Smad锚着蛋白在糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化中的作用及机制研究

目的 研究Smad锚着蛋白(SARA)在高葡萄糖诱导的HK-2细胞转分化中的作用及相关机制.方法 用高浓度葡萄糖(30 mmol/L D-葡萄糖)刺激HK-2细胞,分别采用细胞免疫荧光、Western印迹及实时定量PCR等方法检测HK-2细胞波形蛋白(vimentin)、紧密连接蛋白(ZO-1)、SARA、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad2及Smad3的表达.分别转染全长SARA质粒[SARA (WT)]及敲除SBD结构域的SARA质粒[SARA(dSBD)],检测转染后高糖诱导的HK-2细胞Vimentin、ZO-1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3表达的变化.结果 高糖刺激时,HK-2细胞出现转分化 ;ZO-1蛋白和mRNA表达呈时间依赖性下调 ;vimentin蛋白和mRNA表达呈时间依赖性上调,而SARA蛋白和mRNA表达呈时间依赖性下调 ;TGF-β1、Smad3蛋白和mRNA表达呈时间依赖性上调 ;Smad2 mRNA表达呈时间依赖性上调,而其蛋白表达呈时间依赖性下调 ;Smad2和Smad3磷酸化,Smad3活化时间更长.与高糖刺激组相比,转染全长SARA质粒[SARA (WT)]过表达SARA使HK-2细胞ZO-1表达上调(P＜0.05) ;vimentin表达下调(P＜0.05) ;Smad2蛋白表达上调,但mRNA表达无明显变化 ;Smad2活化时间延长.转染SARA(dSBD)质粒对高糖诱导的HK-2细胞ZO-1、vimentin、Smad2的表达无影响,对Smad2和Smad3的磷酸化亦无明显影响.结论 高糖诱导的HK-2细胞转分化过程中,TGF-β1信号通路活化,SARA的表达下调.过表达SARA可能通过上调Smad2的蛋白表达,延长Smad2活化时间,从而抑制TGF-β1信号传导,进而抑制高糖诱导的HK-2细胞转分化进程.     

MG-132对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化与凋亡的影响

目的：探讨蛋白酶体抑制剂MG-132对体外培养的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化和凋亡的影响及其机制。方法：体外培养HK-2细胞,随机分组：对照组,TGF-β1刺激组（5ug／L）,MG-132组（2．5μmol／L）,MG-132＋TGF-融组（MG-132 2.5μmol／L孵育30min后再加TGF-β1 5μg／L）。培养24h后收集细胞,RT-PCR法检测Smurf1、Smurf2和Smad7 mRNA的表达;Western免疫印迹检测Smurf1、Smurf2、Smad7和P-IκB-α和IκB-α蛋白表达;免疫组织化学检测胞浆中Fn和α-SMA的表达;Hoechst 33258染色免疫荧光检测细胞凋亡形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：TGF-β1刺激组HK-2 Smurf1、Smurf2 mRNA及蛋白表达水平较对照组高（P〈0．05）,但Smad7 mRNA及蛋白表达水平较对照组低（P〈0．05）,且胞浆中FN和α-SMA水平较对照组高（P〈0．05）。MG-132＋TGF-β1组与TGF-β1刺激组比较,Smurf1、Smurf2 mRNA表达降低（P〈0．05）,Smad7 mRNA略升高（P〉0．05）,而Srnad7蛋白明显升高（P〈0．05）,胞浆中Fn和α-SMA表达减少。MG-132组、MG-132＋TGF-β1组分别与对照组及TGF-β1组比较,P-IκB-α和IκB-α蛋白浓度升高,细胞凋亡率增加,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：MG-132可抑制TGF-132诱导的HK-2 Smurf1、Smurf2的表达,促进Smad7表达,抑制其降解,减轻FN和α-SMA的表达,从而抑制HK-2转分化;另-方面,MG132可能通过抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞NF-κB活化促进HK-2细胞凋亡。     

Smad7对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞转分化和胶原I合成的影响

目的探讨Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化和胶原（Col）I合成的影响。方法体外培养转染Smad7的大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞），分为强力霉素（Dox）诱导组和未加强力霉素的对照组。前者予Dox诱导24h后，给予高糖刺激；后者不加Dox诱导。采用免疫细胞化学方法检测磷酸化（p）-Smad2／3核转位情况；RT-PCR检测Smad7的表达；Western印迹方法检测不同时间点Smad7、α-SMA、E-钙黏蛋白（cadherin）和Col I蛋白的表达水平。结果成功构建了Dox调控的可上调Smad7表达的NRK52E细胞。NRK52E细胞在基础状态下可表达低水平p-Smad2／3（16．1％），与未加Dox的对照组比较，Dox诱导组可显著抑制高糖刺激的NRK52E细胞TGF-β受体调控信号蛋白Smad2／3的活化和核转位（30.3％比58．5％，P〈0．01）。上调表达Smad7可显著抑制高糖介导的NRK52E细胞α-SMA和Col I蛋白的表达；逆转高糖介导的NRK52E细胞E-cadherin蛋白的下调表达。结论基因转染上调表达Smad7可通过TGF-β受体调控信号蛋白Smad2／3的活化和核转位而阻抑高糖介导的肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质的合成。     

CIP4对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响

目的 观察骨架调节蛋白CIP4（Cdc42 interacting protein 4）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化（EMT）的影响,并探讨其产生的机制。 方法 10 ?滋g/L TGF-β1刺激72 h诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）向间充质转分化。Western印迹法检测各组细胞内E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。倒置显微镜观察细胞形态的变化。根据GenBank人CIP4的完全cDNA序列,设计1条特异性干扰CIP4表达的RNA片段（CIP4-siRNA）和含野生型CIP4的重组真核表达质粒（pcDNA3.1-hCIP4）,利用lipofactamine 2000将其转染HK-2细胞。Western 印迹法检测对照组、TGF-β1刺激组、CIP4-siRNA转染组、pcDNA3.1-CIP4转染组细胞内CIP4、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达,共聚焦显微镜观察 E-cadherin和α-SMA蛋白的分布改变;用PI3K-Akt特异性抑制剂渥曼青霉素（wortmannin） 1 μmol/L干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,Western 印迹法检测对照组和干预组CIP4表达的变化。 结果 TGF-β1干预后HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,细胞形态由典型的上皮细胞向肌成纤维细胞转变,表明TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT模型成功。CIP4-siRNA抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞表达CIP4后,E-cadherin蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,部分逆转了上述TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT。pcDNA3.1-hCIP4转染使CIP4高表达后,HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,诱导了肾小管上皮细胞EMT。用渥曼青霉素干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,CIP4可能蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）。 结论 TGF-β1通过PI3K-Akt途径上调CIP4表达,CIP4可能进一步参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT过程。     

核心岩藻糖基转移酶siRNA抑制肾小管上皮细胞转化生长因子β-Smad2/3通路活化

目的 探讨α-1,6核心岩藻糖基转移酶（FUT8）小分子干扰RNA（siRNA）对肾小管上皮细胞转化生长因子（TGF）β-Smad2/3信号通路的影响。 方法 HK-2细胞共分为6组：正常组、阴性对照组、TGF-β1组、TGF-β1加FUT8干扰组、TGF-β1加阴性对照组、FUT8干扰组。利用外源性TGF-β1激活HK-2细胞TGF-β-Smad2/3信号通路。应用siRNA技术沉默FUT8。用免疫荧光方法测定细胞表面核心岩藻糖链表达;用免疫沉淀、凝集素免疫印迹以及免疫双染的方法测定FUT8基因沉默后TGF-βⅡ型受体（TGF-βRⅡ）、TGF-βⅠ型受体（ALK-5）的核心岩藻糖基化变化,并检测Smad2/3蛋白表达和磷酸化（p）-Smad2/3蛋白表达及其核转位的变化。 结果 与正常组及阴性对照组相比,加入5 μg/L的TGF-β1孵育HK-2细胞48 h,能显著上调 TGF-βRⅡ和ALK-5蛋白表达水平（P < 0.05）,导致p-Smad2/3表达水平明显升高（P < 0.05）,并促使其发生核转位。HK-2细胞表面存在核心岩藻糖链表达。与正常组及阴性对照组相比,TGF-β1孵育后,TGF-βRⅡ与ALK-5两种受体的核心岩藻糖链均显著升高（P < 0.05）,FUT8 siRNA能显著抑制TGF-βRⅡ与ALK-5核心岩藻糖链表达（P < 0.05）,从而抑制p-Smad2/3表达升高（P < 0.05）及其核转位,但不影响TGF-βRⅡ和 ALK-5的蛋白表达（P > 0.05）。 结论 在肾小管上皮细胞中,TGF-βRⅡ和ALK-5蛋白翻译后的核心岩藻糖基化修饰是它们发挥生物学功能所需要的,阻止TGF-βRⅡ和ALK-5的核心岩藻糖基化,能抑制TGF-β-Smad2/3信号转导通路的活化。     

G肽对血管紧张素Ⅱ诱导人肾小管上皮细胞转化生长因子β1活化的影响

目的观察根据血小板反应蛋白1（TSP1）分子WSHW序列人工合成的六肽（GGWSHW，G肽）对由血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1过度活化的抑制作用。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞系（HK-2），以未处理HK-2细胞为正常对照，以AⅡ刺激HK-2细胞（AngⅡ组），选择合成TSP1和TGF-β1最佳刺激浓度和时间。刺激前加入10μmol／LG肽进行干预（G肽组），并以AngⅡ受体阻断剂洛沙坦（losartan）为抑制对照（ losartan组）。分别用RT-PCR和Western印迹检测TSP1和TGF-β1以及细胞外基质纤连蛋白（FN）和纤溶酶原活化物抑制剂-1（PAI-1）mRNA转录和蛋白表达。共聚焦显微镜和流式细胞仪观察TSP1和TGF-β1的表达以及两者共表达。ELISA法检测培养细胞上清液中活性TGF-β1、总TGF-β1、FN和PAI-1的分泌含量。Western印迹检测TGF-β1信号转导蛋白Smad2及磷酸化Smad2（p-Smad2）表达水平。结果AngⅡ以时间和剂量依赖方式促进HK-2细胞合成TSP1和TGF-β1（优化后分别为6h的1μmol／L，12h的0．1μmol／L）。与正常对照组比较，AngⅡ组TSP1与TGF-β1阳性共表达的细胞数上调5．4倍；总TGF-β1和活性TGF-β1水平分别增加1．8和2．0倍；p-Smad2蛋白水平明显上调；FN和PAI-1 mRNA转录水平分别上调3和1．5倍，且细胞上清液中两者含量分别增加2和1．9倍。G肽对TSP1和TGF-β1 mRNA转录和蛋白表达水平均无显著性影响，且对总TGF-β1分泌无明显抑制作用，但可显著抑制活性TGF-β1的水平。此外与losartan组比较，G肽组p-Smad2蛋白表达减少28．9％。FN和PAI-1 mRNA转录水平分别下调34．5％和26％，且细胞上清液中两者含量分别减少11％和8．9％。结论TSP1肽抑制物体外能通过有效竞争抑制TSP1致HK-2细胞的TGF-β1活化作用，并可相应下调FN和PAI-1的合成分泌。     

核因子κB反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导下，核因子κB（NF-κB）反义寡核苷酸对体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响。 方法 采用脂质体介导的方法将NF-κB反义寡核苷酸（AS-ODN）导入细胞，以TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞24 h后，用RT-PCR方法检测细胞中NF-κB mRNA及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达，用荧光光谱法分析α-SMA蛋白的表达，并以倒置相差显微镜观察细胞转分化过程的形态变化。 结果 TGF-β1诱导24 h后，HK-2细胞中NF-κB mRNA的表达显著上调，为空白对照组的8倍以上（P < 0.01）。NF-κB反义寡核苷酸导入细胞后，可显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞的 NF-κB mRNA表达，比TGF-β1组减少75％（P < 0.05），同时，α-SMA mRNA和蛋白表达亦较TGF-β1组均明显下调（P < 0.05）。 结论 NF-κB反义寡核苷酸可抑制TGF-β1诱导肾小管上皮细胞NF-κB的表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，可能有利于肾间质纤维化的防治。     

加味当归补血汤对肾小管上皮细胞TGF-β1／SMADs信号转导通路的影响

目的：观察加味当归补血汤对转化生长因子β1（TGF-β1）刺激的小鼠肾小管上皮细胞Smad3、Smad4、Smad7信号通路的影响，探讨该方防治肾间质纤维化的细胞分子生物学机制。方法：原代培养BalB／C小鼠肾小管上皮细胞．用TGF-β（1ng／ml）刺激24h，加味当归补血汤及洛汀新含药血清干预。共分6组：正常组、模型组、加味当归补血汤低中高剂量组（含药血清浓度分别为2．5％、5％、10％）、洛汀新组，观察各组细胞形态学变化，检测细胞Smad3、Smad4、Smad7的mRNA和蛋白质表达情况（PT—PCR、Western-Blotting）。结果：（1）TGF-β1刺激后，肾小管上皮细胞部分形态发生变大，伸长，呈梭形，经中药加味当归补血汤和洛汀新干预后，细胞形态又恢复正常；（2）TGF-β1刺激肾小管上皮细胞后，Smad3、Smad4 mRNA和蛋白质表达显著增加，Smad7 mRNA和蛋白质则显著减少（P〈0、05～0、01）；（3）各浓度加味当归补血汤能显著下调异常增高的Smad3，上调Smad7的基因和蛋白质表达水平（P〈0．05～0．01），能显著下调Smad4基因表达。结论：加味当归补血汤防治肾间质纤维化可能与调控肾小管上皮细胞TGF-β1／Smads信号转导途径相关。     

黄芪对人肾小管上皮细胞细胞外基质分泌的影响及其机制探讨

目的：探讨黄芪对人肾小管上皮细胞细胞外基质分泌的影响及甚可能机制。方法：将体外培养的人肾小管上皮（HK-2）细胞株转板至细胞融合并同步后,分为空白对照组、转化生长因子-β（TGF-β1）刺激组（5ng／ml）、TGF-β1加黄芪100μg／ml组、TGF-β1加黄芪1mg／ml组。作用24h后半定量逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）检测纤维连接蛋白（FN）及纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）mRNA;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测上清液中FN的含量;westernblot检测PAI-1的表达。结果：（1）HK-2细胞表达少量FN和PAI-1;（2）HK-2细胞在5ng／ml TGF-β1．刺激下分泌FN、PAI—1mRNA及FN、PAI-1蛋白表达明显增加,与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）;（3）HK-2细胞在TGF-β1和不同浓度的黄芪作用后,可使FN、PAI-1mRNA及蛋白表达减少,与TGF-β1组比较差异有统计学意义（P〈0．01）,尤以黄芪1mg／mi组为甚。结论：TGF—β1可促进HK-2细胞分泌FN和PAI—1,黄芪可部分拮抗TGF-β1的上述效应。这可能是黄芪预防或改善肾小管间质病变的作用机制之一。     

红细胞生成素对高糖诱导下肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨红细胞生成素（EPO）对高糖诱导下的肾小管上皮细胞转分化的影响。 方法 体外培养人肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）,分为正常对照组、渗透浓度对照组、高糖组、高糖＋EPO（5 U/ml）组和高糖＋EPO（10 U/ml）组。RT-PCR法检测各组细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子β1（TGF-β1）、Smads信号蛋白2（Smad2）及整合素连接激酶（ILK）的mRNA表达。细胞免疫荧光法检测细胞TGF-β1及α-SMA的蛋白表达。 结果 RT-PCR结果显示,相对于对照组,高糖组细胞α-SMA、TGF-β1、Smad2、ILK的mRNA表达均显著上调（P ＜ 0.01）。细胞免疫化学也显示,高糖组TGF-β1和α-SMA的蛋白表达较对照组显著上调（P ＜ 0.01）,而高糖＋EPO（5 U/ml）组和高糖＋EPO（10 U/ml）组上述指标的表达均显著低于高糖组（均P ＜ 0.01）。 结论 EPO能抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化,可能与其抑制TGF-β1、Smad2及ILK表达有关。     

PPARγ活化对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞趋化因子表达的干预作用

目的：观察PPARγ活化对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响,探讨其在肾脏纤维化中的干预作用。方法：体外培养肾小管上皮细胞HK-2,LDH法检测15d-PGJ2和TGL对HK-2的细胞毒性,应用不同浓度的15d-PGJ2和TGL作用于TGF-β1诱导下的HK-2细胞,应用实时荧光定量PCR技术和ELISA方法检测趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、白细胞介素-8（IL-8）表达的变化。结果：5μmol/L15d-PGJ2和2.5μmol/LTGL不影响HK-2细胞MCP-1和IL-8mRNA基础表达和蛋白分泌。TGF-β1作用24h时,2.5μmol/L和5μmol/L15d-PGJ2及2.5μmol/LTGL均能有效干预TGF-β1诱导的MCP-1mRNA表达和蛋白的分泌（P〈0.05）。IL-8的表达与MCP-1相似,2.5μmol/L和5μmol/L15d-PGJ2能显著抑制TGF-β1诱导的IL-8表达,TGF-β1诱导24h时2.5μmol/LTGL能显著抑制IL-8mRNA表达（P〈0.05）。结论：PPARγ激动剂15d-PGJ2和TGL作用均能有效干预TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞趋化因子MCP-1和IL-8的表达,可能具有有效干预肾间质炎症作用。     

黄芩苷对人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的：观察不同浓度的黄芩苷对TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）细胞转分化的影响。方法：以5ng/ml的TGF-β1作用HK-2不同的时间（0、12、24、48和72h）,用RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白、E-钙黏蛋白基因表达情况。以40、80、160、320μmol/L浓度的黄芩苷与5ng/mlTGF-β1共孵育48h,每12h在倒置显微镜下观察细胞形态。结果：黄芩苷干预后可抑制HK-2梭形变,抑制α-平滑肌肌动蛋白基因表达,上调E-钙黏蛋白基因表达,且在一定范围内呈剂量依赖性。结论：一定浓度的黄芩苷在体外有阻滞TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化作用。     

大黄酸对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞血小板反应蛋白1表达的影响

目的探讨大黄酸对转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）血小板反应蛋白1（thrombospondin-1,TSP1）表达的影响。方法体外培养细胞,观察TGF-β1（4ng／ml）诱导下低、中、高浓度的大黄酸（10μg／ml、20μg／ml和40μg／ml）对HK-2细胞TSP1 mRNA和蛋白表达的影响。Real Time PCR检测TSP1 mRNA表达,Western Blot检测TSPI蛋白表达。结果与空白对照组比较,TGF-β1（4ng／ml）明显上调HK-2细胞TSP1 mRNA和蛋白表达。与TGF-β1（4ng／ml）阳性对照组比较,中浓度和高浓度大黄酸明显抑制了TSP1 mRNA和蛋白表达。结论大黄酸能抑制TGF-β1诱导的HK-2TSP1 mRNA和蛋白表达。     

去甲斑蝥素对TGF-β_1诱导的人近端肾小管细胞上皮间质转分化以及转录因子Snail1表达的影响

目的：探讨去甲斑蝥素对体外人源性肾小管细胞株（HK-2）上皮间质转分化以及转录因子Snail1的影响。方法：常规培养HK-2细胞,分为对照组、TGF-β1组、去甲斑蝥素组（NCTD组）。对照组为无血清DMEM培养,TGF-β1组为TGF-β15ng/ml诱导,NCTD组为不同浓度NCTD（0.5、1.0、2.5μg/ml）与TGF-β1（5ng/ml）共同作用,各组作用时间48h。采用RT-PCR、Western blot分别检测α-SMA、E-cadherin与Snail1表达水平的变化。结果：与对照组相比,TGF-β1组α-SMA mRNA和蛋白表达上调（P〈0.05）,E-cadherin mRNA和蛋白表达下调（P〈0.05）;与TGF-β1组相比,NCTD干预组α-SMA mRNA和蛋白表达下调（P〈0.05）,而E-cadherin mRNA和蛋白表达上调（P〈0.05）,且均呈剂量依赖性。与对照组相比,TGF-β1组Snail1 mRNA和蛋白表达上调（P〈0.05）;与TGF-β1组比较,NCTD干预组Snail1 mRNA和蛋白表达下调（P〈0.05）,具有一定的剂量依赖关系。结论：去甲斑蝥素具有抑制肾小管上皮细胞EMT的作用,该作用可能与下调转录因子Snail1的表达有关。     

AngⅡ对人肾小管上皮细胞TSP1、TGF-β1表达的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ（angiotensin-Ⅱ，AngⅡ）对人肾小管上皮细胞（HK-2）血小板反应蛋白1（TSP1）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响及其机制。方法①以AngⅡ零浓度作为空白对照，观察低、中、高浓度（终浓度分别为10^-8、10^-7、10^-6mol／L）的AngⅡ对HK-2 TSP1、TGF-β1 mRNA和蛋白表达的影响；②以0h为空白对照，观察AngⅡ（10^-7mol／L）在0、3、6、12、24h对HK-2 TSP1、TGF-β1 mRNA及蛋白表达的影响；③观察TSP1抑制剂G肽对AngⅡ刺激的HK-2总TGF-β1和活性TGF-β1表达的影响。采用Real Time PCR法检测TSP1和TGF-β1的mRNA表达；采用Western blot检测TSP1和TGF-β1的蛋白表达；采用ELISA法检测各组总TGF-β1、活性TGF-β1表达。结果与对照组比，低、中、高浓度AngⅡ均增加了HK-2细胞TSP1 mRNA表达和TGF-β1 mRNA表达，同时伴有TSP1蛋白和TGF-β1蛋白表达的增加。终浓度为10^-7mol／L的AngⅡ以时间依赖的方式促进HK-2细胞TSP1、TGF-β1 mRNA表达，同时伴TSP1和TGF-β1的蛋白表达增加，其中TSP1的表达峰值在6h，TGF-β1的表达峰值在12h。与对照组比较，10^-7mol／L的AngⅡ上调总TGF-β1、活性TGF-β1表达，10μmol／L的G肽仅下调活性TGF-β1表达，对总TGF-β1表达无影响。结论AngⅡ能促进人肾小管上皮细胞TSP1、TGF-β1表达。TSP1依赖的TGF-β1活化可能是AngⅡ诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1活化的重要途径。     

转化生长因子β1对肾小管上皮细胞中结缔组织生长因子基因启动子活性的影响

目的探讨转化生长因子[β1（TCF-β1）对人近端肾小管上皮细胞系HK-2中结缔组织生长因子（CTGF）基因启动子活性的调控作用，以及丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）途径对该生长因子作用的影响。方法构建含有人类CTGF基因启动子的报告基因pCTGF-luc，将其瞬时转染HK-2细胞。通过检测荧光素酶的活性观察TGF-β1和MAPK途径抑制剂对CTGF基因启动子活性的影响。结果TGF-β1以剂量和时间依赖方式上调HK-2中CTGF基因启动子的活性。最佳刺激浓度是5ng／ml，最佳刺激时间为12h，荧光素酶相对活性分别为对照组的1．82倍和2．10倍（P〈0．05）。应用PD98059、SB203580和SP600125分别特异性抑制MAPK途径的胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、蛋白激酶p38（p38MAPK）和c-Jun-氨基末端激酶（JNK）通路，对TGF-β1上调CTGF启动子活性的作用有不同影响。PD98059显著增加HK-2中pCTGF-luc的基础活性．并在一定浓度范围内（0．5～10μmol／L）促进TGF-β1的上调作用。SB203580对pCTGF-luc基础活性无影响，但以剂量依赖方式显著抑制TGF-β1的激活效应。而SP600125对基础状态和TGF-β1刺激下CTGF基因启动子活性无影响。结论TGF-β1以剂量和时间依赖方式上调HK-2中CTGF基因启动子活性，在转录水平调节CTGF表达。MAPK途径的ERK和p38MAPK通路可影响TGF-β1的这一调控作用。     

姜黄素对TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化及分泌细胞外基质成分的影响

目的：通过研究姜黄素（curcumin,Cur）对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化及分泌细胞外基质（ECM）成分的影响,探讨姜黄素在防治肾小管-间质纤维化方面可能的作用机制。方法：应用不同浓度Cur处理经TGF-β1诱导活化的HK-2细胞,通过显微镜观察细胞形态改变,免疫组化技术检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达;应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培养上清Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）和纤连蛋白（FN）的分泌。结果：（1）正常HK-2细胞表达E-cadherin,不表达α-SMA,经TGF-β1刺激后细胞表型发生转变,E-cadherin的表达明显减弱,α-SMA表达明显增强;（2）不同浓度Cur组与单纯TGF-β1刺激组相比α-SMA的表达有所减弱,而E-cadherin的表达增强;（3）不同浓度Cur抑制了ColⅠ、ColⅢ和FN的分泌,与单纯TGF-β1刺激组相比有统计学差异（P〈0.05）。结论：姜黄素能抑制TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质成分ColⅠ、ColⅢ和FN的合成,在一定程度上具有防治肾小管-间质纤维化的作用。     

LeftyA真核表达载体的构建及其对转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 构建pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体,观察其对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化(EMT)的影响.方法 基因克隆技术构建pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体,将其瞬时转染HK-2细胞,TGF-β1(10μg/L)刺激后,观察细胞形态变化,检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因及蛋白的表达.结果 TGF-β1刺激后HK-2细胞内E-cadherin mRNA和蛋白时间依赖性表达下调,α-SMA mRNA和蛋白时间依赖性表达上调,同时E-cadherin表达变化早于α-SMA;LeftyA蛋白可以显著抑制E-cadherin蛋白的下调表达(P＜0.05),其表达比同时间点单纯刺激组高17.6%;同时可逆转α-SMA蛋白的上调表达(P＜0.05),其蛋白表达比单纯刺激组低14.0%.结论 LeftyA蛋白可以抑制TGF-β1所致的EMT.

Abstract：

Objective To construct the eukaryotic expression vector for LeftyA and study the effects of LeftyA on epithelial to mesenchymal transition of human proximal tubular epithelial cells induced by transforming growth factor-β1 ( TGF-β1 ). Methods The pcDNA3. 1-LeftyA was constructed by recombinant DNA technique. After transfection with pcDNA3. 1-LeftyA HK-2 cells were stimulated by TGF-β1( 10 μg/L). The morphological changes, and the expression of E-cadherin, α-SMA and LeftyA mRNA and protein were observed and detected, respectively. Results TGF-β1 could markedly decrease the expression of E-cadherin mRNA and protein in HK-2 cells induced, and dramatically increase the expression of α-SMA mRNA and protein in a time-dependent manner. Forced expression of exogenous LeftyA led to a blockage of TGF-β1 -induced E-cadherin ( 17.6% ) suppression and α-SMA induction ( 14. 0% ). Conclusion Disruption of cell adherence is the beginning stage of EMT, and overexpression of LeftyA can suppress EMT induced by TGF-β1, which suggests a alprostadil role for LeftyA in TGF-β1-induced tubular EMT and renal fibrosis.