活性的影响。结果消化振荡法打散神经球,细胞存活率(96.20%)和再次成球率(19.24%)都较其他2种方法高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论消化振荡法对人胚胎神经干细胞的活性影响较小,是一种有效、安全的将神经球打散成单细胞悬液的实验方法。     

大鼠肠神经干细胞分离和体外培养的初步研究

目的:探索和建立大鼠肠神经干细胞分离与体外培养的方法.方法:取胎龄20 d的SD大鼠肠道,剥取含有肌间神经丛的外纵肌,并以胶原酶消化,获得单细胞悬液;接种单细胞悬液到改良的肠神经干细胞培养液,置于37℃、5%CO2培养箱内常规培养,待神经球出现后进行免疫学鉴定,并观察培养细胞的部分生物学特性.结果:培养第2天有细胞集落形成,第10天左右出现肠神经球;免疫细胞化学染色显示Nestin阳性,已分化的肠神经球免疫双染示TUJ-1、GFAP阳性.结论:初步建立了肠神经干细胞分离与体外培养方法,为下一步肠神经干细胞的移植应用奠定基础.     

大鼠脊髓来源神经干细胞NgR的表达

目的：检测大鼠脊髓来源神经干细胞Nogo-66受体（NgR）是否表达。方法：悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞，形成神经球后，以免疫荧光法鉴定神经干细胞并检测NgR的表达情况。结果：神经球及单个神经干细胞均显著表达NgR。结论：NgR在脊髓神经发育的干细胞阶段即开始表达。     

体外培养神经干细胞球的离散:一种安全有效的方法

目的:探讨一种安全有效地对体外培养神经干细胞球进行离散的方法.方法:采用常规胰蛋白酶消化、单纯巴斯德吸管吹打、滤网研磨、控制神经球体积的胰酶短时消化4种方法,比较其各自的离散效果和离散后细胞存活情况.结果:胰酶消化较长时间虽然可以得到单细胞但是细胞难以存活,单纯巴斯德吸管吹打不能完全离散神经球,不锈钢滤网研磨细胞损伤大,存活率低下,而采用控制神经球体积结合胰蛋白酶短时消化可以轻易获得单细胞并且细胞存活率明显高于其他方法(93.2%,P<0.05).结论:控制神经球体积的胰酶短时消化法是离散神经干细胞球的一种安全有效的方法.     

人胚神经干细胞移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的实验研究

目的:研究侧脑室注射人胚神经干细胞(hNSCs)移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠的有效性及hNSCs在EAE大鼠脑内的状况。方法:从自然流产的孕9～15周的人胚脑组织中分离、培养神经干细胞。用豚鼠全脊髓匀浆免疫Wistar大鼠制备EAE大鼠模型,分别在免疫后10、15、21天经侧脑室注射移植未分化的hNSCs入大鼠体内,观察hNSCs对EAE动物模型神经功能评分、脑内脱髓鞘病灶数目的影响,免疫组化方法观察移植后的hNSCs在EAE大鼠脑内存活、迁徙、分化的状况。结果:从人胎脑中成功培养出hNSCs,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球。绝大多数细胞表达神经干细胞的标记物神经巢蛋白(nestin)。hNSCs移植组各时间点大鼠脑组织切片中均可见Brdu、nestin、NSE、GFAP、CNPase染色阳性细胞,CNPase阳性的少突胶质细胞比例随时间的延长而逐渐增多;hNSCs移植组大鼠自免疫后30天起其神经功能评分显著低于对照组(P<0.05);移植后20、30天脑内脱髓鞘病灶数目明显少于对照组(P<0.05)。结论:hNSCs体内体外均具有多向分化潜能,受炎症部位微环境信号的影响分化成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞。hNSCs移植能有效改善EAE动物的神经功能评分,减少病灶数目。     

bcl-2基因修饰神经干细胞移植修复大鼠脊髓损伤

目的探讨bcl-2基因修饰神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠损伤神经功能恢复的影响。方法体外培养大鼠神经干细胞,经Ad-EGFP为载体介导端B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)基因转染神经干细胞,分为3组:对照组、阴性转染组、bcl-2转染组。Western-blot检测神经干细胞在转染前后bcl-2蛋白的表达。成年雌性SD大鼠85只,造模成功72只,随机分为对照组,NSCs组,bcl-2-NSCs组,24只/组,按照改良的Allen打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型。通过BBB评分、斜板试验进行运动功能评定。造模后7 d通过RT-PCR及Western-blot检测检测脊髓损伤区周围HSP27、c-fos基因的表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况。造模后4周取材行病理切片HE染色及荧光显微镜观测EGFP标记的NSC存活及分布情况,通过SEP和MEP观察大鼠神经电生理恢复情况。结果 bcl-2基因转染大鼠神经干细胞后,bcl-2转染组与对照组、阴性转染组相比bcl-2基因和蛋白水平均有表达(P0.05);大鼠下肢运动功能评价bcl-2-NSCs组优于NSCs组,NSCs组优于对照组。造模后72 h,bcl-2-NSCs组细胞凋亡数均明显低于对照组和NSCs组(P0.05)。造模后7 d,与对照组和NSCs组相比,bcl-2-NSCs组HSP27基因和蛋白的表达均较显著升高(P0.05),bcl-2-NSCs组c-fos基因和蛋白的表达较显著降低(P0.05)。造模后4周,HE染色对照组可见脊髓组织缺失及脊髓空洞形成,无神经轴索通过。NSCs组损伤区可见少量神经轴索样结构,脊髓空洞较小,bcl-2-NSCs组可见较多神经轴索样结构,未见脊髓空洞。EGFP标记的阳性细胞数:bcl-2-NSCs组最多,NSCs组次之,对照组未见,且各组之间差异有显著性(P0.05)。造模后4周,SEP和MEP的潜伏期:bcl-2-NSCs组NSCs组对照组,且各组之间差异有显著性(P0.05);波幅:bcl-2-NSCs组NSCs组对照组,且各组之间差异有显著性意义(P0.05)。结论通过Ad-EGFP为载体介导端B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)基因转染使神经干细胞能够促进体外培养的大鼠神经干细胞增殖。bcl-2基因修饰神经干细胞移植可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生,升高脊髓损伤区HSP27表达,降低脊髓损伤区bcl-2基因的表达和神经细胞凋亡,改善大鼠的肢体运动功能和电生理功能。     

用限制性内切酶制备T载体

目的:介绍一种制备T 载体的方法.方法:用限制性内切酶Xcm Ⅰ酶切,在两端产生T末端,制备的T载体可直接用来克隆用Taq DNA 聚合酶产生带A末端的PCR产物.结果:PCR产物直接和T载体连接,用常规氯化钙法制备的感受态菌转化,对转化子提取质粒进行酶切鉴定,证明阳性率达80%.结论:制备T载体过程简单,质量稳定,产量高,并可扩增等优点.     

胶原酶消化刮取再消化法分离培养犬静脉内皮细胞的实验研究

目的 探讨犬大隐静脉内皮细胞(endothelial cells,ECs)体外分离培养的新方法.方法 通过将内膜翻转后结扎两端,0.1％胶原酶消化后刮下内皮层,用胶原酶再消化法获取内皮细胞,用低糖DMEM培养基再加入适量内皮细胞生长因子培养,以0.25％胰蛋白酶进行消化传代培养.用免疫荧光法、免疫组织化学法及光镜、扫描...     

门冬胰岛素原的酶切及产物分离纯化方法

【摘要】 目的 建立门冬胰岛素原的酶切及纯化方法,获得高纯度的活性门冬胰岛素。方法 以大肠杆菌制备含有前导肽和折叠伴侣C肽的门冬胰岛素原为底物,采用胰蛋白酶和羧肽酶B对门冬胰岛素原进行酶切同时去除前导肽及C肽,酶切条件：酶与门冬胰岛素原的质量比为1：1000,室温反应30min。利用SPFF层析柱纯化酶切产物,获得高纯度的门冬胰岛素。结果 电泳结果显示酶切产物与门冬胰岛素分子量相似,离子交换纯化可以分开门冬胰岛素及酶切的多余肽段。高效凝胶过滤层析分析洗脱峰纯度大于95%,蛋白收率为30%。MALDI TOF检测纯化产物的分子量与门冬胰岛素的理论分子量完全一致。结论 建立门冬胰岛素原酶切及分离纯化工艺可用于指导门冬胰岛素的规模制备。     

改良酶消化法培养成骨细胞的研究

【目的】采用改良胶原酶法体外培养大鼠颅骨成骨细胞。【方法】取新生24 h SD大鼠颅骨,剔净后剪成碎块。依次以0.25%胰蛋白酶-0.02?TA和0.1%Ⅰ型胶原酶消化后,培养于-αMEM培养液中。倒置显微镜下观察形态学变化,钙钴染色法检测ALP活性,茜素红染色法观察矿化结节的形成。【结果】培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶呈阳性。【结论】采用改良胶原酶法培养的成骨细胞操作简便,成活率高,细胞具有典型的成骨细胞形态特征,且成分较单一。     

生物可分解吻合环在消化外科中的应用

本文就国内外消化外科领域应用生物可吸收吻合环（BAR）的现状、进展方面进行综述，内容涉及BAR的特性、历史应用概略、应用于消化道和消化道重建以外的用途、吻合方式、应用时的注意事项以及不足之处。可为BAR的应用者提供参考。     

骨肉瘤基因组DNA的提取及部分酶切分析

目的比较提取骨肉瘤基因组DNA,建立基因组DNA的最佳部分酶切条件并制备其部分酶切产物.方法采用经典的基因组DNA提取法和改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA,以限制内切酶Sau3A I部分酶切,采用玻璃珠(Silver Beads)DNA胶回收试剂盒与蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA.结果提取基因组DNA片段大于150 kb,37℃,Sau3AI 14(u/μg)部分酶切骨肉瘤基因组DNA 30 min获得18 kb ～23kb基因片段的富集,制备目的片段DNA.结论经改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA具有纯度、产量高,方法简单,无蛋白和RNA污染,片段足够长,可被Sau3AI部分酶切,玻璃珠(Silver Beads)DNA胶回收试剂盒和蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA纯度高,无小的DNA片段混入,可满足构建入噬菌体载体(EMBL3)基因组文库.为构建骨肉瘤的入EMBL3载体基因组文库做好了前期工作.     

微波消解-原子吸收分光光度法测定茯苓中微量镉

目的 利用原子吸收分光光度法测定中药茯苓中微量镉含量,了解中药茯苓中镉的含量.方法 微波消解-石墨炉原子吸收测定法.结果 利用微波消解进行茯苓的前处理,方法简便、快速、回收率高、精密度高;优化的仪器测试条件,拓宽了有效灰化温度的范围、降低了背景吸收,从而提高了灵敏度及延长了石墨管的使用寿命.本方法线性回归方程为Y＝0.004851X2 0.8273X 0.007(r=0.9996,n=3),回收率为95.6%～103.7%,最低检测浓度为0.012 μg/L,线性范围为0～2 μg/L.结论 方法具有简便、快速、回收率高、精密度高的优点,该法适用于中草药茯苓中镉含量的测定.     

骨肉瘤基因组DNA的提取及部分酶切分析

目的比较提取骨肉瘤基因组DNA,建立基因组DNA的最佳部分酶切条件并制备其部分酶切产物。方法采用经典的基因组DNA提取法和改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA,以限制内切酶Sau3A I部分酶切,采用玻璃珠(SilverBeads)DNA胶回收试剂盒与蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA。结果提取基因组DNA片段大于150 kb,37℃,Sau3A I 1∶4(u/μg)部分酶切骨肉瘤基因组DNA 30 min获得18 kb~23 kb基因片段的富集,制备目的片段DNA。结论经改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA具有纯度、产量高,方法简单,无蛋白和RNA污染,片段足够长,可被Sau3AI部分酶切,玻璃珠(Sil-ver Beads)DNA胶回收试剂盒和蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA纯度高,无小的DNA片段混入,可满足构建入噬菌体载体(EMBL3)基因组文库。为构建骨肉瘤的入EMBL3载体基因组文库做好了前期工作。     

半自动消化法分离纯化人胰岛细胞的实验研究

目的 探索用半自动胰腺消化系统建立大规模人胰岛细胞纯化的可靠方法.方法 使用自制的半自动人胰腺消化分离装置及胶原酶P进行人胰腺的消化分离,用COBE2991细胞分离机及HCA-Ficoll纯化人胰岛细胞.通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的分泌功能.结果 消化后平均每条胰腺可平均获得(38 6201±78 219)个胰岛细胞当量(IEQ),纯化后平均每条胰腺可获得231 420±28 054IEQ,平均每克胰腺组织可获得(3148±317)IEQ,纯化后胰岛细胞平均纯度为(62.81±2.68)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖(16.7 mmol/L)时胰岛素的释放量为低糖(3.3 mmol/L)时的3.53倍(P≤0.001).结论 成功建立了半自动人胰岛细胞分离、纯化的方法,纯化的人胰岛细胞具有良好的生物活性.