过表达DNMT3B7质粒载体的构建及对293A细胞增殖的影响北大核心CSCD

目的构建DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)的一种异构体3B7的真核质粒表达载体,在体外评价其对人胚肾细胞株293A增殖影响。方法据GenBank中人DNMT3B7 cDNA序列设计并合成特异性引物,以DNMT3B1为模板,利用高保真Taq酶,进行PCR技术扩增DNMT3B7,并将扩增产物克隆到真核表达载体pCMV-2B中。将携带DNMT3B7基因的质粒pCMV-DNMT3B7及空质粒pCMV-2B转染293A细胞,通过G418筛选出稳定表达的细胞系,MTT法检测细胞的增殖;流式细胞仪检测细胞的细胞周期分布。同时检测p21蛋白表达情况。结果成功构建DNMT3B7的真核表达载体并筛选出稳定表达株,与转染空质粒组相比,稳定过表达DNMT3B7组293A细胞株增殖减慢(P<0.01);过表达DNMT3B7的293A细胞S期细胞比例显著增多(P<0.05)。p21 mRNA和蛋白表达增加(P<0.05)。结论 DNMT3B7基因过表达可抑制293A细胞增殖,p21可能参与了这一过程的调节。     

DNA甲基转移酶3B4过表达与肾透明细胞癌的关系

  目的  探究DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）在肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）发生发展中的机制。  方法  收集2012年1月至12月15例内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院术前均未结予放化疗并行肾癌根治术患者的组织标本,均经病理证实为ccRCC。应用实时定量PCR、蛋白印迹、联合亚硫酸氢钠限制酶分析法和甲基化特异PCR等方法检测ccRCC组织中DNMT的mRNA表达,及ccRCC组织中整体甲基化（global methylation）水平和抑癌基因RASSF1A甲基化和表达水平。  结果  ccRCC组织中DNMT3B4的mRNA表达增加,同时其蛋白含量也相应增加。ccRCC患者癌组织中DNA重复序列Alu的甲基化水平0.106±0.04较癌旁组织中0.115±0.03低,差异具有统计学意义（P < 0.05）。而肿瘤抑制基因RASSF1A启动子区域发生高甲基化,其mRNA和蛋白的表达均降低。  结论  DNMT3B4基因过表达可能与染色体不稳定以及RASSF1A基因低表达有关,在ccRCC的发生发展中可能扮演着重要的角色。      

急性淋巴细胞白血病中DNA甲基转移酶3A剪切体的表达

目的:检测急性淋巴细胞白血病（ALL）患者骨髓标本中DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）各剪切体的表达情况,并分析其临床意义。方法:应用SYBR-Green RT-PCR方法检测成人初诊ALL患者及非恶性血液病对照患者骨髓有核细胞中DNMT3A各剪切体（DNMT3A1、DNMT3A2、DNMT3A2V）的表达情况,并分析其与ALL分型、ph染色体及预后的关系。结果:对照组DNMT3A2/DNMT3A1比值及DNMT3A2V/DNMT3A1比值均在1以下,ALL患者DNMT3A2V/DNMT3A1比值多数均高于1,显著高于对照组DNMT3A2V/DNMT3A1比值（P＜0.001）及ALL患者DNMT3A2/DNMT3A1比值（P＜0.01）。DNMT3A2V在急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）及急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）患者中的表达均显著升高（P＜0.01）。在ph(+)患者中,DNMT3A1及DNMT3A2表达均显著下降（P＜0.05）;在ph(-)患者中,DNMT3A2及DNMT3A2V表达均显著上升（P分别<0.01和<0.001）。以ALL患者中主要剪切体DNMT3A2V表达水平的中位值为界,分为低表达组(n=7)及高表达组(n=6),高表达组1年累积总生存率高于低表达组,但由于样本量较少,未见统计学差异（P=0.085）。结论:ALL中DNMT3A主要剪切体由DNMT3A1转换为DNMT3A2V,DNMT3A2V表达显著升高,且DNMT3A2V高表达可能与良好预后相关。这种剪切体转换及表达改变可能在ALL发病、预后及治疗选择中有一定价值,值得进一步深入研究。     

雷公藤内酯醇对淋巴瘤 Raji 细胞 ID4基因及 DNA 甲基转移酶表达的影响

目的：探讨雷公藤内酯醇（triptolide,TPL）对淋巴瘤 Raji 细胞 ID4基因及 DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMT）mRNA 表达的影响。方法：收集经0、20ng／ml TPL 处理的 Raji 细胞,采用荧光定量RT －PCR 法检测 Raji 细胞 ID4基因 mRNA 的表达。经0、5、10、15、20ng／ml TPL 处理的 Raji 细胞,采用荧光定量 RT －PCR 法检测 Raji 细胞 DNMT1、DNMT3A和 DNMT3B mRNA 的表达。结果：未经 TPL 处理的 Raji 细胞ID4基因无表达,20ng／ml TPL 作用后 ID4基因表达增强。在0～20ng／ml 浓度范围内,随着 TPL 浓度的增加, DNMT1、DNMT3A和 DNMT3B表达下降并呈浓度依赖性。结论：TPL 可抑制 Raji 细胞 DNA 甲基转移酶 mRNA,恢复 Raji 细胞 ID4基因 mRNA 表达。     

DNA 甲基转移酶在肿瘤发病机制中的研究进展

DNA甲基化是表观遗传学的主要形式,而DNA甲基转移酶（ DNMTs）是DNA甲基化的主要调节酶,DNA甲基转移酶的激活参与了肿瘤的发生和发展过程,同时伴有肿瘤抑制基因的高甲基化沉默和低表达,是病人预后不良的标志;DNA甲基转移酶3b（ DNMT3b）的多态性及吸烟所致的DNMTs表达的改变是肿瘤发生的危险因素,靶向DNMTs治疗由于其细胞毒性小,是当前研究的一个热点。本文就DNA甲基转移酶在肿瘤发病机制中的作用做一综述。     

DNMT1在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨DNA甲基转移酶1(DNMT1)在卵巢癌组织中的表达及对卵巢癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法:采用免疫组化方法检测15例正常卵巢组织及31例卵巢癌组织中DNMT1的表达水平;利用DNMT1的过表达质粒及DNMT1 siRNA瞬时转染SKOV3细胞系,Western blot检测DNMT1的蛋白表达水平,CCK8法检测各组细胞的增殖情况,Transwell小室实验检测DNMT1对卵巢癌细胞迁移能力的影响。结果:31例卵巢癌组织中DNMT1阳性率（83.9%,26/31）显著高于15例正常卵巢组织（20.0%,3/15）。临床分期Ⅲ-Ⅳ期、病理分级G3、远处转移者DNMT1阳性率明显升高（P＜0.05）。过表达DNMT1后,SKOV3细胞增殖能力及迁移能力均增强;敲低DNMT1后,SKOV3细胞生长及迁移能力受抑。结论:DNMTl在卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织,其具有促进卵巢癌细胞增殖和远处转移的作用。     

胃癌中DNA甲基化转移酶3A的表达与幽门螺杆菌感染的关系

目的 探讨胃癌患者胃黏膜上皮组织中DNA甲基化转移酶3A(DNMT3A)表达与幽门螺杆菌(Hp)感染的关系.方法 选取胃癌(GC)、腺瘤性息肉(GA)、慢性萎缩性胃炎(CAG)、慢性非萎缩性胃炎(CNAG)患者各30例,比较不同患者胃黏膜组织中DNMT3A mRNA的表达水平及Hp的感染情况.结果 4种胃部疾病患者胃黏膜组织中DNMT3A mRNA的相对表达量比较,差异有统计学意义(P﹤0.01).随着病情的发展,DNMT3A mRNA的相对表达量呈逐渐升高趋势.GC患者胃黏膜组织中DNMT3A mRNA的相对表达量高于CAG和CNAG患者,GA患者胃黏膜组织中DNMT3A mRNA的相对表达量高于CNAG患者(P﹤0.05).在同种疾病的胃黏膜组织中,Hp感染胃部疾病患者胃黏膜组织中DNMT3A mRNA的相对表达量高于非Hp感染的胃部疾病患者(P﹤0.05).低分化、伴有淋巴结转移GC患者GC组织中DNMT3A mRNA的相对表达量分别高于高中分化、不伴淋巴结转移的GC患者(P﹤0.05).结论 Hp感染可诱导胃黏膜中DNMT3A高表达,DNMT3A表达的上调可能促进GA、GC的发生发展,Hp感染和DNMT3A可协同作用参与从慢性炎症向GC发展的过程.     

DNA甲基转移酶在肿瘤发病机制中的研究进展北大核心CSCD

0引言 与经典的遗传学不同,表观遗传学是指在DNA序列未发生异常改变的前提下,基因的功能发生了叮遗传的信息变化,并最终导致了表型的改变。DNA甲基化是表观遗传学修饰的主要形式之一,而DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）则是DNA甲基化的主要调节酶。本文就DNMT在肿瘤中的研究进展作一综述。     

三种DNA甲基转移酶在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨肝细胞癌组织中三种甲基转移酶(DNMT)蛋白表达的差异及其临床意义.方法:收集38例肝癌标本,取癌区组织各3块,制作组织芯片,应用免疫组化SP法分析肝癌组织中DNMT蛋白的表达,并分析其与肝癌各临床、病理参数间的关系.结果:在38例肝癌组织中,DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白的表达阳性率分别为55.3%、48.5%和65.8%.DNMT蛋白质着色主要分布在细胞核,散在分布于胞浆.DNMT1蛋白质表达与门脉癌栓和肿瘤无包膜等参数显著相关;组织中DNMT1表达与DNMT3b表达具有相关性,二者同时表达与门脉癌栓和肿瘤无包膜等参数显著相关.但三种DNMT蛋白的阳性表达与患者的年龄、性别、肿瘤分化程度和淋巴结转移无显著相关性(P>0.05).结论:肝细胞癌组织中存在三种DNMT蛋白的过表达,DNMT1和DNMT3b的高表达与门脉癌栓和肿瘤无包膜等参数显著相关,二者协同作用可能在肝癌的发生和发展中起重要作用.     

DNMT3B regulates proliferation of A549 cells through the microRNA-152-3p/NCAM1 pathway

The purpose of the present study was to examine the epigenetic mechanism by which microRNA (miR)-152-3p regulates proliferation in non-small cell lung cancer A549 cells via neural cell adhesion molecule 1 (NCAM1). Bisulfite sequencing PCR (BSP), the gold standard for methylation detection, uses bisulfite-treated DNA to determine its pattern of methylation. Treatment of DNA with bisulfite converts cytosine residues to uracil, but leaves 5-methylcytosine residues unaffected. It was conducted and demonstrated a relatively high level of methylation in the miR-152-3p promoter region. Chromatin immunoprecipitation was combined with PCR to detect the binding of DNA methyltransferase 3B (DNMT3B) protein to miR-152-3p, which tends to occur in the core region of the miR-152-3p gene in A549 cells. Luciferase assay identified NCAM1 as the target gene of miR-152-3p. MTT, colony formation and Transwell assays indicated that miR-152-3p could decrease cell proliferation and invasion and in addition to reducing the expression level of NCAM1. Overexpression of NCAM1 could attenuate the effect of miR-152-3p. DNMT3B knockdown decreased the proliferative ability of A549 cells and increased the expression of miR-152-3p, while decreased that of NCAM1. After treatment with miR-152-3p inhibitor, these effects were attenuated and the NCAM1 expression level was upregulated. The results indicated that miR-152-3p may suppress the proliferation of A549 cells by downregulating NCAM1. In addition, DNMT3B negatively regulated the expression of miR-152-3p via modulation of the methylation level in the miR-152-3p core region, thus mediating the proliferation of lung tumor cells.     

DNA甲基转移酶抑制剂对结肠癌细胞增殖、凋亡及细胞周期影响的体外研究

目的 探讨DNA甲基转移酶抑制剂SGI-1027对结肠癌LoVo细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法 取对数生长期LoVo细胞,实验组加入终浓度分别为0.1、1、5、10 μmol／L SGI-1027的培养液,对照组用含10％胎牛血清的RPMI 1640 培养基同步培养。MTT法检测SGI-1027作用于LoVo细胞24、48、72 h的增殖抑制率;倒置相差显微镜观察细胞形态学变化;SGI-1027处理后每个浓度收集细胞1×106个,采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）／碘化丙啶（PI）双染或PI单染流式细胞术分别检测SGI-1027处理后的细胞凋亡率和细胞周期时相分布情况;Western blotting检测SGI-1027对PI3K／Akt通路的影响。 结果 倒置相差显微镜观察显示,随SGI-1027浓度和作用时间的增加,LoVo细胞的凋亡形态学改变更为显著。除0.1 μmol／L SGI-1027处理24 h后的LoVo细胞增殖抑制率与对照组无差异外,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,SGI-1027对LoVo细胞的增殖抑制作用不断增强。与对照组比较,SGI-1027（0.1～10 μmol／L）处理LoVo细胞24、48 h的凋亡率均升高,且各浓度间的差异均有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较,1～10 μmol／L SGI-1027处理后G0／G1期细胞比例及PTEN水平均高于对照组,S期和G2／M期细胞比例及Akt水平均低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 SGI-1027可抑制LoVo细胞的增殖并诱导细胞凋亡及G0／G1期阻滞,可能与其抑制PI3K／Akt通路激活有关,且SGI-1027作用的时间和浓度均对LoVo 细胞恶性行为有影响。     

甲基转移酶在恶性骨肉瘤细胞体外诱导分化过程中的作用

目的:观察骨肉瘤细胞MG-63在体外诱导逆转过程中DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,Dnmt)的变化,探讨Dnmt与骨肉瘤细胞逆转的相关性及其作用。方法:体外用全反式维甲酸(all trans-retinoic acid,ATRA)对MG-63细胞诱导分化,透射电镜观察瘤细胞的超微结构;MTT检测细胞的增殖能力;RT-PCR法检测细胞Dnmt和增殖核抗原(proliferationcell nuclear antigen,PCNA)mRNA的表达;以流式细胞仪检测药物作用前后细胞周期的改变。结果:经诱导剂处理后,MG-63细胞的生长明显受到抑制,D值从0.8405±0.1305下降到0.6147±0.0427(P<0.05),细胞形态呈良性分化;与对照组相比,Dnmt和PCNA mRNA的表达随着作用时间的延长均降低,细胞周期阻滞于G1期。结论:ATRA对人骨肉瘤细胞株有诱导分化作用,PCNA mRNA表达水平和细胞周期的进程与Dnmt的调节密切相关,抑制Dnmt基因的表达是ATRA诱导骨肉瘤细胞分化的重要机制之一。     

MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition

It is observed that upregulation of DNMT3B enzyme in some cancers, including colon cancer, could lead to silencing of tumor suppressor genes. MiR-339 and miR-766 have been predicted to target 3′UTR of DNMT3B gene. Luciferase reporter assay validated that individual and co-transfection of miR-766 and miR-339 into the HEK293T cell reduced luciferase activity to 26% ± 0.41%, 43% ± 0.42 and 64% ± 0.52%, respectively, compared to the control (P < 0.05). Furthermore, transduction of miR-339 and miR-766 expressing viruses into colon cancer cell lines (SW480 and HCT116) decreased DNMT3B expression (1.5, 3-fold) and (3, 4-fold), respectively. In addition, DNA methylation of some tumor suppressor genes decreased. Expression of these genes such as SFRP1 (2 and 1.6-fold), SFRP2 (0.07 and 4-fold), WIF1 (0.05 and 4-fold), and DKK2 (2 and 4-fold) increased in SW-339 and SW-766 cell lines; besides, expression increments for these genes in HCT-339 and HCT-766 cell lines were (2.8, 4-fold), (0.005, 1.5-fold), (1.7 and 3-fold) and (0.04, 1.7-fold), respectively. Also, while in SW-766, cell proliferation reduced to 2.8% and 21.7% after 24 and 48 hours, respectively, SW-339 showed no reduced proliferation. Meanwhile, HCT-766 and HCT-339 showed (3.5%, 12.8%) and (18.8%, 33.9%) reduced proliferation after 24 and 48 hours, respectively. Finally, targeting DNMT3B by these miRs, decreased methylation of tumor suppressor genes such as SFRP1, SFRP2, WIF1 and DKK2 in the mentioned cell lines, and returned the expression of these tumor suppressor genes which can contribute to lethal effect on colon cancer cells and reducing tumorigenicity of these cells.     

Smad7基因过表达的促增殖作用机制探讨

目的 研究Smad7过表达使人支气管上皮细胞系增殖能力增强的机制。方法 用Smad7真核表达载体PCISmad7．neo同携带有报告基因碱性磷酸酶的c-myc顺式增强子元件pMyc-SEAP共转染,检测Smad7基因对增殖信号通路的影响。用RT-PCR方法,检测稳定转染Smad7基因前后永生化及恶性化的人支气管上皮细胞系BEP2D和BERF35T2细胞内c-myc、p15、p21表达水平的变化,调查Smad7基因对TGF-β介导的抗增殖基因反应的调控。结果 报告基因检测结果表明,Smad7基因可使参与增殖信号通路的c-myc顺式增强子元件活性增强。RT-PCR结果表明,在稳定转染Smad7基因的细胞中,c-myc表达上调,p15表达降低,对TGV-β刺激的应答丧失,p21表达降低。结论 Smad7基因可通过调控TGF-β介导的抗增殖基因应答来影响细胞的生长、增殖能力。     

DNA甲基转移酶3B-149C>T多态性与致癌风险相关性的Meta分析

目的:评估DNA甲基转移酶3B-149C>T(DNMT3B-149C>T)多态性与致癌风险之间的相关性。方法:依据Newcastle-Ottawa Scale(NOS)文献质量评价量表,对1990～2017年国内外公开发表的相关文献进行评价并提取资料;对DNMT3B-149C>T各基因型模型进行比较,包括CC与TT、CT与TT、CC+CT与TT,综合分析其在病例组和对照组中的分布情况;通过Q检验和I^2值分析各研究间的异质性,应用Begg秩相关法和Egger回归法验证发表偏倚,使用Review Manager 5.0软件和STATA version 12.0进行统计分析,计算比值比(OR)及95%置信区间(95%CI),评估DNMT3B-149C>T多态性与致癌风险的相关性。结果:分析文献中的7 612名癌症病例和9 679名健康对照。按不同癌症类型进行亚组分析,DNMT3B-149C>T多态性与肺癌的患病存在相关性[OR=1.51,95%CI(1.08,2.12),P=0.02]。结论:DNMT3B-149C>T多态性可能是肺癌的易感性因素。     

Regional DNA hypermethylation and DNA methyltransferase (DNMT) 1 protein overexpression in both renal tumors and corresponding nontumorous renal tissues

To evaluate the significance of altered DNA methylation during renal tumorigenesis, tumorous tissues (T) and corresponding nontumorous renal tissues (N) from 94 patients with renal tumors, and normal renal tissues (C) from 16 patients without renal tumors were investigated. DNA methylation status on CpG islands of the p16, human MutL homologue 1 (hMLH1), von-Hippel Lindau (VHL) and thrombospondin-1 (THBS-1) genes and the methylated in tumor (MINT) -1, -2, -12, -25 and -31 clones and DNA methyltransferase (DNMT) 1 expression were examined by bisulfite modification and immunohistochemistry, respectively. The average number of methylated CpG islands was significantly higher in N than in C, and was even higher in T. The average number of methylated CpG islands in N was significantly correlated with a higher histological grade of corresponding conventional renal cell carcinomas (RCCs). The average number of methylated CpG islands in RCCs was significantly correlated with macroscopic configuration with extranodular or multinodular growth, higher histological grade, infiltrating growth pattern and vascular involvement. The recurrence-free survival rate of patients with RCCs showing accumulation of DNA methylation was significantly lower than that of patients not showing this feature. The incidence of nuclear immunoreactivity for DNMT1 tended to be higher in proximal tubules from N than in those from C, and was significantly higher in RCCs. From the viewpoint of altered DNA methylation, N is at the precancerous stage, and N showing accumulation of DNA methylation may generate more malignant RCCs. Regional DNA hypermethylation may be associated with renal tumorigenesis from a precancerous condition to malignant progression and become a predictor of patient prognosis.     

Survivin 在喉癌中的表达及与细胞增殖的相关性研究

目的：探讨凋亡抑制蛋白Survivin在喉癌中的表达及其与细胞增殖的相关性。方法应用免疫组化（ SP）法和流式细胞术对63例喉鳞状细胞癌组织及15例正常喉组织进行Survivin蛋白检测和DNA含量分析。结果 Survivin在正常喉组织中不表达,在喉癌标本中阳性表达为45/63（71．4％）,其阳性表达与分化程度及有无淋巴结转移有关（P＜0．05）,而与患者年龄、性别、临床分期无关（P＞0．05）。喉癌的DNA指数（DI）和增殖指数（PI）均比喉正常组织高（P＜0．05）,且PI值与Survivin阳性表达呈正相关（P＜0．05）。结论在喉癌中Survivin均有表达,其可能导致喉癌细胞过度增殖,影响喉癌的发生和发展,可能成为今后喉癌诊断和治疗的新靶点。