重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒

目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。     

DPO引物多重RT-PCR技术检测甲型流感病毒的研究

目的应用DPO引物技术建立一种可以同时检测新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1、H3N2以及禽流感病毒H5N1的单管多重RT-PCR检测方法,为流行性感冒的监测与应急诊断提供高通量检测技术。方法应用DPO引物技术设计针对新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1和H3N2以及禽流感病毒H5N1的高特异性DPO引物,并对多重RT-PCR反应体系优化,建立多重RT-PCR检测技术。结果建立的多重RT-PCR方法可同时扩增新甲型流感病毒H1N1221 bp、季节性流感病毒H1N1468 bp和H3N2592 bp以及禽流感病毒H5N1350 bp的基因片段。检测敏感性分别为102、102、103和102copies/ml,并与呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒等呼吸道病毒无交叉反应。结论本研究建立的多重RT-PCR可以同时准确分型新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1和H3N2以及禽流感病毒H5N1,为流行性感冒的监测与应急诊断提供了有效的实验室检测手段。     

几种甲型H1N1流感病毒SYBRGreenI荧光RT—PCR检测方法的验证

目的比较和验证5种甲型H1N1流感病毒SYBRGreenI荧光RT—PCR检测方法。方法首先使用美国NCBI网站的Primer—BLAST程序验证5种甲型H1N1流感病毒SYBRGreenI荧光RT—PCR检测方法引物的理论特异性,然后使用猪流感H1N1病毒核酸、2009年新甲型H1N1流感病毒核酸、H5N1禽流感核酸、能力验证样品作为试验样品验证方法的实验特异性。结果理论验证结果显示5对来源于文献的引物均适合于猪流感的检测,前3对可用于新型甲型H1Nl流感的检测,但只限于个别来源的毒株,与预期略有差别。实验验证结果显示,方法l可正确检出甲型流感病毒;方法2可正确检出猪流感H1N1亚型病毒、新甲型H1N1流感病毒核酸;方法3检测新甲型H1N1流感核酸时未获得阳性结果;方法4可以正确检测出猪流感H1病毒核酸;方法5可以正确检测出猪流感H1N1病毒核酸,但检测新甲型H1N1流感核酸、禽流感H5N1核酸时也为阳性。结论方法1可用于猪甲型流感和新甲型H1N1流感病毒的初筛;方法2可用于猪流感H1N1亚型病毒和新甲型H1N1流感病毒核酸的初筛;方法3不适合新甲型H1N1流感病毒核酸的检测;方法4可用于猪流感H1亚型的检测;方法5不适合于猪流感H1N1亚型病毒的检测。采用SYBRGreenI荧光RT—PCR方法检测甲型H1N1流感病毒核酸,特异性普遍不十分理想,只能用于初筛检测。     

H7N9人禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

目的采用RT-LAMP技术建立一种针对H7N9人禽流感病毒的特异、灵敏、快速、可视、简便的检测方法。方法根据H7N9人禽流感病毒HA基因的保守序列,利用Primer Explorer V4软件,设计一套针对HA基因的7个区域的5条特异性引物,优化反应体系与扩增条件,并验证其特异度与灵敏度。结果该方法能检测出H7N9亚型流感病毒,而对H1亚型、H3亚型、H5亚型、H6亚型、H9亚型流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人冠状病毒、人偏肺病毒、人腺病毒、人博卡病毒均无扩增反应,其最低检出限为0.01 pg。另外,扩增反应只需要45 min即可判读结果,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化诊断。结论本研究建立的RT-LAMP检测方法具有高特异度、高灵敏度、快速简便、可视化判读结果等优势,适合在基层进行H7N9人禽流感病毒的快速检测,并可以应用于大流感疫情的准确筛查。     

焦磷酸测序技术在检测甲型H1N1血凝素基因裂解位点突变中的应用

目的基于焦磷酸测序技术建立甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因裂解位点突变的快速检测方法,探讨其临床应用价值。方法采用RT-PCR扩增甲型H1N1病毒血凝素基因中的HA片段,在生物信息学分析的基础上,针对甲型H1N1病毒血凝素基因含有裂解位点序列片段,分别设计一套生物素标记的PCR引物和测序引物,运用焦磷酸测序技术对含甲型H1N1病毒裂解位点基因片段进行序列测定,同时分析青岛地区甲型H1N1流感病毒流行株的裂解位点基因特征。结果建立了基于焦磷酸测序技术检测甲型H1N1流感病毒裂解位点突变方法,实现甲型H1N1流感病毒HA基因裂解位点的高通量检测,青岛地区甲型H1N1流感病毒裂解位点344氨基酸序列没有发生变异。结论本研究所建立的方法具有自动化程度高和结果准确等特点,适用于甲型H1N1流感病毒裂解位点进行快速高通量检测。     

2016年盐城市1例人感染H7N9禽流感病毒HA、NA基因变异分析

目的 了解盐城市禽流感H7N9病毒株HA基因和NA基因分子进化特征,为更好预防和治疗人感染禽流感H7N9病例提供科学依据。方法 通过荧光定量PCR方法对标本进行流感病毒分型检测,对禽流感H7N9病毒荧光PCR阳性的标本,采用一步法RT-PCR方法对H7N9病毒HA基因和NA基因全长编码区进行扩增,扩增产物经纯化测序,采用相应的生物信息软件进行核苷酸及氨基酸序列比对及基因种系进化特征分析。结果 盐城市禽流感H7N9病毒株HA基因和NA基因有着独特的进化方式,A/JSYC/1/2016(H7N9)病毒株HA裂解位点附近氨基酸序列为PEIPKGR/GL,属于低致病性禽流感病毒。HA基因编码蛋白受体结合位点出现了G186V、Q226L氨基酸位点的变化,增强了病毒对人的感染能力,NA基因编码蛋白主要可能的神经氨酸酶抑制剂耐药位点未发生E120G、R153K、H276Y、R294K的变异。结论 2016年盐城市禽流感H7N9病毒株HA基因和NA基因处于基因点突变的抗原漂移变化中,某些变异位点具备了感染人的某些分子特征。     

实时荧光定量RT-PCR快速检测H7N9禽流感病毒

目的 构建一种灵敏、特异、快速的实时荧光定量RT-PCR反应体系用于临床H7N9禽流感疑似病例早期诊断及外环境H7N9病毒的监测.方法 以H7N9禽流感病毒H7基因和N9基因为靶基因设计引物以及TaqMan探针,并对引物、探针及反应条件进行优化,验证该反应体系检测的特异性、灵敏度、重复性和检测速度,然后与两种商品化试剂盒(试剂盒I和试剂盒Ⅱ)进行各项指标及184份现场样本作平行比对.结果 新建立的H7N9禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR反应体系呈典型的扩增曲线、扩增时间约50 min,H7基因与N9基因的最低检出限分别为28拷贝/μL与41拷贝/μL.重复性测定显示,H7和N9检测Ct值的变异系数(CV)分别为0.17％～0.89％和0.33％～0.59％,扩增效率分别为0.9491和0.9713;与其他常见禽流感病毒或肠道病毒无明显交叉反应.184份现场可疑样本阳性检出率为5.43％(10/184),与试剂盒Ⅱ结果一致.结论 本研究建立的实时荧光定量RT-PCR反应体系具有检测速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好、结果可靠等特点,可用于临床疑似病例的应急检测、早期诊断及养鸡场、活禽交易市场等外环境H7N9禽流感病毒监测.     

逆转录多重PCR检测人感染高致病禽流感H5N1亚型

目的 建立并优化检测人感染高致病禽流感H5N1亚型的逆转录多重PCR(RT-M PCR)方法 .方法 将提取H5N1型高致病禽流感病毒RNA,逆转录为cDNA,测序后针对H5裂解位点及N1的保守区序列设计特异性引物,应用RT-M PCR对H5N1型基因进行检测,并验证所建立方法 的敏感性,通过检测NDV、IBV和IBDV的RNA病毒验证其特异性.结果测序结果表明该株H5N1型与安徽株同源,经RT-M PCR扩增出302 bp和567 bp的两条片段,实验最低检出限为0.500 Pg的RNA病毒,并且特异性高.结论 该法可用于人感染高致病性禽流感病毒H5N1亚型的检测.     

环介导技术在流感检测中的应用与研究

目的建立并应用RT-LAMP检测新甲型H1N1、季节性H1N1和季节性H3N2亚型流感病毒及乙型流感病毒。方法通过在线软件Primer Explorer V5设计针对新甲型H1N1、季节性H1N1和季节性H3N2亚型及乙型流感病毒基因的保守区引物,建立RT-LAMP检测方法,对2012年-2013年采集的疑似咽拭子标本采用real-time PCR和RTLAMP法检测。结果 615份标本中,real-time PCR法检出295份阳性,RT-LAMP法检出294份阳性,2种方法的检测结果差异无统计学意义(P0.05)。2种方法所建立的季节性H1N1、季节性H3N2、新甲型H1N1、乙型的检测体系只与相应亚型流感病毒呈阳性反应,而对禽流感病毒H5、禽流感病毒H9、RSV、RV、EV71扩增结果为阴性。RT-LAMP检测方法具有良好的敏感性和特异性。结论 RT-LAMP法使用水浴锅进行等温扩增,结果在可见光或紫外灯下直接肉眼观察。RT-LAMP检测方法具有高度的敏感性、准确性、高特异性,而且简单、快速,比real-time PCR更适合应用于基层疾病预防控制中心和医院。     

H7N9禽流感病毒重组质粒构建及应用

目的构建一种含H7N9禽流感病毒全长血凝素/神经氨酸酶/基质蛋白（HA/NA/M）基因的重组质粒,为核酸检测方法提供一种通用的阳性定量标准品。方法设计H7N9禽流感病毒HA、NA及M抗原基因全长开放阅读框的克隆引物,提取H7N9禽流感病毒总RNA后用实时荧光定量PCR获得相应片段,用3次酶切连接方法,依次插入到pGEM-T easy质粒,进行测序确认;线性化后的重组质粒用T7 RNA聚合酶进行体外转录,RNA转录产物纯化后测定浓度,用实时荧光定量PCR构建标准曲线进行验证。结果HA、NA和M基因扩增片段大小分别约为1.7、1.3、1.1 kb,与预期相符;构建的重组质粒pGEM-HA-NA-M插入片段的测序结果与GenBank 公布序列一致;由重组质粒体外转录获得同时含有H7N9禽流感病毒HA、NA、M全长开放阅读框序列的RNA片段质量浓度为399.5 ng/μL,梯度稀释后用3种实时荧光定量PCR方法均获得了良好的标准曲线。结论成功构建重组质粒pGEM-HA-NA-M,由此质粒体外转录获得的RNA片段可作为H7N9禽流感病毒核酸快速检测方法通用的阳性定量标准品。     

人感染禽流感病毒A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)株HA基因序列分析

目的测定本市首例人感染禽流感病毒A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)株HA基因序列,分析H7N9禽流感病毒HA基因特点。方法采用real-time PCR检测患者H7N9禽流感病毒核酸,RT-PCR扩增病毒HA基因后测定核苷酸序列。结果实验室确诊丽水首例人感染H7N9禽流感患者。测序得到H7N9禽流感病毒长度为1 683 bp的HA基因核苷酸全序。A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)与我国江浙沪分离株HA基因核苷酸和氨基酸序列相似性都比较高,分别为98.8%~99.5%、98.9%~99.5%;与浙江鸡分离株A/chicken/Zhejiang/C483/2013(H7N9)序列相似性最高。A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)与我国江浙沪H7N9病毒株HA基因序列均处于同一进化分支;与浙江外环境分离株A/environment/Hangzhou/34/2013(H7N9)进化关系最近;与浙江鸡分离株A/chicken/Zhejiang/C483/2013(H7N9)进化关系次之;与韩国野鸟分离株A/wildbird/Korea/A3/2011(H7N9)处于同一进化分支。结论 A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)HA基因来源于浙江鸡携带的H7亚型流感病毒。HA基因具有低致病性禽流感病毒基因特征,但与人类呼吸道上皮细胞的亲和力增加,更容易感染到人。     

新型甲型H7N9禽流感病毒实验室检测及防控策略

2013年3月中国报道了首例因感染新型甲型H7N9流感病毒而致死的病例,引发疫情的H7N9禽流感病毒是一种鸟类的禽流感病毒毒株基因重配的新型病毒,该病毒是首次从人群中发现的一种新型H7N9亚型禽流感病毒,也是全球首次发现的新亚型流感病毒。禽流感是一种新亚型、起病急、进展快、致死率高等为特点的急性传染病,新型H7N9病毒最显著的特征之一是在家禽中无明显致病性,却能感染人类并引起较高的病死率。可以预见这种新型H7N9亚型禽流感还将会持续并引起严重的公共卫生问题,必须对此加以高度重视,建立健全防控体系建设和联动机制,加强健康教育工作,从而最大限度地减少禽流感对人类健康和生命的危害。本文对该病毒的病原学特点及实验室检测方法及防控策略进行简要综述。     

H7N9病毒的M1基因序列分析及原核表达

目的克隆H7N9禽流感病毒M1并在原核细胞中表达,为进一步研究其生物学特性、免疫学功能及血清学检测奠定基础。方法用PCR方法从禽流感上海分离株A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)cDNA扩增M1基因,并克隆到载体pMD18-T中。经测序证实后,用EcoRⅠ/NdeⅠ双酶切,亚克隆到原核表达载体pET28a,并转化E.coli BL21(DE3)菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定及western blot检验。结果 (1)经PCR、测序和酶切鉴定,成功克隆了禽流感H7N9 M1基因;(2)经IPTG诱导的重组质粒pET28a-M1表达出约为28 k Da的融合蛋白,与预期结果相符;(3)对H7N9型禽流感M1基因序列分析表明,与2013年暴发的H7N9型禽流感病毒M1基因核苷酸序列同源性在95.4%~100%,与2006-2011年间暴发的H7N9型流感病毒M1基因序列同源性在69.0%~89.6%,2013年感染人的H7N9型流感病毒与此前暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支。结论成功克隆了禽流感H7N9病毒的M1基因,并在E.coli中得以表达。     

应用2种TaqMan-荧光定量PCR法快速检测甲型H1N1流感病毒

[目的]应用达安基因H1和N1两对引物检测试剂盒及美国CDC四对引物探针法对流感样病例进行核酸检测,以快速排除甲型H1N1流感病毒的感染.[方法]采用达安基因H1和N1两对引物检测试剂盒对流感样病例进行核酸检测,这些样本同时以美国CDC公布的针对甲型H1N1流感病毒的探针和引物序列以及国家CDC提供的针对季节性流感病毒的探针和引物序列进行检测,与达安基因的甲型H1N1试剂盒进行特异性、准确性的比较.[结果]达安基因甲型H1N1试剂盒和美国CDC的甲型H1N1四对引物法对季节性流感甲1、甲3、乙型的扩增都为阴性,对甲型H1N1确诊病例的病毒核酸扩增都是阳性,应用国家CDC的探针和引物检测为流感病毒核酸阴性的样本用达安基因的甲型H1N1试剂盒及美国CDC的甲型H1N1四对引物法的检测结果也都为阴性.[结论]达安基因的甲型H1N1试剂金及美国CDC的甲型H1N1四对引物法对甲型H1N1流感病毒的检测有高度的特异性,可从疑似甲型H1N1流感患者鼻咽拭子中直接检测流感病毒核酸.     

逆转录酶——聚合酶链反应检测肠道病毒

建立一种特异、敏感的检测肠道病毒的逆转录酶—聚合酶链(RT—PCR)方法。在肠道病毒RNA高度保守的5’端非编码区设计、选择、合成三对引物,采用RT—PCR对175株已知肠遭病毒和23份粪便标本进行检测。三对引物RT—PCR均显示高度特异性、敏感性。对23份粪便标本检测,E_1E_2引物有9份阳性,C_1C_2引物为7份阳性,P_1P_2均为阴性,与常规检测结果基本一致。这一检测方法具有较高特异性和敏感性,可用于临床快速检测肠遭病毒。     

一步法RT-PCR检测SARS冠状病毒技术研究

[目的]建立一步法RT—PCR方法，对非典型肺炎疑似病例进行SARS相关冠状病毒检测。[方法]参照WHO公布的PCR检测SARS相关冠状病毒的引物序列，我们合成了4对引物，利用RT—PCR技术建立一步法检测SARS相关冠状病毒的方法。[结果]利用该方法对武汉市非典型肺炎疑似病例进行SARS相关冠状病毒检测，其中样品W20用4对引物检测均在相应的位置出现了DNA条带，样品W1只有BNIin—s/as引物出现预期产物。同时我们将W20的BNIin—s/as引物扩增的109bp产物进行了序列测定，结果显示该片段序列与其他地区和国家的SARS冠状病毒的同源性极高，均在99．5％以上。[结论]一步法RT—PCR扩增产物是SARS冠状病毒基因片段，我们建立的一步法RT—PCR是一种可靠的检测方法。     

双重实时荧光PCR对流感病毒检测及分型方法的研究

目的:建立双重实时荧光PCR方法用于流感病毒检测,实现对新甲型H1N1流感病毒,H1和H3亚型季节性流感病毒,H5和H9亚型禽流感病毒的亚型区分。方法:根据GenBank公布的基因序列,针对M基因保守区设计引物和探针,用于流感病毒检测和定量;针对HA基因设计引物和探针,用于病毒分型。建立和优化双重实时荧光PCR反应体系,进行敏感度和特异性评价,同时对32份已知亚型的流感病毒样本进行检测,验证所建方法的实用性。结果:基于M基因的实时荧光PCR方法定量范围为5×101到5×108个目的拷贝。经优化的双重实时荧光PCR方法对不同亚型流感病毒的检测灵敏度在50～500拷贝之间,各亚型之间没有交叉反应。建立的方法能够检测出本研究涉及的所有流感病毒标本,分型准确率达到96.9%。结论:建立的双重实时荧光PCR方法具有敏感度高,特异性好等优点,实现对流感病毒样本准确分型,适用于流感的鉴别诊断及病毒载量测定。     

2013年-2015年宁夏环境禽流感病毒和职业暴露人群血清学监测分析

目的了解2013年-2015年宁夏环境高致病性禽流感病毒的分布变化情况及职业暴露人群禽流感病毒的感染状况。方法采用实时PCR对环境样本进行Fl A、H5、H7、H9禽流感病毒核酸检测;采用马红细胞血凝抑制实验检测职业暴露人群H5N1和H7N9亚型血凝素抗体。结果 1 479份环境样本禽流感病毒核酸检测,A型总阳性率为4.46%,其中H5亚型阳性率为0.34%,H9阳性率为3.38%,H5亚型和H9亚型交叉双阳性率为0.74%,H7亚型均为阴性。城乡活禽市场样本阳性率显著高于其他场所,高峰期在冬春季。5个监测县区中,沙湖旅游区A型阳性率最高,为11.66%。职业暴露人群血清837人份,H5N1和H7N9抗体均为阴性。结论 2013年-2015年宁夏监测点环境中禽流感病毒以H9亚型为主,未检出H7亚型病毒。禽流感病毒呈地区性分布和变化的特点,城乡活禽市场仍然是禽流感病毒主要的集散地。宁夏尚未发现人感染H5N1和H7N9禽流感。     

浙江省人感染H7N9禽流感病毒的基因组序列分析

目的分析浙江省2013年4月初一例人感染甲型H7N9禽流感患者的病原学和基因组序列特征.方法提取患者标本的病毒RNA并用荧光定量RT-PCR方法检测,一步法RT-PCR扩增H7N9禽流感病毒基因组的8个片段,测序并拼接出基因组序列.下载目前已经公布的H7N9禽流感病毒和其他H7、N9亚型的病毒的HA和NA序列,采用Mega 5.1软件对其进行序列比对并构建进化树.根据测序的结果分析该例H7N9禽流感病毒的序列变异情况.结果该患者标本甲型流感、H7亚型和N9亚型均为阳性,通过扩增基因组各片段并进行测序.对血凝素和神经氨酸酶基因进行比对和进化树构建,结果显示该H7N9病毒HA基因与A/duck/Zhejiang/12/2011(H7N3)的亲缘关系最近,NA基因与A/wild bird/Korea/A14/2011 (H7N9)的亲缘关系最近.编码内部蛋白的6个基因均与中国大陆近两年的H9N2毒株最为相似.该标本的病毒HA蛋白发生了Q226L突变,而与已经公布的人感染H7N9禽流感毒株均不一致的是PB2未发生E627K突变.结论从该份临床标本完成了检测和基因组各片段的扩增与测序.该病毒与已报道的人感染H7N9禽流感病毒同源性高,存在Q226L等重要位点的突变,但PB2未发生E627K突变.     

2012—2013年广州市职业暴露人群及环境禽流感监测分析

目的了解2012—2013年广州市职业暴露人群中禽流感病毒亚型隐性感染状况以及禽类市场环境中H7N9病毒污染状况。方法采集家禽职业暴露人群以及H7N9疫情专项调查人群血清样本和环境拭子样本,用红细胞凝集抑制试验(HI)检测H5N1、H7N9和H9N2亚型禽流感抗体,用实时荧光定量PCR方法对禽类环境样本进行禽流感病毒核酸检测。结果 2012年250份常规监测职业暴露人群血清样本中检出H5N1亚型抗体阳性2份,阳性率为0.80%。2013年394份常规监测职业暴露人群血清样本中检出H9N2亚型禽流感病毒抗体阳性29份,阳性率为7.36%。2013年259份专项监测血清样本中检出H9N2亚型禽流感病毒抗体阳性7份,阳性率为2.70%。2012年185份环境样本中共检出流感病毒阳性22份,阳性率为11.89%;其中H5亚型阳性13份、H9亚型阳性7份、A未分型阳性2份。2013年6 264份市场环境样本中共检出流感病毒阳性204份,阳性率为3.26%;其中H7N9亚型阳性5份、H5亚型阳性13份、H9亚型阳性80份、A未分型106份。结论广州市市场环境中存在H7N9病毒污染,暂未发现职业暴露人群感染H7N9禽流感病毒,但该人群H9N2隐性感染情况较为严重。