携带凋亡素基因的重组腺病毒载体对小鼠Hepa1-6肝细胞癌模型的生长抑制作用研究

目的 探讨携带凋亡素基因(vp3 gene)的重组腺病毒载体(AdAFPvp3)治疗C57BL/6小鼠肝细胞癌模型的可行性.方法 检测腺病毒AdAFPvp3、腺病毒AdCMV-eGFP滴度.建立c57BL/6小鼠皮下荷肝细胞癌模型(n=24),计算成瘤率.待小鼠皮下肿瘤长至5mm左右时,随机分为治疗组、AdCMV-eGFP对照组、PBS对照组,每组8只,分别于瘤内注射AdAFP~(5×108pfu/100μl)、AdCMV-eGFP(5×108pfu/100μl)和PBS(100μl),隔日1次,共2次.每日测量肿瘤体积并观察有无不良反应,注射后7d处死小鼠,计算抑瘤率.肿瘤、肝脏和脾脏均行病理检查,用TUNEL法鉴定vp3在体内诱导肝癌细胞死亡的方式.结果 腺病毒ALGAE-Pvp3、AdCMV-eGFP滴度均为5×109pfu/ml.皮下肝癌成瘤率100%.瘤内注射AdAFPvp3后,小鼠肿瘤体积较病毒AdCMV-eGFP对照组、PBS对照组明显缩小(P<0.05).治疗组抑瘤率78.87%,明显高于AdCMV-eGFP对照组(5.01%,P<0.05),治疗未见明显不良反应.凋亡素在体内以凋亡方式诱导肝癌细胞死亡.结论 重组腺病毒载体AdAFPvp3基因治疗能抑制小鼠实验性肝细胞癌生长.     

携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒对大鼠局灶性脑缺血治疗的实验研究

目的 :观察携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒 (Ad_HGF)对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用。方法 :建立大鼠局灶性脑缺血动物模型。携带人肝细胞生长因子基因的穿梭质粒与携带复制缺陷的人血清 5型腺病毒基因组的质粒在 2 93细胞进行同源重组 ,构建Ad_HGF。携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒 (Ad_GFP)载体注射到局灶性缺血大鼠的缺血侧侧脑室 ,观察其在脑内的表达部位和持续时间。动物给药治疗后 3d ,取大脑 ,平均切成 4片 ,用TTC染色评价Ad_HGF对缺血的治疗效果。结果 :Ad_GFP仅在大鼠双侧侧脑室壁及脑室内的脉络膜细胞表达 ,表达持续两周左右 ;Ad_HGF治疗组动物大脑缺血区明显小于非治疗组动物 (P <0 .0 5 )。结论 :Ad_HGF能显著缩小大鼠局灶性脑缺血区。     

重组腺病毒介导肝细胞生长因子基因治疗大鼠肝纤维化的实验研究

目的:评价携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的重组腺病毒对大鼠肝纤维化模型的治疗作用。方法:DMN法建立W istar大鼠肝纤维化模型后,将8.6×109pfu的Ad-HGF经尾静脉注射入大鼠体内,对照组注射同剂量的Ad-GFP。第40天心脏采血,检测血清GPT、GOT、TP和TB il,并取肝组织做HE染色,观察两组大鼠肝脏的病理形态。结果:治疗组部分动物肝功能有所改善,对照组不明显。与对照组相比,治疗组大鼠的肝组织损伤程度较轻,汇管区看不到明显的纤维增生,并可见双核肝细胞和分裂相细胞。结论:腺病毒介导的HGF基因可能有部分治疗大鼠肝纤维化的作用。     

重组腺病毒介导PUMA基因对胰腺癌细胞的放射增敏作用

目的 探讨重组腺病毒(Ad)介导PUMA基因联合γ线对人胰腺癌的作用。方法 以不同感染复数(MOI)的Ad-PUMA(10、50、100)转染胰腺癌PANC-1细胞,RT-PCR和Western blot检测转染前后细胞内PUMA表达。PANC-1细胞分为4组:对照组、转染组、照射组、转染联合照射组。MTT比色法和流式细胞术检测各组细胞存活率和凋亡率。人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型分为4组:对照组、转染组、照射组、转染联合照射组,在不同时间测量肿瘤生长速率和凋亡指数。结果 PUMA表达随病毒MOI增加而进行性增加(MOI=10、mRNA=0.46±0.02、蛋白=0.75±0.09;MOI=50、mRNA=1.12±0.09、蛋白=1.01±0.18;MOI=100、mRNA=1.50±0.08、蛋白=1.80±0.15;P<0.05),细胞增殖随病毒MOI增加逐渐受抑制(r=-0.986?55),经γ线照射后增殖抑制更加明显(r=-0.971?26,P<0.05),而凋亡率上升(照射前=45.4%±5.26%,照射后=73.2%±6.62%,P<0.05)。Ad-PUMA转染和γ线联合照射后7~35d,裸鼠肿瘤生长速率明显低于单纯照射组、单纯转染组和对照组[第35天肿瘤体积分别为(19.82±6.45)、(39.5±9.23)、(33.6±10.3)、(52.0±11.43)mm³,P<0.05],凋亡指数升高(AI分别为0.43±0.05、0.29±0.10、0.24±0.05、0.00±0.00,P<0.05)。结论 PUMA基因转染联合γ线照射可增强对胰腺癌细胞杀灭作用,联合治疗明显优于单纯照射和单纯基因治疗。     

白介素2重组腺病毒气管内应用治疗实验性肺转移癌的研究

为研究气管内应用白介素2（IL－2）重组腺病毒（AdIL-2)对实验性转移癌的治疗作用，向小鼠气管内滴入AdIL-2，用ELISA法测定局部及外周血IL－2及相关因子的水平，并向C57BL／6小鼠尾静脉注射Lewis肺癌3LL细胞建立肺转移癌模型，观察气管内应用AdIL-2对实验性肺转移癌的治疗作用，包括肺转移结节，动物存活期，生存率变化等，并比较自然杀伤活性（NK）和特异性细胞毒（CTL）活性的变化。结果显示，气管内应用AdIL-2后肺灌洗液中测到IL－2且高于外周血水平，对照组肺灌洗液及外周血中的水平明显低于实验组（P＜0．01），气管内滴入AdIL-2可使肺转移结节减少，动物的生存期延长，存活率升高，同时对NK，CTL活性有增强作用（P＜0．01）。提示气管内应用IL－2重组腺病毒可有效表达并对实验性肺铝有治疗作用，为肺部肿瘤的治疗提供了一种新方法。     

经肝动脉插管注射重组腺病毒的体内基因转染效率及“靶向性 …

目的　将动脉插管方法应用于重组腺病毒 (Ad .LacZ)介导的标记基因体内导入 ,观察标记基因在大鼠内脏中的转染效率和维持时间。方法　 9组大鼠 ,7组于胃十二指肠动脉分别注入Ad .LacZ[2× 10 9pfu/ml(空斑形成单位 /ml) ]各 1ml,2组注入单纯培养液各 1ml,7组实验组分别于 12h、18h、72h、7d、14d、2 1d、2 8d取动物的肝、脾、肺和肾脏 ,2组对照组于 7d取上述脏器 ,采用 β 半乳糖苷酶 (X Gal)染色方法检测LacZ基因在各个脏器的表达。结果　实验组于 12h取材 ,经染色LacZ基因在肝脏中即有表达 ,而此时脾、肺、肾等内脏器官尚未见表达 ;此后 ,18h、72h、7d、14d直至 2 1d该基因在肝脏仍有表达 ,而在其他脏器如脾、肺及肾表达仅维持 14d。对照组动物各个脏器皆无染色。结论　经动脉途径注入重组腺病毒 ,其体内的表达具有器官靶向性。如经此途径注入治疗性的目的基因重组腺病毒 ,其于肝脏表达产物出现时间早 ,并且持续时间较长。本实验结果为将来应用插管方法进行肝病基因治疗奠定了理论基础     

p53基因在肝细胞癌治疗中的现状与展望

p53基因突变可以引起细胞转化,导致癌变.通过特异性途径及载体人工导入野生型P53基因可以使肿瘤局部高表达野生型p53基因.野生型p53基因具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的功能,从而达到治疗恶性肿瘤的目的 .目前,p53基因治疗肝细胞癌的实验及临床应用也取得了一定的成绩.就p53基因治疗肝细胞癌的现状及进展情况予以综述.     

p53基因在肝细胞癌治疗中的现状与展望

p53基因突变可以引起细胞转化,导致癌变。通过特异性途径及载体人工导入野生型p53基因可以使肿瘤局部高表达野生型p53基因,野生型p53基因具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的功能,从而达到治疗恶性肿瘤的目的。目前,p53基因治疗肝细胞癌的实验及临床应用也取得了一定的成绩。就p53基因治疗肝细胞癌的现状及进展情况予以综述。     

腺病毒介导的人视网膜母细胞瘤94基因对人食管癌细胞辐射增敏作用的研究

目的 探讨重组腺病毒人视网膜母细胞瘤94基因(Ad-Rb94)对γ射线杀伤人食管癌 EC109细胞的增敏作用。方法 将Ad-Rb94体外转染后的EC109细胞,按数字随机表法,分为空白对照组、Ad-LacZ对照组、Ad-Rb94组、照射组和Ad-Rb94联合照射组,观察EC109的细胞的抑制率、细胞周期和Rb蛋白的表达。结果 Ad-Rb94组、照射组和Ad-Rb94联合照射组对EC109细胞生长均具有抑制作用,Ad-Rb94联合照射组的抑制效应最强,明显高于Ad-Rb94组和照射组(F=23.31,P<0.05)。Ad-Rb94联合照射组EC109细胞出现明显的G₂期阻滞,G₂期细胞所占比例达50%。Ad-Rb94联合照射组表达Rb蛋白的细胞明显增加,阳性率达71%,较Ad-Rb94组和照射组差异有统计学意义(χ²=8.31和6.73,P<0.05)。结论 Rb94基因联合照射能明显提高对人食管癌细胞的辐射增敏性。     

HSV-TK/GCV自杀基因系统联合γ射线放射治疗宫颈癌的实验研究

目的 探讨HSV-TK／GCV自杀基因系统协同^60Coγ射线放射治疗对人宫颈癌细胞系的体内外联合杀伤作用，以及HSV-TK／GCV对放射治疗的增敏作用。方法 分别以HSV-TK／GCV、^60Coγ射线放射治疗及两者联合治疗人宫颈癌HeLa细胞系和裸鼠宫颈癌移植瘤模型，比较治疗效果；利用增敏效应比值（E／O）、克隆形成实验评价体内外HSV-TK／GCV对放射敏感性的影响。结果 在体外实验中，自杀基因对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制率为45．8％，单纯放疗的抑制率为42．4％，而基因治疗与放疗联用的抑制率为87．5％，与前两者比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；且联合治疗组对射线敏感性较单独治疗组明显增加，克隆形成率明显下降（P〈0．05）；在体内实验中，单纯基因治疗与放疗对HeLa细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑瘤率分别为39．5％和35．8％，而基因治疗放疗联用的抑瘤率达到87．9％，与前两者比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）；增敏效应比值（E／O）为3．2（〉1．4），提示HSV-TK／GCV对放疗具有增敏作用。结论 HSV-TK／GCV自杀基因系统具有放射增敏作用，二者联合治疗可作为宫颈癌综合治疗的有效补充方法。     

重组腺病毒肝细胞生长因子对乙型肝炎病毒感染滋养层细胞的抑制作用

目的：探讨肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）体外感染滋养层细胞（JEGⅢ）的治疗作用。方法：在转染与不转染rAd-HGF两种情况下,HBV阳性血清感染JEGⅢ。用GIMSA染色、透射电镜及荧光定量PCR三种方法观察感染后细胞形态学及培养物中HBV-DNA含量的变化。结果：形态学观察转染rAd-HGF组细胞病变较未转染组有明显减轻,且未转染组胞质内可见HBV颗粒。荧光定量PCR显示未转染Ad-HGF组培养上清中HBV-DNA含量较转染组明显增高（P〈0.05）。结论：HGF可有效抑制HBV感染滋养层细胞。     

贮存温度对携带HGF基因的重组腺病毒Ad-HGF稳定性的影响

目的：探讨不同温度对重组腺病毒Ad-HGF保存时问的影响。方法：以含10％甘油的Hanks液保存Ad-HGF(携带人肝细胞生长因子基因)、Ad-GFP(携带绿色荧光蛋白基因)，用快速细胞病变(CPE)法、ELISA方法、流式细胞仪分别检测在不同贮存温度(-60℃，-20℃，4℃，25℃和37℃)、不同保存时间的重组腺病毒对其感染滴度、目的基因表达和转染细胞效率的影响。结果：-60℃保存最长时间44个月，其转染效率、HGF蛋白表达、病毒滴度未见明显下降；-20℃保存12个月各指标未见明显变化；4℃冰箱保存2个月，其各项指标已有所下降，但不是很明显，而保存7个月时，其转染效率、HGF蛋白表达量及病毒滴度均明显下降；25℃和37℃保存，除病毒滴度外，其余指标呈逐日下降趋势。结论：该病毒保存于-20℃以下性能是稳定的，可以满足临床贮存和应用条件。     

重组人p53腺病毒注射液联合顺铂胸腹腔内注射治疗恶性胸腹水疗效观察

目的 观察胸腹腔内注射重组人p53腺病毒注射液联合顺铂治疗恶性胸腹水的疗效.方法 选择住院治疗的42例恶性胸腹水患者,随机分为两组,每组21例.观察组先将胸腹水经穿刺放液尽量引流后,胸腔内灌注重组人p53腺病毒注射液2×10^12 VP,腹腔内灌注重组人p53腺病毒注射液4×10^12 VP,灌注后帮助患者改变体位,24 h后再注入顺铂40 mg/m^2,每周重复1次,4次为一疗程.对照组只应用顺铂.观察患者接受治疗后的临床症状评分、生活质量、卡氏评分及不良反应等的变化,同时记录生存期.结果 观察组疾病控制率（CR＋PR＋SD）为85.7%（18/21）,对照组为57.1%（12/21）（P＜0.05）.观察组生存质量卡氏评分提高率为76.2%（16/21）,对照组为38.1%（8/21）（P＜0.05）.结论 胸腹腔内注射重组人p53腺病毒注射液联合顺铂治疗恶性胸腹水的临床疗效好,具有重要的临床价值,不良反应轻微.     

携载人基质金属蛋白酶组织抑制剂-2基因重组腺病毒载体的构建

目的　构建携载人基质金属蛋白酶组织抑制剂 2 (hTIMP 2 )基因的重组腺病毒载体 ,为基因治疗提供实验基础。方法　利用基因重组技术将腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1以及线性化的重组穿梭质粒 pTrack CMV hTIMP 2共转化BJ5 183受体菌并在其中发生同源重组 ,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子 ,重组腺病毒质粒AdhTIMP 2经过 2 93细胞的包装 ,扩增和纯化后 ,测定病毒滴度。一步法提取细胞总RNA ,RT PCR检测hTIMP 2的mRNA。收集细胞上清 ,进行Western杂交检测TIMP 2蛋白。结果　得到了携带hTIMP 2基因的重组腺病毒 ,纯化后滴度为 4× 10 11pfu/ml,应用RT PCR和Westernblot方法 ,在转染 2 93细胞后 2 4h即可检测到hTIMP 2的表达。结论　成功地构建了携带hTIMP 2的重组腺病毒载体 ,为下一步的基因治疗提供了基础。     

重组腺病毒介导多重基因对喉癌的治疗研究

目的　探讨携带p5 3、B7 1和GM CSF基因的重组腺病毒 (BB 1 0 2 )对荷瘤裸鼠体内人喉癌细胞的基因治疗效果。方法　建立喉癌裸鼠模型 ,瘤内注射BB 1 0 2、Ad GFP和PBS ,观察肿瘤生长情况 ,并对肿瘤组织进行病理学和免疫组化检查。结果　经多因素析因方差分析 ,实验组与对照组肿瘤重量和瘤体积差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。经治疗后 ,实验组肿瘤中未发现突变型 p5 3的表达 ,Ki6 7阳性表达率极低 ;光镜和透射电镜下可见肿瘤细胞凋亡。结论　BB 1 0 2可在喉癌细胞中有效表达 ,抑制其生长 ,诱导其凋亡 ,在喉癌基因治疗中具有较好的应用前景 ,可望发展成临床上的一种抗癌剂     

重组腺病毒和质粒对心肌缺血治疗效果的比较

目的：研究不同载体对基因治疗效果的影响。方法：采用本实验室建立的犬心肌缺血动物模型，通过冠状动脉造影和TTC染色两种方法比较了携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒Ad-HGF和质粒puDKH对心肌缺血的治疗效果；并且在体外采用绿色荧光蛋白报告基因测定了不同载体对原代心肌细胞的转染率。结果：重组腺病毒Ad-HGF对心肌细胞的转染率和心肌缺血的治疗效果均发于重组质粒puDKH.结论：导入系统是影响基因治疗效果的关键因素之一。     

同源异形盒Gax基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的:构建同源异形盒Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定。方法:采用两步CaC l2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠Gax基因,将Gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(33.5 kb)的B J5183细菌,经细菌内同源重组产生携带Gax基因的重组腺病毒载体pAd-Gax,经限制性内切酶BstⅨ和PacⅠ鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,包装产生携带Gax基因的重组腺病毒Ad-Gax。利用GFP的表达鉴定Ad-Gax。结果:构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1010pfu/L。结论:成功地构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

重组腺病毒p53基因联合TACE介入治疗原发性肝癌的探讨

目的探讨重组腺病毒p53基因(rAd-p53)联合肝动脉化疗栓塞术(TACE)治疗原发性肝癌的疗效及安全可行性。方法对临床明确诊断为原发性肝癌的16例患者,采用动脉途径rAd-p53+TACE联合介入治疗,治疗30 d后按照2001年《肝癌介入治疗规范化条例(草案)》标准进行疗效评价。结果明显好转5例,好转6例,稳定4例,进展或恶化1例,除出现部分病人腹痛,发热,轻微恶心,咳嗽及短期内一过性丙氨酸和天冬氨酸氨基转氨酶升高外,未出现其他不良反应及并发症。结论动脉途径rAd-p53联合TACE治疗原发性肝癌是安全可行的,近期疗效满意。     

肝细胞癌CT表现与N-ras基因和C-myc基因表达的相关研究

目的探讨肝细胞癌螺旋CT表现与其N-ras基因和C-myc基因表达的关系.方法对36例经手术病理证实的肝细胞癌病例,术前行螺旋CT动、静脉双期增强扫描,观察其SCT表现特征包膜、子灶、门静脉癌栓、肝门淋巴结转移、肝硬化、肿瘤的大小和强化特征.用免疫组织化学的方法检测癌组织中N-ras基因和C-myc基因的表达情况.结果G-myc基因的表达在中等大小肝癌(≤5cm,＞3cm)表达高于小肝癌组(≤3cm)(P＜0.05),C-myc基因的表达在无肝硬化组高于肝硬化组(P＜0.05).N-ras的表达在各组之间的差异均无统计学意义.结论肝细胞癌的CT表现与相关基因的表达有关,根据肝细胞癌SCT表现,可在一定程度上推测C-myc基因的表达情况,对N-ras基因价值不大.     

重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞的作用及辐射敏感性的影响

目的 探讨重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞的抑制作用及其辐射增敏性。方法 利用四氮唑盐(MTT)比色法分析重组人p53腺病毒注射液、放射治疗以及两者联合应用对人淋巴瘤细胞Raji 和Daudi的抑制作用;通过蛋白质的Western印迹分析法(Western blotting)分析淋巴瘤细胞内P53蛋白的表达;应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测淋巴瘤细胞内p53基因的mRNA表达。结果 MTT结果显示重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞具有一定的抑制作用,但抑制作用不显著,Raji 及Daudi 细胞最大剂量的抑制率分别为27.5%±4.1%和28.1%±1.6%,也未见明显的辐射增敏效应。Western blotting和RT-PCR结果表明,外源性P53蛋白和p53基因的mRNA均有所表达,但未见高效表达和明显的辐射增敏性。结论 重组人p53腺病毒注射液对人淋巴瘤细胞的抑制作用及辐射增敏性不显著。