低分子量尿激酶与血纤蛋白粘附肽(12肽)融合表达及特性分析

人工合成血纤蛋白粘附肽（１２肽）ｃＤＮＡ，与低分子量单链尿激酶基因重组，获得血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿激酶的融合基因。将此融合基因重组入ｐＢＶ２２０表达载体并在大肠杆菌中表达，表达产物具有与天然尿激酶相同的抗原性和溶纤活性，同时兼具血纤蛋白粘附肽（１２肽）的抗血纤蛋白单体聚合的活性     

开发中的抗栓剂——水蛭素及其12肽

综述了水蛭素的生物学特性和理化性质，以及水蛭素的结构及其与功能关系的研究进展，叙述了水蛭素作为抗栓剂比肝素失优越之处，讨论了水蛭素羧端１２肽的抗栓性能，认为它也是一个可供选择的抗栓剂。     

低分子量尿激酶与血纤蛋白粘附肽（12肽）融合表达及特性…

人工合成血纤蛋白粘附肽（１２肽）ｃＤＮＡ，与低分子量单链尿激酶基因重，获得血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿酶的融合基因。将此融合基因重组入ｐＢＶ２２０表达载体并在大肠杆菌中表达，表达产物具有与天然尿激酶相同的抗原性和溶性活性，同时人血纤蛋白附肽（１２肽），的抗血纤收白单体聚合的活性。     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的高效表达

目的：构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合基因,并在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中高效表达。方法：应用重组ＤＮＡ 技术,将编码尿激酶原信号肽的ＤＮＡ 片段,与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶基因融合在一起,并插入真核表达载体ｐＭＪＫ３ 中,构建成重组质粒ｐＭＪＫ３Ｄ。通过细胞电击穿孔法,将该重组质粒转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－ ）中,转染细胞经选择培养基筛选,并采用ＭＴＸ加压扩增培养。结果：得到了高效表达融合蛋白的细胞株,表达水平为３００ Ｕ／（１０６ 细胞·ｄ）。通过ＥＬＩＳＡ 和溶解圈方法鉴定,该融合蛋白可与Ｄ－二聚体结合,并具有激活纤溶酶原溶解纤维蛋白的活性。结论：成功构建并获得高效表达双功能融合蛋白的细胞株,为进一步研究这一双功能融合蛋白的体内外特异溶栓活性以及评价其作为新型导向溶栓制剂奠定了基础。     

RAP结合肽-hFcγ1融合蛋白的表达与初步活性鉴定

目的：将肽库筛选到的正调控金黄色葡萄球菌(金葡菌)外毒素分泌的关键分子RAP(RNA Ⅲ activating protein)的结合肽与人IgG1抗体Fc片段(hFcγ1)融合表达，检测其干扰金葡茵外分泌毒素产生的活性。方法：根据噬茵体肽库筛选到的RAP结合肽序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子合成基因片段，将其融合在人IgGl抗体Fc片段基因序列的5’端，构建pET-rapbp-fc融合表达载体，转化大肠杆菌并诱导表达。以包涵体形式存在的目的蛋白经变性、复性后。ELISA实验分别证实其与抗人IgG抗体及纯化RAP的结合活性。以MDBK细胞株为模型，MTI实验观察融合蛋白对金葡菌196菌株外分泌毒素水平的影响。结果与结论：融合基因在大肠杆菌中获得表达。复性后，融合蛋白的Fc片段及结合肽部分分别能够与抗人IgG抗体及RAP结合，且能在一定程度上降低金葡菌196株上清中的毒素水平。     

舰员初次远航中血浆血管紧张素Ⅱ、内皮素、降钙素基因相关肽的水平观察

目的　探讨远洋航行人员在特定环境中的一些生理、生化方面的变化。方法　应用放射免疫法检测初次出海人员远航前及远航 87h后血浆血管紧张素 (A )、内皮素 (ET)、降钙素基因相关肽 (CGRP)及血压、心率的改变。结果　远航中血浆 A 、ET、CGRP均明显高于远航前 (P<0 .0 1) ;收缩压及心率无明显变化 (P>0 .0 5 ) ,而舒张压上升明显 (P<0 .0 0 1) ,但仍在正常范围。结论　远航时体内缩血管物质 A 、ET和舒血管物质 CGRP可能参与了远航人员体内的应激发生机制 ;而需要引起我们临床医生关注的是对有高血压病及年龄较大的人群在远航时发生的血压改变     

H89抑制降钙素基因相关肽促兔成骨细胞OPG表达的实验研究

目的：探讨降钙素基因相关肽（CGRP）对兔成骨细胞骨保护素（OPG）表达的影响以及用特异性PKA抑制剂H89抑制cAMP/PKA信号通路后OPG表达的变化。方法：将体外培养的兔颅骨成骨细胞在使用或不使用H89预处理后,加入外源性CGRP孵育48 h,提取各组细胞mRNA,通过半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）来观察成骨细胞OPG mRNA表达强度的变化。结果：CGRP显著刺激兔成骨细胞OPG mRNA的表达,这种刺激作用在24h时达到峰值。使用H89抑制cAMP/PKA信号通路后,CGRP诱导的OPG mRNA的表达下降了约50%。结论：CGRP对骨代谢的调节作用部分是通过促进成骨细胞OPG的合成与分泌,并且这种调节作用可能是通过激活cAMP/PKA级联信号而实现的。     

siRNA真核表达载体构建及对细胞MSTN基因抑制的研究

肌肉生长抑制素是肌肉生长的负调控因子。本研究为了得到有效抑制绵羊MSTN基因的siRNA分子,设计8对siRNA寡聚核苷酸引物,经退火与pSilencerTM4.1-CMV neo连接构建siRNA真核表达载体,转染C2C12细胞后,利用RT-PCR及real time PCR检测干扰效果。结果显示,8条siRNA分子中有3条对MSTN基因有显著的抑制作用,其中psi-mstn-717和psi-mstn-986分子对MSTN mRNA抑制效率分别达到61%和53%。本研究证实载体表达siRNA能有效抑制细胞MSTN mRNA的表达,下一步筛选的siRNA将用于体内实验。     

降钙素基因相关肽在运动病大鼠传出前庭系统和前庭核的表达（摘要）

目的运动病因其高发生率和机制不明一直以来是困扰航空航天的重要医学问题。研究表明前庭传出神经系统降钙素基因相关肽（CGRP）阳性纤维调节外周前庭信号向中枢的传递过程。因此,CGRP有可能在运动病的发病过程中发挥了一定的作用。为了明确CGRP与运动病的关系,我们观察了CGRP在运动病大鼠前庭传出中枢神经系统和前庭核的表达变化,     

穿膜肽TAT的表达与活性的初步研究

目的：构建原核表达载体,获得纯化的融合蛋白TAT-GFP,以便于考查TAT的细胞定位及穿膜功能。方法：将TAT基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因串联于原核表达载体pET28a中,通过IPTG诱导融合表达。分离纯化的融合蛋白与BHK-21细胞共孵育一定时间后,激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的定位;同时以尾静脉注射方式进行小鼠给药实验,一定时间后麻醉,将主要器官组织取出、固定、冰冻切片,荧光显微镜下观察蛋白的分布情况。结果：DNA测序证明成功构建融合蛋白表达载体pET28a-tat-gfp。经诱导表达、纯化可获得纯度为85%以上的融合蛋白TAT-GFP。细胞实验表明,融合蛋白可迅速透过细胞膜并广泛分布于BHK-21细胞内,其中尤以细胞核内最多,而对照组GFP蛋白则不能穿透细胞膜入胞;动物实验中,给药2h后即可观察到TAT携带GFP到达小鼠的各主要器官和组织,甚至穿透血脑屏障分布于脑组织部分。结论：融合表达的穿膜肽TAT具有一定的携带生物分子（GFP）穿膜功能,本研究为深入了解TAT的性质及其未来应用奠定了一定的基础。     

人β干扰素基因的改构及其融合表达和纯化

目的 :通过基因改构来提高人 β干扰素基因原核表达产物的稳定性和比活性。 方法 :用RT_PCR法从人外周血淋巴细胞中获得人 β干扰素基因。定点突变后 ,克隆至表达载体pGEX_2T。IPTG诱导该基因的表达 ,亲和层析和原位裂解法纯化表达产物。结果 :获得大量纯化产物 ,且稳定性和活性获得极大提高。结论 :基因改构可以提高人 β干扰素基因原核表达产物的稳定性和活性     

IFN-α2a - GFE-1融合基因的构建及表达

 目的构建IFN-α 2a-GFE-1融合基因载体,检测其在转染细胞的表达,为肺癌基因导向药物治疗积累实验资料.方法应用聚合酶链式反应技术(PCR)对干扰素(IFN)-α 2a羧基端的酶切位点进行改造,并人工合成肺特异性结合多肽CGFECVRQCPERC(GFE-1)的寡核苷酸片段,二者连接后克隆入pGEM-3zf质粒,连接产物转化感受态DH5α细胞,挑选阳性克隆经EcoRⅠ+PstⅠ酶切鉴定后测序,将测序正确的目的基因从测序载体相应酶切位点消化回收并纯化后,与上述酶处理过的PBV220质粒连接,连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经筛选后随机挑选阳性菌落,提取质粒酶切鉴定.结果序列分析表明合成片段成功的插入IFN-α 2a羧基端,大小、位置、方向均正确无误;融合基因克隆入PBV 220表达载体在大肠杆菌中获得有效表达.结论IFN-α 2a-GFE-1融合基因载体的构建及表达,为检测其在肺内特异性分布及抑瘤活性研究提供了实验基础.     

特异性鼠抗人交联纤维蛋白ScFv基因的克隆、表达及ScFv－Scu－PA－32K融合蛋白的构建

特异性鼠抗人交联纤维蛋白ＳｃＦｖ基因的克隆、表达及ＳｃＦｖ┐Ｓｃｕ┐ＰＡ┐３２Ｋ融合蛋白的构建黄君健黄翠芬俞炜源军事医学科学院生物工程研究所北京１００８５０为了获得具有导向作用的特异性抗体，采用目前最新的噬菌体抗体库技术，制备特异性抗人交联纤维蛋白单...     

健康飞行员与高血压飞行员血浆内皮素和降钙素基因相关肽含量的比较

Objective To compare the difference of plasma endothelin (ET) and calcitonin generelated peptide (CGRP) concentration between healthy and hypertensive civil pilots. Methods Plasma ET and CGRP concentration were measured by radioimmunoassay in 87 healthy (as control group) and 92 hypertensive civil pilots. Results The plasma concentration of ET and CGRP was respectively (49.3±8.64) pg/ml,(51.2±19.23) pg/ml in healthy pilots,and (65.8±9.32) pg/ml,(31.6±15.46) pg/ml in hypertensive pilots.Comparing to the healthy the hypertensive pilots showed significantly higher plasma ET (t=12.26,P<0.01)) but lower CGRP concentrations (t=7.54,P<0.01). Conclusions The secretion maladjustment of plasma ET and CGRP would be the important reasons for inducing civil pilot's hypertension and the attentive monitoring is suggested.     

降钙素基因相关肽对成骨细胞核因子-κB受体活化因子配体及其饵受体表达的影响

目的:探讨外源性降钙素基因相关肽(CGRP)对体外培养兔成骨细胞核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)及其饵受体骨保护素(OPG)表达的影响。方法:将体外培养的兔成骨细胞用不同浓度的CGRP作用24h后,通过免疫细胞化学及图像分析的方法观察成骨细胞OPG、RANKL表达强度的变化。结果:CGRP呈剂量依赖性的上调成骨细胞OPG的表达同时下调RANKL的表达。结论:CGRP上调成骨细胞OPG/RANKL/的表达比值,从而间接调节破骨细胞分化及活性。     

胃扩张对大鼠中枢和外周神经系统c -fos和外周降钙素基因相关肽mRNA表达的影响

 目的 探索大鼠伤害性胃扩张后内脏刺激传入的途径和部位,了解外周降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)在内脏刺激传入过程中发挥的作用.方法 成年SD雄性大鼠,随机分为实验组(12只)、手术对照组(6只)和空白对照组(6只).实验组、手术对照组先予置入胃内气囊.48h后,实验组接受反复的气囊扩张(80 mmHg),2 h后处死全部实验动物,立即取材(胃壁、脊髓T8～10和脑).利用荧光定量PCR进行c-fos mRNA和CGRP mRNA的定量分析.结果 实验组杏仁核、延髓、胸髓和胃窦组织c-fos表达较其他两组明显增强(P＜0.05).实验组胃窦、胸髓和延髓CGRP表达显著增强(P＜0.05).胸髓和延髓CGRP与c-fos表达相关(rs分别为0.778和0.774,P＜0.05).结论 胃扩张刺激可以兴奋杏仁核等皮质下中枢,CGRP参与内脏刺激信号的传入过程.     

降钙素基因相关肽在运动病大鼠前庭传出性中枢神经系统和前庭核的表达变化

目的 通过观察运动病大鼠降钙素基因相关肽（CGRP）在前庭传出性中枢神经系统和前庭核的表达变化，探讨中枢CGRP在运动病发病过程中的作用。方法 30只SD大鼠随机分为3组，其中不给予旋转运动刺激的为对照组，其它两组实验动物通过电动转椅分别给予3次和1次运动性刺激，刺激后即刻取各组动物脑干切片，用ABC法观察传出性前庭神经系统和前庭核的CGRP免疫组化反应变化。结果 运动病大鼠前庭传出性神经系统和前庭核CGRP反应与对照组相比明显增强，且刺激3次组强于刺激1次组。结论 CGRP在大鼠运动病的发病过程中发挥了一定的作用。     

耐力运动和力竭运动对大鼠心脏降钙素基因相关肽及其受体样受体表达的影响

目的:探讨耐力运动和力竭运动对降钙素基因相关肽(CGRP)及其受体样受体(CRLR)在大鼠心脏组织中表达的影响及其作用机制。方法:健康雄性SD大鼠60只,随机分为对照组、耐力运动组和力竭运动组。耐力运动组和力竭运动组进行10周的跑台耐力训练,力竭运动组在最后一次训练后48h进行连续3天的力竭运动。采用放射免疫法、免疫组化SABC法、免疫荧光法和计算机图像分析技术检测心肌组织CGRP含量和CRLR表达。结果:耐力运动组心肌组织CGRP含量和CRLR表达明显高于对照组(P<0.05);力竭运动组心肌组织CGRP含量和CRLR表达明显低于耐力运动组(P<0.05)。结论:长期耐力运动使心脏CGRP含量增加,CRLR表达上调,增强了CGRP对心脏的作用;力竭运动导致心脏CGRP含量下降,CRLR表达下调,使CGRP对心脏的保护作用减弱。