蛇毒金属蛋白酶抑制剂对小鼠黑色素转移瘤血管生成拟态形成的影响

目的:研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a对血管生成拟态形成的影响.方法:将BJ46a基因转染B16细胞,建立稳定转染的B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a细胞株,通过C57BL/6小鼠实验性肺转移模型,模拟肿瘤细胞降解局部细胞外基质、进而侵袭转移过程,应用光镜和超薄切片透射电镜技术观察BJ46a基因转染对血管生成拟态形成的影响.结果:小鼠黑色素瘤内存在血管生成拟态,稳定转染的B16/pcDNA3.1HisC-BJ46a细胞株抑制其肿瘤血管生成拟态的形成.结论:BJ46a通过抑制血管生成拟态形成,从而抑制肿瘤的侵袭转移.     

蛇毒金属蛋白酶抑制剂基因的合成及杆状病毒表达载体的构建

研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂（BJ46a）基因的合成及杆状病毒表达载体的构建。根据GenBank中查找的BJ46a基因序列（AF294836），将其分为20个片段，通过缓慢退火PCR法使之拼接为完整的BJ46a基因，经SacⅠ及XhoⅠ双酶切后定向克隆到载体pET-42a（＋）中，PCR扩增、酶切及测序鉴定；根据测序结果用定点突变法逐一改正错误位点。随后将该基因插入到转座载体pFastBac HT C的MCS中，转化大肠杆菌DH5 α-T1，以LB／AP平板筛选阳性重组子，PCR扩增、酶切鉴定，提取pFastBac HT C-BJ46a重组体进一步转化DH10Bac感受态细胞，48h后通过蓝白筛选，挑取单个白色菌落划线，证实所得菌落均为白斑，挑克隆PCR鉴定。结果表明成功构建杆状病毒重组转座载体、重组穿梭载体。含BJ46a基因的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，获得目的蛋白的表达。BJ46a基因的合成及杆状病毒表达载体的成功构建，为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。     

蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂的表达对黑色素瘤B16细胞侵袭与转移的作用

目的探讨蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin（sv-cystatin）在黑色素瘤细胞侵袭与转移中的作用。方法构建真核表达质粒pcDNA3．1／sv-cystatin,采用脂质体法将重组质粒导人小鼠黑色素瘤B16FI细胞。G418筛选抗性克隆,Western blotting法和RT-PCR鉴定sv—cystatin在黑色素瘤细胞中的表达,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测肿瘤细胞体外生长和黏附能力的变化,体外侵袭、运动实验和小鼠实验性肺转移模型分析sv-cystatin表达对黑色素瘤细胞体内、外侵袭力的影响。结果sv-cystatin基因稳定转染后B16F1细胞体外侵袭与运动能力明显降低,其穿膜的细胞数显著低于B16F1／pcDNA3．1空载体组和未转染细胞组（P〈0．01）;sv—cystatin的表达可抑制C57BL／6小鼠肺转移瘤灶的形成;其体外增殖及黏附能力未见明显改变。结论sv—cystatin基因转染可抑制黑色素瘤B16细胞的体内、外侵袭与转移能力。     

APRIL调节基质金属蛋白酶的表达对结直肠癌细胞转移侵袭能力的影响

目的 研究增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞转移侵袭能力和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)表达的影响,以进一步明确APRIL在CRC转移中的作用.方法 APRIL基因的小干扰RNA质粒载体(siRNAAPRIL)转染人CRC细胞SW480,APRIL重组蛋白(rhAPRIL)刺激CRC细胞HCT-116,Transwell小室转移及侵袭试验分析APRIL对CRC细胞转移及侵袭能力的影响;RT-PCR、ELISA检测MMPs的表达变化.结果 siRNA-APRIL转染的SW480细胞Transwell小室试验转移及侵袭细胞数显著减少(P＜0.05),rhAPRIL刺激的HCT-116细胞Transwell小室试验转移及侵袭细胞数显著增多(P＜0.05);MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA,分泌型的MMP-2、MMP-9蛋白表达在转染或刺激前后差别均有统计学意义(P＜0.05);MMP的抑制剂GM6001处理后,SW480对照组和rhAPRIL刺激后的HCT-116细胞Transwell小室侵袭细胞数显著减少(P＜0.05).结论 APRIL通过调节MMPs的表达促进结直肠癌的侵袭和转移,可为结直肠癌转移的干预及治疗提供新的靶点.     

雌激素通过钙蛋白酶上调P21/CCNE2 mRNA表达并促进乳腺癌细胞MCF-7的侵袭能力

目的探讨17β-雌二醇(E2)对乳腺癌细胞mRNA表达,观察E2侵袭的分子信号机制。方法以乳腺癌细胞MCF-7为观察模型,用RT-PCR检测目的基因周期抑制蛋白P21和周期蛋白E2(CCNE2)mRNA的表达;Transwell体外侵袭实验检测细胞侵袭能力;蛋白印迹法检测蛋白表达;采用化学抑制剂或基因沉默法抑制胞内钙蛋白酶(CANP)活性。结果 E2(10 nmol/L)可刺激P21和CCNE2 mRNA表达显著增加(P0.01);CANP抑制剂calpeptin(10μmol/L)或MEK抑制剂PD98059(10μmol/L)对E2诱导的P21和CCNE2 mRNA上调均有显著抑制作用(P0.01);E2刺激细胞侵袭能力明显增强(P0.01),而基因沉默CANP2明显抑制E2对CANP的激活及E2诱导的细胞侵袭效应(P0.01)。结论 E2可通过激活胞内CANP诱导乳腺癌细胞P21和CCNE2 mRNA表达上调并促进细胞侵袭,提示CANP可能为抑制乳腺癌转移的一个潜在药物靶点。     

基质金属蛋白酶与肺癌的转移

基质金属蛋白酶是与肿瘤侵袭和转移有关的重要物质之一，它能降解细胞外基质的各种蛋白成分，许多肿瘤等都伴有基质金属蛋白酶活性的改变，其中以基质金属蛋白酶在肿瘤侵袭和转移中的作用最引人注目。     

脉冲电场对人宫颈癌Hela细胞侵袭转移能力的影响

背景：脉冲电场对肿瘤细胞侵袭转移能力是否具有抑制作用尚不十分清楚。 目的：探讨不同强度脉冲电场对人宫颈癌Hela细胞侵袭转移能力的影响及可能的机制。 方法：以场强分别为0,500,1 000和1 500 V/cm的脉冲电场作用人宫颈癌Hela细胞后,采用平板克隆形成实验,观察脉冲电场对细胞克隆能力的影响;采用Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭和转移实验,观察脉冲电场对细胞侵袭和转移能力的影响;采用RT-PCR法检测宫颈癌Hela细胞中基质金属蛋白酶2和RhoC基因mRNA的表达情况。 结果与结论：脉冲电场作用后,宫颈癌Hela细胞的克隆能力受到抑制;细胞侵袭和转移能力明显降低;基质金属蛋白酶2和RhoC基因mRNA的表达均明显减弱,且有电场强度依赖性。结果表明,脉冲电场能抑制人宫颈癌Hela细胞的侵袭转移能力,其机制可能与降低RhoC和基质金属蛋白酶2的表达有关。     

Doxycycline对PC—3细胞金属蛋白酶表达及生物学行为影响的意义

目的 研究Doxycycline抑制雄性激素非依赖型前列腺癌细胞PC－3细胞金属蛋白酶蛋白酶的表达及其与体外侵袭转移能力的关系。方法 以免疫组织化学方法和transwell小室法研究不同浓度的Doxycycline对PC-3金属蛋白酶的表达的影响及对体外侵袭转移能力的影响。结果 免疫组织化学方法检测结果表明Doxycycline可以抑制PC－3细胞对金属蛋白酶蛋白的表达,transwell小室法结果显示Doxycycline可以抑制PC－3的侵袭转移能力,且两者均具有浓度依赖性。结论 Doxycycline可以抑制PC－3的侵袭及转移,与其抑制金属蛋白酶的表达有关。为Doxycycline治疗前列腺癌提供了实验依据。     

纤黏连蛋白重组多肽CH50抑制黑色素瘤MMP-2和MMP-9表达、激活的研究

目的研究纤黏连蛋白重组多肽CH50对黑色素瘤B16细胞侵袭能力的影响,探讨CH50多肽抑制肿瘤生长、侵袭的机制。方法体外培养小鼠黑色素瘤B16细胞、小鼠腿部皮下注射B16细胞建立肿瘤动物模型。采用明胶电泳法检测B16细胞和黑色素瘤组织中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达和激活;以CH50多肽体外处理B16细胞或体内表达CH50,观察CH50下调MMPs表达以及对肿瘤细胞侵袭能力的抑制作用。结果B16细胞在体外培养条件下主要表达MMP-2,而在肿瘤微环境中则同时表达MMP-2和MMP-9。肿瘤组织中MMPs的表达明显高于体外培养B16细胞。CH50多肽对体外培养B16细胞的MMPs表达和激活无明显抑制作用,但处理后的B16细胞进入体内后表达MMPs的能力受到明显抑制。体内转染表达的CH50多肽亦可明显抑制肿瘤表达MMPs、并抑制肿瘤侵袭能力。结论纤黏连蛋白重组多肽CH50可以抑制肿瘤微环境中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达和激活,从而抑制黑色素瘤生长及侵袭能力。     

甘草酸对人肺癌细胞增殖和侵袭抑制作用的机制探讨

目的　探讨甘草酸对高转移人肺癌细胞 (PGCL3)增殖抑制、抗侵袭和诱导凋亡的作用 ,并探讨其抗增殖和侵袭作用的机制 .方法　用 0 .5mmol/L和 1.0mmol/L甘草酸处理PGCL3细胞 96h ,进行细胞增殖抑制试验、软琼脂集落形成试验、侵袭、粘附和运动试验 ,以及组织蛋白酶B活性的测定 ,观察药物对PGCL3细胞增殖和侵袭能力的影响 .上述两浓度处理细胞 4 8h ,用吖啶橙 -溴化乙锭荧光双染法和末端脱氧核苷酸转移酶标记法 (TUNEL法 )检测细胞凋亡 .结果　甘草酸使PGCL3细胞增殖抑制率升高 (p <0 .0 5和p <0 .0 1)和软琼脂集落形成率显著下降(p <0 .0 1) ,呈剂量依赖性 ,半增殖抑制浓度 (IC50 )为 1.8mmol/L ;甘草酸明显减弱细胞侵袭能力 (p <0 .0 1) ,涉及侵袭关键环节的细胞粘附、运动和组织蛋白酶B分泌均受明显抑制 (p <0 .0 5和p <0 .0 1) ;甘草酸还使细胞凋亡率显著升高 (p<0 .0 1) .结论　甘草酸具有抑制PGCL3人肺癌细胞增殖和侵袭作用 .其抑制增殖的机制是通过对细胞分化和凋亡的诱导作用 ;其抗侵袭机制是对侵袭的多个基本环节起抑制作用 .     

三种含硒化合物对K562细胞的抑制作用

目的 研究比较3种新的含硒化合物在体内、外的抗癌作用和作用机制. 方法 通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和移植瘤生长抑制实验及形态学观察、流式细胞术以及激光扫描共焦显微镜,检测分析含硒化合物对K562细胞的抑制作用. 结果 3种含硒化合物能明显抑制K562细胞增殖(P<0.05)和S180、H22移植瘤(n=10)的生长(P<0.01);使K562细胞出现体积缩小,细胞膜完整,染色质高度凝集,边集,核浓染、碎裂,伴有出泡现象和凋亡小体出现等典型的凋亡特征;对K562细胞的周期分布有明显影响,且在大剂量时出现了明显的亚二倍体峰;能够明显增加K562细胞内Ca2+、Mg2+和细胞内活性氧(ROS)的荧光强度(P<0.01),但pH值和线粒体膜电位显著降低(P<0.01). 结论 3种含硒化合物均有体内、体外抗肿瘤作用,其作用机制可能与Ca2+、Mg2+、(活性氧ROS)、pH值和线粒体膜电位(MMP)诱导的细胞凋亡有关.     

褪黑素体内外对小鼠前胃癌细胞的增殖抑制与凋亡诱导作用

目的 探讨褪黑素(MLT)在体内外对小鼠前胃癌(MFC)细胞的增殖抑制与凋亡诱导作用.方法 体内实验:建立荷胃癌小鼠模型,随机分为5组:A.正常对照组;B.荷瘤空白对照组:每日注射生理盐水100 mg/kg;C.小剂量褪黑素组:荷瘤成功后(接种第6天起)每日腹腔注射MLT 25 mg/kg;D.中剂量MLT组:每日腹腔...     

Periostin表达对鼻咽癌细胞体外侵袭行为的影响

探讨Periostin表达对体外鼻咽癌（NPC）细胞侵袭行为的影响及其机制。 方法 采用Western blotting检测激光捕获显微切割纯化的鼻咽癌间质和正常鼻咽黏膜间质、鼻咽癌低转移潜能细胞系6-10B和高转移潜能细胞系5-8F及NIH 3T3成纤维细胞中Periostin的表达水平。应用阳性脂质体法将pCMV-neo-Periostin质粒瞬时转染到NIH 3T3细胞,运用Western blotting检测转染前后NIH 3T3细胞中Periostin的表达水平,利用Boyden小室穿膜侵袭实验检测Periostin蛋白对肿瘤细胞的体外侵袭能力的影响,明胶酶谱法检测其对基质金属蛋白酶（MMPs）活性的影响。 结果 Periostin在纯化的鼻咽癌间质中高表达,在纯化的正常鼻咽黏膜间质中及高转移细胞系5-8F中弱表达,在低转移细胞系6-10B及NIH 3T3细胞中不表达。瞬时转染过表达Periostin的NIH 3T3细胞中Periostin的表达明显增强。Boyden小室实验提示,分泌蛋白Periostin可明显增强鼻咽癌细胞6-10B的体外侵袭能力,转染组穿膜的细胞数与空白对照组及未转染对照组比较,明显增多(P<0.01);转染组与6-10B细胞共培养后,培养上清中MMPs的活性较对照组明显增强。 结论 Periostin 蛋白能增强鼻咽癌细胞的侵袭能力,其机制可能与上调MMPs的活性有关。     

小RNA干扰Akt2对U87恶性胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响

目的 探讨转染Akt2-siRNA表达载体阻断Akt2信号转导通路对U87恶性胶质瘤细胞运动、迁移和侵袭能力的影响. 方法 利用siRNA技术,稳定转染恶性胶质瘤细胞系U87;用RT-PCR和免疫印迹技术分别检测Akt2的mRNA和蛋白的表达;划痕实验和体外侵袭实验分别检测恶性胶质瘤细胞的运动和侵袭能力;用细胞黏附实验检测细胞的黏附能力,纤维型肌动蛋白(F-actin)聚合实验检测F-actin的聚合能力;免疫印迹技术检测LIMK的磷酸化,证明Akt2影响F-actin聚合的机制. 结果 稳定转染siAkt2载体后,Akt2的mRNA和蛋白水平均下降;细胞向划痕移动的速度比对照组慢(P<0.05);侵袭并穿透基质胶(Matrigel)的细胞数量比对照组少(P<0.01);细胞内F-actin聚合比对照组减少(P<0.05);黏附实验结果显示,黏附5min、15min后,低表达Akt2的细胞比对照组的黏附数量均减少(P<0.05). 结论 Akt2基因沉默可以通过降低F-actin聚合、降低黏附于细胞外基质的能力而降低恶性胶质瘤细胞的运动和侵袭能力.     

切割穹隆海马伞海马提取液促进放射状胶质细胞增殖和向神经元分化

Objective To investigate the proliferation and differentiation effect of hippocampal niche on the radial glia cells EM>in vitro/EM> . Methods Successfully prepared normal hippocampal extracts and transected extracts after hippocampal fimbria-fornix transection. On the proliferation and differentiation stages, the normal and transected extracts were used to investigate their effects on the radial glia cells respectively. Results On the proliferation stage, the proportion of BrdU-positive cells in the transected group was obviously higher than that of the normal group and control group（EM>P/EM>0.05）; on the differentiation stage, the number of Tuj1-positive cells in the transected group was much more than that of the normal and control group（EM>P/EM>0.05）. Conclusion The fimbria-fornix transected hippocampal extracts can promote the proliferation and neurons differentiation of neonatal rats radial glia cells EM>in vitro/EM>. These data indicate     

重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞内钙离子稳态的影响

目的 观察重组人内抑素(rhEndestatin)对佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞(AA FLSs)内钙离子(Ca2+)稳态的影响,探讨rhEndomafin促进AA FLSs凋亡的离子机制,为RA药物治疗及寻找其治疗新靶点提供实验依据.方法雄性SD大鼠12只,体质量140～160 g,分为正常组(n=3)和从模型组(n=9).模型组大鼠制备从模型,体外培养AA FLSs,应用Ca2+荧光指示剂Fluo-3/AM孵育培养的细胞,激光扫描共焦显微镜检测有、无细胞外Ca2+,而rhEndestatin作用所致AA FLSs胞内Ca2+荧光强度发生动态变化,可以判断rhEndostatin对AA FLSs胞内Ca2+浓度([Ca2+]I)的影响.结果在胞外有Ca2+的情况下,rhEndostatin可引起静态AA FLS[Ca2+];快速增加,rhEndostatin作用10s后,[Ca2+];急剧增加达峰值,继之随时间缓慢下降,停止加药50 s后,[Ca2+]I尚未回复到加药前基础水平;而在无细胞外钙环境中,rhEndostatin未引起AA FLSs[Ca2+]I变化.结论 rhEndestafin可促进AA FLSs胞外Ca2+内流,引起胞内Ca2+超载,从而促进从FLSs凋亡.     

rhG-CSF促进体外培养神经干细胞的增殖

目的 探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对小鼠胚胎神经干细胞(NSCs)增殖的作用.方法 分离培养小鼠NSCs,通过向培养基中添加G-CSF(10、30、60、100和200μg/L),四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法以及5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU) 免疫荧光染色标记检测NSCs的增殖.免疫印迹法检测NSCs增殖时信号转导与转录激活因子3(STAT3)和磷酸化信号转导和转录激活因子3(p-STAT3)的表达.结果 神经干细胞表达G-CSF受体,细胞活性随G-CSF的浓度不同表现出一定的剂量依赖性,当G-CSF的浓度为100μg/L时细胞的活性最高.G-CSF处理组的细胞增殖活性明显高于对照组.进一步证实,在G-CSF处理后,p-STAT3的表达则在5 min开始升高,30 min 到达峰值,之后开始下降,至75 min 接近正常水平.加入G-CSF受体的抗体后,p-STAT3的活化现象消失,并且细胞的增殖也明显低于G-CSF作用组,和对照组接近.结论 rhG-CSF可促进小鼠NSCs的增殖,其作用机制可能是通过细胞表面的G-CSF-R促进STAT3的活化.G-CSF可能作用于内源性NSCs的活化和增殖.     

Napsin A基因转染干预A549细胞的上皮-间质转化

目的 探讨Napsin A基因转染至A549细胞对其上皮-间质转化(EMT)的作用和机制.方法 采用慢病毒载体质粒PLJM1构建重组质粒PLJM1-Napsin A,将Napsin A基因转染至A549细胞染色体中并鉴定.用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激A549细胞构建体外EMT模型,倒置显微镜下动态观察细胞形...     

胰岛素样生长因子1在新生大鼠短暂脑缺血损伤修复中的关键作用

目的7日龄新生大鼠短暂脑缺血诱导侧脑室室管膜下区（SVZ）神经干细胞增殖,观察胰岛素样生长因子1（IGF-1）对神经干细胞增殖的影响。方法 7日龄新生SD大鼠64只,随机分为缺血组（n =24）、假手术组（n =24）、缺血阻断剂组（n =8）和缺血生理盐水组（n=8）。利用免疫组织化学方法观察缺血组和假手术组在缺血后1、4、7d SVZ新生细胞数量和IGF-1表达的变化,并观察缺血阻断剂组和缺血生理盐水组在IGF-1受体阻断剂（JB1）阻断7d后SVZ新生细胞数量和IGF-1表达的变化。结果 与同时间点假手术组比较,缺血后1、4、7d的SVZ新生细胞和IGF-1阳性细胞数量均显著增加,差异有统计学意义（P ＜0.05）;使用JB1后,缺血阻断剂组IGF-1的表达被阻断,IGF-1阳性细胞缺如,而缺血生理盐水组IGF-1表达正常;使用JB1后,缺血阻断剂组SVZ新生细胞数量显著减少,与缺血生理盐水组相比,差异有统计学意义（P ＜0.05）。结论 新生大鼠缺血再灌注损伤上调了IGF-1的表达,IGF-1表达增加促使SVZ神经干细胞增殖;使用JB1后,IGF-1的表达被阻断,神经干细胞增殖也显著减少,提示IGF-1在脑缺血损伤修复中起关键作用。     

小鼠垂体巢蛋白阳性细胞在体外具有集落生长能力

目的 研究小鼠垂体前叶中巢蛋白(Nestin)阳性细胞在体外培养环境中的自我增殖能力. 方法建立小鼠垂体Nestin阳性细胞克隆生长培养条件,观察次代细胞在其中的生长情况.应用野生型细胞和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)细胞混合培养,以及BrdU渗核实验鉴定次代Nestin阳性细胞培养过程中新生细胞群的来源.结果次代Nestin阳性细胞在克隆生长培养基中能够自我增殖.野生型细胞和EGFP细胞混合培养实验表明,新生细胞群由纯野生型细胞或纯EGFP细胞构成.BrdU渗核实验显示,24h内新生细胞群中有13%的细胞由分裂产生(n=20). 结论 部分小鼠垂体前叶Nestin阳性细胞在体外培养环境中具有克隆生长能力.