反义c-myc和增殖细胞核抗原抑制移植血管狭窄研究

目的探讨血管移植后联合应用c-myc和增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡核苷酸(AODN)抑制血管平滑肌增殖和防止移植血管狭窄的作用。方法选40只新西兰雄性白兔,随机分为对照组(A组)、c-myc-AODN组(B组)、PCNA-AODN组(C组)和c-myc—AODN加PCNA-AODN组(D组),每组10只;将同一只兔的左、右髂外动脉(各1.0 cm)对换移植,移植血管用c-myc-AODN和PCNA-AODN液浸泡转染;术后4周时B超观察移植血管通畅情况和内径,同时取移植血管制片显微镜下测量其内膜厚度、内膜面积和移植血管狭窄率,并用免疫组织化学染色计数c—myc和PC—NA阳性细胞数。结果D组的移植血管内膜厚度、内膜面积、管腔狭窄程度和c-myc阳性细胞及PCNA阳性细胞数均显著低于A组(P<0.01),而且亦明显低于B组或C组(P<0.05);其内径比A组(P<0.01)、B组和C组显著增大(P<0.05);B组和c组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论联合应用c-myc—AODN和PCNA-AODN能有效抑制VSMC增殖,阻止内膜增生,防止移植血管狭窄。     

联合转染反义c-myc寡核苷酸和组织纤溶酶原激活物基因预防损伤后动脉内膜增生的研究

目的观察血管局部联合转染c-myc反义寡核苷酸(AODN)和组织纤溶酶原激活物(tPA)基因对损伤后动脉内膜增生的影响。方法将同一只兔的左、右髂外动脉(各1·0cm)对换移植,移植血管分别用脂质体、c-myc-AODN和pBudCE4·1/tPA液浸泡,血管吻合口用上述3种液体浸泡过的缝线吻合。实验终点(术后3、7、14、28、56d)分为5个亚组,术后各实验终点取移植血管标本用于病理学检测、发色底物法检测tPA活性实验、3H-TdR掺入实验和免疫组织化学染色检测。结果术后各时间点联合转染组血管的内膜面积、管腔狭窄程度、3H-TdR掺入量和增值细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数均显著低于对照组(P<0·01),而且亦明显低于c-myc-AODN和tPA单独转染组(P(0·05)。结论血管局部联合转染c-myc-AODN和tPA基因能有效抑制内膜增生,防止损伤血管狭窄。     

联合转染tPA基因和PCNA反义寡核苷酸抑制兔自体移植动脉再狭窄研究

目的研究血管局部联合转染组织型纤溶酶原激活物（tPA）基因和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸（PCNA—ASODN）对自体移植动脉血管再狭窄的防治作用。方法120只新西兰雄性白兔，按数字表法随机均分为4组（对照组、PCNA—ASODN组、tPA组、tPA＋PCNA—ASODN组）。将同一只兔的左、右髂外动脉（各1、0cm长）对换移植，移植血管及吻合口缝线分别用pBudCE4．1／tPA和PCNA-ASODN液浸泡。于术后3、7、14、28及56d取移植血管制片，显微镜下观察内膜增生情况，计算机图像分析测量其内膜面积和移植血管狭窄率，扫描电镜观察移植血管壁血栓形成情况，并分别用RT—PCR和免疫组织化学染色法检测tPA基因的mRNA表达率与PCNA阳性细胞百分率。结果术后3、7、14和28d时，tPA组与tPA＋PCNA-ASODN组的tPA基因mRNA表达率明显高于另2组（P〈0．01），PCNA—ASODN组、tPA组和tPA＋PCNA—ASODN组PCNA阳性细胞百分率均明显低于对照组（P〈0．05，P〈0、01）。tPA＋PCNA—ASODN组和PCNA—ASODN组、tPA组各时相血管壁内膜增生比对照组明显减轻，内膜面积和管腔狭窄程度显著低于对照组（P〈0、05．P〈0．01），且tPA＋PCNA—ASODN组又明显低于另2组（P〈0．05）。扫描电镜观察显示，tPA组和tPA＋PCNA-ASODN组血管壁只见少量血小板附着，未见血栓形成，而对照组血管壁可见大量血小板附着，且有血栓形成。结论血管局部联合转染tPA基因和PCNA—ASODN能有效抑制VSMC增殖和血栓形成，阻止内膜增生，防止移植血管狭窄。     

血管外支架预防猪大隐静脉移植血管再狭窄的实验研究

目的以猪大隐静脉-颈总动脉旁路移植动物模型为基础,观察涤纶血管外支架支持预防静脉移植血管内、中膜增生的作用。方法将10只25~30kg普通长白猪行双侧大隐静脉-颈总动脉旁路移植术(端侧吻合),一侧静脉移植血管放置涤纶外支架(实验组),另一侧作为对照(对照组)。术后35d取出移植血管进行组织学和免疫组织化学检测。结果对照组静脉移植血管内膜增生较实验组明显增加(0.4872±0.0706mm vs.0.2259±0.0553mm,P<0.01);对照组中膜增生亦较实验组增加(0.6246±0.0859mm vs.0.4201±0.0615mm,P<0.01);对照组内膜面积是实验组的2倍,中膜面积是实验组的近1.5倍。实验组内膜及中膜内侧区域增殖细胞核抗原(PCNA)、血小板源性生长因子(PDGF)阳性细胞显著减少,PCNA从7.98%±4.06%减少至3.35%±0.95%(P<0.01),PDGF从9.47%±5.35%减少至2.67%±0.97%(P<0.01)。结论非限制性涤纶血管外支架可以显著抑制大隐静脉移植血管新内膜及中膜增生,可能预防大隐静脉移植血管的再狭窄。     

人arresten基因转染对自体移植静脉内膜增生的影响

目的:探讨体内转染arresten基因对自体移植静脉内膜增生的影响。方法:建立大鼠自体静脉移植模型。血管吻合术前，用脂质体介导重组质粒pSecTag2-AT（Ⅰ组），空载体pSecTag2转染（Ⅱ组）移植血管，等体积脂质体溶液处理移植血管(空白对照组，Ⅲ组）。各组动物均于4周后切取移植血管，RT-PCR检测移植血管中arresten mRNA的表达；常规HE，Verhoeff弹力纤维染色；计算机图象分析检测移植静脉血管内膜及中膜面积、厚度；免疫组化检测移植血管内膜α-SMA及PCNA的表达；Western blot检测TGF-β1蛋白的表达。结果:Ⅰ组转染的移植静脉中有目的基因mRNA的表达, 而Ⅱ、Ⅲ组无Ⅰ组内膜、中膜面积小均于Ⅱ组和Ⅲ组，差异有显著性（P<0.05）。而内膜面积/中膜面积3组间无统计学差异（P>0.05）；Ⅰ组内膜厚度小于Ⅱ组和Ⅲ组，组间比较有统计学差异（P<0.01）；α-SMA染色表明增生内膜中的细胞是血管平滑肌细胞；PCNA阳性细胞数及表达指数Ⅰ组均低于Ⅱ组和Ⅲ组（P<0.05）；Ⅰ组TGF-β1蛋白的表达明显低于Ⅱ组和Ⅲ组。结论:移植血管转染arresten基因，可有效抑制自体移植静脉内膜的增生，在防治血管移植术后再狭窄方面显示出良好的临床应用前景。     

联合转染eNOS基因反义ET核酸对自体移植静脉内膜增生的影响

目的;探讨联合转染eNOS基因和反义ET核酸对自体移植静脉内膜增生的影响。方法：制作20只自体颈静脉腹主动脉移植Wistar大鼠模型,实验组,对照组各10只,实验组移植血管行腺病毒介导的eNOS溶液浸泡和反义ET核酸凝胶涂布,对照组仅行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶兴布。术后2周取出移植血管,利用病理学,免疫组织化学,RT－PCR方法检测移植血管内膜厚度,管腔狭窄度,内膜VSMC数及PCNA阳性表达,血管ETmRNA,eNOSmRNA表达情况。结果：实验组移植血管内膜厚度,管腔狭窄及VSMC数均较对照组减小或减少,PCNA阳性表达及ETmRNA表达较对照组减少,而eNOSmRNA表达则明显增加。结论;联合转染NOS基因和反义ET核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生,是一种有效地防治移植静脉再狭窄的基因疗法。     

靶向PIK3cb双位点shRNA干扰抑制血管移植术后再狭窄

目的 研究RNA干扰（RNAi）对大鼠血管平滑肌细胞磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）p110β亚单位（PIK3cb）基因表达的干扰效应。方法 雄性SD大鼠150只，均行白体颈外静脉-颈总动脉移植手术，随机数字分组法分为6组：空白对照组（25％空白Pluronic F-127）、shRNA-1组、shRNA-2组、1／2（shRNA-1＋shRNA-2）组、阴性对照组（无序质粒）和阳性对照组（渥曼青霉素），每组25只。3个转染组[shRNA-1组、shRNA-2组及1／2（shRNA-1＋shRNA-2）组]通过Pluronic F-127缓释系统将shRNA均匀喷涂于移植静脉周围。分别于术后1、3、7、14及28d各取5只大鼠取材，采用计算机图像分析法测量管腔内膜厚度及新生内膜面积，Western blot（术后3d）及免疫组化染色检测细胞增殖情况。结果 术后3、7、14及28d时，3个转染组血管内膜厚度均较空白对照组及阴性对照组明显减少（P〈0．05）；而新生内膜面积3个转染组（除shRNA-2组第3、7d）于术后1d起即开始明显减少（P〈0．05）。免疫组化染色结果示术后各时间点3个转染组PCNA阳性细胞面积百分比显著低于空白对照组及阴性对照组（P〈0．05）。Western blot检测结果示术后3d3个转染组PCNA蛋白表达明显低于空白对照组及阴性对照组（P〈0．05）。各时间点空白对照组与阴性对照组血管内膜增生情况及PCNA表达情况差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 shRNA真核表达载体转染入移植静脉后能有效抑制管壁平滑肌细胞增殖，是一种防治移植静脉狭窄的基因疗法。     

转染人血红素加氧酶-1基因抑制移植静脉血管内膜增生

目的　应用含人血红素加氧酶 - 1基因 (human Heme Oxygenase- 1,h HO- 1)的重组腺病毒 (Adeno- XTMh HO- 1,Ad- h HO- 1)转染静脉移植血管 ,观察 h HO- 1基因预防静脉移植血管内膜增生的作用。　方法　将 2 1只日本大耳白兔分为 3组 ,对照组 ,Ad- null组和 Ad- h HO- 1组 ,每组各 7只。在兔颈外静脉移植于颈总动脉的血管移植术前分别应用肝素生理盐水、Ad- null和 Ad- h HO- 1病毒液常温浸泡静脉移植血管 30 min。术后 2 8d病理切片观察移植血管内膜增生的情况 ,计算机图象分析仪计算新生内膜厚度、中膜厚度及二者比值 ;采用免疫组织化学染色方法 (S- P法 )观察术后 14 d、2 8d移植血管壁 h HO- 1蛋白表达情况。　结果　Ad- h HO- 1组内膜厚度、内膜厚度与中膜厚度比均显著低于Ad- null组和对照组 (P<0 .0 1) ,中膜厚度差别无统计学意义 (P>0 .0 5 )。 Ad- h HO- 1组静脉血管壁细胞 h HO- 1免疫组化染色阳性。　结论　 Ad- h HO- 1转染兔静脉旁路移植血管能够抑制内膜增生。     

联合转染血管内皮生长因子165和组织纤溶酶原激活物基因抑制兔血管损伤后内膜增生的研究

目的观察血管局部联合转染血管内皮生长因子165(VEGF165)和组织纤溶酶原激活物(tPA)基因对损伤动脉内膜增生的影响并探讨可能机制。方法采用显微外科手术方法建立兔动脉损伤模型;用微注射装置将基因转染液注入损伤血管壁,按实验终点(术后2d、1周、2周、4周和8周)分为5个亚组(每个亚组8只兔);术后各实验终点取损伤段血管用于病理学检测、电镜观察、RTPCR和免疫组织化学检查。结果术后各时间点基因转染组血管壁的VEGF165基因的mRNA表达量和tPA阳性细胞数明显高于对照组(P<0.01)。与对照组比较,术后各时间点基因转染组血管内膜面积和狭窄率均显著减小(P<0.01),术后8周时基因转染组管腔狭窄率比对照组降低了59.0%。结论局部联合转染VEGF165和tPA基因可抑制血管新生内膜增生及血管再狭窄。     

血管外支架预防猪大隐静脉桥再狭窄的实验研究

目的以猪大隐静脉—颈总动脉间置动物模型为基础,观察涤纶血管外支架支持预防静脉桥血管内、中膜增生的作用。方法20~25kg普通长白猪10只,行双侧大隐静脉—颈总动脉端端吻合,实验侧静脉桥放置涤纶外支架。术后28d取出桥血管,组织学和免疫组化检测。结果静脉桥血管内膜增生对照组(0·4269±0·0794)mm,实验组(0·1371±0·0390)mm(P<0·01);中膜增生对照组(0·4601±0·0628)mm,实验组(0·2590±0·0178)mm(P<0·01);对照组内膜面积是实验组的2·5倍,中膜面积是实验组的近2倍;实验组内膜及中膜内侧区域PCNA、PDGF阳性细胞显著减少,PCNA从(13·2±2·17)%减少至(2·34±0·68)%(P<0·01),PDGF从(13·10±1·39)%减少至(2·44±0·25)%(P<0·01)。结论非限制性涤纶血管外支架可以显著抑制大隐静脉桥血管新内膜及中膜增生,可能预防大隐静脉桥的再狭窄。     

手术缝线携载反义基因预防血管吻合口内膜增生的实验研究

目的：探讨预防血管吻合口内膜增生的新方法。了解手术缝线携载反义基因对吻合口内膜增生的影响。方法：用分别浸泡过反义，正义及错配c-myc基因溶液的保护薇乔缝线行兔颈外静脉间置于同侧颈总动脉的血管吻合。实验动物24只随机分为对照组，反义组，正义组和错配组，每组6只，4周后血管造影观察吻合口通畅情况，同时取材制片显微镜下观察其内膜增生情况，计算机图像分析测量其内膜，中膜厚度及两者比值；内膜，中膜面积及两者比值。结果：所有吻合口通畅，未见闭塞，扩张或动脉瘤，反义组的内膜厚度，内膜／中膜厚度比值及内膜面积，内膜／中膜面积比值较其他组均低（P＜0．05），其他3组间比较差异均无显著意义（P＞0．05）；各组间的中膜厚度及中膜面积间差异无显著意义（P＞0．05），结论：用浸泡过反义 c-myc溶液的保护薇乔缝线进行血管吻合，能有效地抑制血管吻合口内膜增生。     

Prevention of cardiac allograft arteriosclerosis using antisense proliferating-cell nuclear antigen oligonucleotide

Cardiac allograft arteriosclerosis limits long-term survival of recipients and is characterized by intimal thickening comprised of proliferative smooth muscle cells. Proliferating-cell nuclear antigen (PCNA) plays a pivotal role in the cell cycle regulatory genes involved in smooth muscle cell proliferation. To test the hypothesis that antisense PCNA oligodeoxynucleotide (ODN) can prevent allograft arterial intimal hyperplasia, we performed single intraluminal delivery of the antisense or sense PCNA ODN or no transfer into murine cardiac allografts. DBA/2 murine hearts were transfected and transplanted into B10.D2 mice; the allografts were harvested 4 weeks later. Severe intimal thickening with enhanced expression of PCNA was observed in untransfected and sense PCNA ODN-treated allografts, whereas antisense PCNA ODN prevented neointimal formation.     

反义c-myc寡核苷酸对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响

目的 研究反义ｃ－ｍｙｃ寡聚脱氧核苷酸（ＯＤＮ）对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响。方法 移植静脉外周涂以加有反义ｃ－ｍｙｃ寡聚脱氧核苷酸的Ｆ１２７凝胶,于术后１、２周测量静脉内膜平均厚度及观察血管内膜内ｃ－ｍｙｃ蛋白表达情况。结果 手术后１、２周,移植静脉内膜的平均厚度、内膜中ｃ－ｍｙｃ蛋白表达在反义ｃ－ｍｙｃ寡聚脱氧核苷酸组均减少,并存在量效关系（Ｐ〈０．０１）。而只用Ｆ１２７胶组及正义寡聚脱氧     

Insulin and local growth factor PDGF induce intimal hyperplasia in bypass graft culture models of saphenous vein and internal mammary artery

Objective: In arteriosclerosis and bypass graft stenosis, intimal proliferation is controlled by local and systemic growth factors, such as platelet derived growth factor (PDGF) or insulin. Intimal hyperplasia can be produced in organ culture models. Our aim was to compare neointima formation in two organ culture models of internal mammary artery (IMA) and saphenous vein (SV), with special reference to the influence of systemic and local growth stimuli. Methods: Rings of freshly isolated human SV and IMA were cultured over a 3-, 6- or 8-day period. They were distributed into five groups of incubation protocols: incubation with 10% serum; insulin 50 ng/ml and 100 ng/ml; PDGF–BB 5 ng/ml and 10 ng/ml. Frozen sections of cultured rings and pre-culture segments were subjected to elastic stain and immunohistochemistry. Antibodies directed against beta-actin and smooth muscle alpha-actin were used to characterize smooth muscle cell phenotype and against proliferating cell nuclear antigen (PCNA) to demonstrate proliferating cells. Results: Growth factor incubation caused massive intimal hyperplasia with increased elastic fibers in SV and intimal smooth muscle cell as well as matrix accumulation in IMA. Intimal thickening, PCNA and beta-actin expression reached their maximum on day 6 of culture. In both culture models, serum, insulin and PDGF caused increasing intimal thickening, with more pronounced effects in SV. Conclusions: These organ culture models demonstrate the effects of insulin and PDGF on intimal hyperplasia in IMA and SV representing models for arteriosclerosis and bypass graft stenosis and stressing the role of insulin and growth factors for neointima development.     

反义c-fos核酸对自体移植静脉内膜增生的影响

目的:利用反义核酸技术和显微外科技术,探讨反义c-fos核酸对自体移植静脉内膜增生的影响.方法:选择20只新西兰家免,等分为实验组和对照组,均行自体颈外静脉、颈总动脉移植手术,实验组移植静脉周围和血管吻合口周围应用反义c-fos核酸凝胶涂布;对照组仅行凝胶涂布.术后2周取出移植血管,分别行病理学、免疫组织化学检测移植血管内膜厚度,内膜平滑肌细胞数及PCNA阳性表达情况.结果:实验组移植血管内膜厚度、管腔狭窄度及VSMC数均较对照组减少,PCNA阳性表达情况亦较对照组明显减少.结论:反义c-fos核酸可有效的抑制移植静脉内膜的增生,是一种比较有发展前途的防治移植静脉内膜增生的基因疗法.     

全反式维甲酸对移植心脏血管增殖病变的影响

目的探讨全反式维甲酸（all—trans retinoic acid,atRA）对移植心脏血管增殖病变的影响。方法将近交系健康雄性Wistar大鼠16只作供体,SD大鼠16只作受体,采用Ono法建立大鼠异位心脏移植模型,用完全随机设计将动物分为慢性排斥组和atRA治疗组,每组8只。慢性排斥组术后给予环孢菌素A10mg／（kg·d）,皮下注射;atRA治疗组术后同法给予环孢霉素A,并给予atRA10mg／（kg·d）灌胃。移植60d后取移植心脏,行HE、Masson、Van Gieson染色,分析移植心脏排斥反应、血管狭窄及心肌纤维化程度;免疫组织化学染色检测细胞增殖核抗原（PCNA）。结果慢性排斥组心肌纤维化面积明显大于atRA治疗组（63．99％±11．91％vs．34．68％±6．34％）,两组比较差异有统计学意义（t=8．377,P=0．000）;慢性排斥组移植心脏血管狭窄指数高于atRA治疗组（62．86％±17．18％ vs．40．10％±8．20％）,atRA治疗组血管狭窄明显减轻,两组比较差异有统计学意义（t=3．913,P=0．006）;慢性排斥组PCNA阳性细胞明显高于atRA治疗组（60．17±17．74 vs．33．96±8．65）,两组比较差异有统计学意义（t=5．387,P=0．001）,且PCNA阳性细胞率与血管狭窄指数呈正相关（r=0．854,P=0．007）。结论全反式维甲酸可以通过细胞增殖途径抑制移植心脏血管病变。