机械应力刺激对成牙骨质细胞骨桥蛋白表达影响的研究

目的研究机械应力刺激对成牙骨质细胞矿化相关基因骨桥蛋白（osteopontin,OPN）mRNA表达的影响。方法本研究设3个实验组和1个对照组,利用四点弯曲细胞力学加载装置,对体外培养的成牙骨质样细胞OCCM-30施加2 000μstrain张应力2、000μstrain压应力和4 000μstrain压应力,对照组不加力。分析加力3 h、6 h、12 h、24 h时成牙骨质样细胞OCCM-30 OPN mRNA表达差异,对数据进行统计学分析。结果和对照组相比,2 000μstrain压应力组和4 000μstrain压应力组在加力初期（3 h）OPN的mRNA表达增加,加力后期（24 h）其mRNA表达受到抑制,差异有统计学意义（P〈0.05）;2 000μstrain张应力组在加力3 h、6 h和对照组相比,OPN mRNA的表达差异无统计学意义（P〉0.05）,加力12 h、24 h OPN mRNA的表达受到抑制,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论机械应力刺激可以调节成牙骨质细胞OPN mRNA的表达,可能由此影响牙根吸收和修复过程。     

机械应力刺激对成牙骨质细胞骨涎蛋白mRNA表达影响的体外研究

目的研究机械应力刺激对成牙骨质细胞矿化相关基因骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）mRNA表达的影响。方法利用四点弯曲细胞力学加载装置,以体外培养的成牙骨质样细胞OCCM-30为研究对象,运用实时荧光定量技术,比较2 000、4 000μstrain张应力和压应力加载组和不加力组OCCM-30在3 h、6 h、12 h、24 hBSP mRNA表达差异。结果和对照组相比,2 000、4 000μstrain的张应力和压应力在4个时间点均抑制OCCM-30 BSP mRNA的表达,且差异有统计学意义（F=5.614,P〈0.05）。结论成牙骨质细胞是力学敏感性细胞,机械应力刺激通过影响其BSP mRNA的表达,进而可能影响成牙骨质细胞在牙根吸收和修复中的作用。     

静态张应力作用下人牙周膜成纤维细胞β-catenin和Wnt3a蛋白的表达

目的:研究人牙周膜成纤维细胞在不同大小机械张应力作用下Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin和Wnt3a蛋白的表达变化。方法:运用酶解组织块法体外培养人牙周膜成纤维细胞,将细胞按加力时间的不同(2 h、4 h、6 h)分为3组,每组再按形变率不同将其分为8%、12%和16%3个亚组,并取加力时间0h、形变率0%作为对照组。用western blot技术检测细胞在不同时间点和不同形变率作用下Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin和Wnt3a蛋白的表达变化。结果:Western blot结果显示,人牙周膜成纤维细胞在机械力加载后β-catenin 和Wnt3a蛋白表达显著减少(P<0.05)。在加力时间相同的组内(2 h、4 h、6 h),β-catenin 和Wnt3a蛋白表达随着形变率的增大而逐渐减少(P<0.05)。结论:β-catenin和 Wnt3a参与了静态张应力作用下牙周膜成纤维细胞的代谢,机械力对牙周膜成纤维细胞中Wnt/β-catenin信号通路有抑制作用。     

Wnt／β-catenin信号通路在大鼠骨髓间充质干细胞牵张中的表达

目的：了解经典Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞（BMSCs）加载牵张中的作用。方法：分离培养大鼠BMSCs,通过自行研制的细胞加载装置．对BMSCs施加机械张应力刺激。用实时荧光定量RT—PCR与Western印迹检测Wnt3A、B—catenin与Lef-1的表达,同时检测BMSCs细胞增殖及骨向分化转录因子Runx2与成骨因子碱性磷酸酶（ALP）的变化情况。所得数据应用SPSS19．0软件包进行配对￡检验。结果：在牵张力刺激下,经典Wnt信号通路的3个关键分子Wnt3A、β-atenin与IJef_因表达显著增强（P〈0．05）。BMSCs的增殖、Runx2表达以及ALP活性也在加力后增强（P〈0．05）。结论：张应力加载激活了经典Wnt信号通路．并刺激BMSCs增殖与骨向分化,提示Wnt／β-catenin参与了牵张成骨的分子调控过程。     

细胞外信号调节蛋白激酶1/2在介导周期性牵张力对牙周膜细胞成骨分化中的作用

目的 研究周期性牵张力刺激下细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）1/2对牙周膜细胞成骨分化的分子调控机制。方法 组织块法培养人牙周膜细胞。采用多通道应力加载系统对细胞施加频率0.5 Hz、振幅10%的周期性牵张力（加力时间1、3、6、12、24 h）,以不加力的细胞作为对照,并分别在加力前应用ERK1/2通路特异性抑制剂U0126以及对细胞转染ERK1/2显性负相变异体（DN-ERK1/2）。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）及蛋白质印迹法研究人牙周膜细胞的基因蛋白水平变化。结果 加力后人牙周膜细胞的p-ERK1/2蛋白水平及骨钙蛋白（OCN） mRNA、骨涎蛋白（BSP）mRNA水平均显著升高,Runt相关基因（Runx）2 mRNA及蛋白水平在加力3、6 h均显著升高。加入抑制剂U0126或细胞转染DN-ERK1/2后,Runx2、OCN、BSP mRNA水平以及Runx2、p-ERK1/2蛋白水平均降低。结论 ERK1/2是周期性牵张力刺激下牙周膜细胞成骨分化的重要分子途径,力学刺激下激活的ERK1/2可能通过提高Runx2蛋白的表达水平而参与成骨基因OCN和BSP的转录表达。     

机械应力对人牙周膜成纤维细胞整合素β1mRNA表达的调节

目的观察机械力刺激对人牙周膜成纤维细胞整合素β1 mRNA表达的影响。方法用Forcel四点弯曲加载装置通过对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别施加不同动态张、压应力（强度为1 000、2 000、4 000 μstrain，加力时间为0、0.5、1、4、8、12 h），采用实时荧光定量PCR法研究机械力对人牙周膜成纤维细胞整合素β1 mRNA表达的影响。结果施加动态的张、压应力后，人牙周膜成纤维细胞整合素β1 mRNA表达量下调，这种下调变化与所施加应力的性质、大小和作用持续时间相关。人牙周膜成纤维细胞整合素β1对张、压应力刺激的感应不完全一致，机械力刺激越强，整合素β1表达越明显。结论动态张、压应力刺激在本实验提供的微应力范围内可以促进目的基因mRNA表达改变，不同的机械力对细胞整合素β1效应不同。     

流体剪切力作用下喷砂酸碱处理钛表面对原代成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白mRNA表达的影响

目的探讨流体剪切力及喷砂酸碱处理钛表面在不同时相对原代成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达的影响。方法制备抛光处理纯钛钛片(P组)、喷砂酸碱处理纯钛钛片(S组),取新生第一天SD大鼠颅骨进行原代成骨细胞培养并分别接种于玻片(G组)、P组钛片、S组钛片表面,培养72h后,置于流体加载系统中,在0dynes/cm2(静止组)和12dynes/cm2(受力组)大小的流体剪切力下分别作用0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h,通过实时荧光定量聚合酶链反应检测低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low-density lipoprotein receptor-relat-ed protein5,LRP5)和β-连环蛋白(β-catenin)的mRNA表达变化。结果 3种表面受力组LRP5和β-catenin的mRNA表达水平均比静止组高(P<0.05)。LRP5的mRNA表达水平在S组最高(P<0.05);细胞受力时G组在1h、P组和S组在0.5h时LRP5的mRNA表达量达到最高峰。β-catenin的mRNA表达水平在S组最高(P<0.05);细胞受力时表达量最高峰在3种表面均出现在0.5h。结论适宜大小的流体剪切力以及喷砂酸碱处理钛表面均能促进成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活,并且喷砂-酸碱处理钛表面提高了成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路对流体剪切力刺激的敏感性。     

成骨细胞中Runx2对机械离心力刺激的响应

目的研究机械离心力刺激对MC3T3-E1细胞中Runx2表达的影响,探讨成骨细胞将力学刺激转化为生化响应过程中骨形态发生蛋白（BMP）信号转导通路的作用。方法将MC3T3-E1细胞分成A、B、C、D组,分别使用含10%胎牛血清、10%胎牛血清、100 ng·mL-1 Noggin和100 ng·mL-1 Noggin的DEME培养基预处理24 h,对B、D组加载271×g离心力5 min,A、C组不进行离心加力,其余条件相同。30 min后4组分别同时收获细胞,提取总RNA,并逆转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR检测Runx2基因表达情况。结果B组Runx2 mRNA表达较A组明显增高（P<0.05）,D组Runx2 mRNA表达比B组表达明显降低（P<0.05）,A、C、D组间表达水平比较差异无统计学意义（P=0.692）。结论BMP信号转导通路参与成骨细胞对机械离心力刺激的响应过程,并可能在成骨细胞对力学信号引起的信息传递级联反应中扮演重要角色。     

体外张应力对人牙周膜细胞串珠素表达的影响

目的： 观察体外周期性张应力对人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells, hPDLCs）串珠素的表达影响,探讨应力作用下牙周组织改建的分子机制。方法：采用酶消法分离培养hPDLC,通过应力加载仪对细胞施以12% elongation、1 Hz的单轴张应力。加力时长分别为0、12、24、48 h。然后通过实时定量PCR和ELISA方法分别检测张应力下不同时间点串珠素基因和蛋白的表达变化。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果：张应力加载后,串珠素mRNA在加力的前12 h内表达水平出现短暂升高,但无显著差异。随着加力时间延长,mRNA表达持续下降,48 h后达到最低水平,至对照组的0.28±0.05 (P<0.05);而细胞基质内的串珠素蛋白表达则随着加力时间一直下降,48 h后从（14.03±0.71） pg/mL（对照组）降低到最低水平（11.06±0.15） pg/mL,差异显著（P<0.05）。结论：张应力刺激可下调人牙周膜细胞串珠素基因及蛋白表达,下降趋势与时间具有相关性,提示串珠素可能在牙周膜对机械力刺激的反应中发挥作用。     

大鼠正畸牙齿移动过程中Wnt3a和DKK1的表达

目的:观察Wnt3a和DKK1在大鼠正畸牙移动时牙周组织中的表达变化。方法:将30只健康雄性SD大鼠随机分为6组,即正畸加力1,3,5,7,10,14 d组。使用镍钛拉簧施加50 g力近中移动左侧上颌第一磨牙,以右侧上颌第一磨牙不加力为自身对照。通过免疫组化方法检测牙周组织中Wnt3a和DKK1蛋白的表达。结果:Wnt3a和DKK1在加力组和未加力组的牙周膜中都有表达。在张力区,Wnt3a和DKK1都先增加后减少,分别在第5天和第10天达到高峰;在压力区,Wnt3a先减少后增加,DKK1先增加后减少,分别在第5天和第10天达峰值。结论:Wnt3a和DKK1参与牙周组织的改建,提示Wnt信号通路可能是正畸牙周改建的调控途径之一。[关键词] Wnt3a DKK1 正畸牙齿移动 牙周组织改建     

DAPT对成牙骨质细胞增殖活性的影响

目的:探讨γ-分泌酶抑制剂DAPT对成牙骨质细胞株OCCM30的Notch信号通路是否有抑制作用,及对成牙骨质细胞增殖活性的影响,并初步探讨其作用机制。方法:γ-分泌酶抑制剂DAPT作用于OCCM30细胞,分别培养2、4、6 d,采用RT-PCR检测Notch信号通路下游基因(Hes-1、Hey-1)和细胞周期相关基因(Cyclin D、Cyclin E)的表达,采用流式细胞术检测DAPT对OCCM30细胞周期的影响;DAPT作用于OCCM30细胞后,连续培养8 d,采用CCK-8法测定细胞增殖活性。结果:实验组Hes-1、Hey-1、Cyclin D、Cyclin E mRNA的表达下降,G1/G0期细胞百分比增高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);第2~8天,实验组细胞增殖活性(A₄₅₀值)显著降低,呈浓度依赖性,且与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:DAPT能有效抑制成牙骨质细胞株OCCM30的Notch信号通路,抑制OCCM30细胞的增殖活性,其机制可能与DAPT下调细胞周期相关基因(Cyclin D、Cyclin E)表达有关。     

机械压应力下骨硬化蛋白对成牙骨质细胞功能影响及机制的体外研究

目的 探究骨硬化蛋白（SOST）对处于机械压应力中的永生化成牙骨质细胞（OCCM-30）的功能影响及其相关的机制。方法 用不同浓度SOST培养液（0、25、50、100 ng·mL ^-1）处理细胞后依靠四点弯曲细胞力学加载器对细胞加载大小为2 000 μstrain、频率是0.5 Hz的单轴压应力6 h,用免疫印迹法检测β-连环蛋白（β-catenin）、磷酸化的细胞信号转导分子p-smad1/5/8、细胞信号转导分子smad1/5/8的蛋白水平;用碱性磷酸酶（ALP）活性检测法检测ALP活性;用荧光实时定量PCR检测核心结合蛋白因子2（Runx-2）、骨钙素（OCN）、骨涎蛋白（BSP）以及细胞核因子κB受体活化因子（RANKL）、骨保护因子（OPG）的表达。结果 p-smad1/5/8随着SOST浓度增加,呈减低的趋势,而β-catenin、smad1/5/8未有显著差异性。在仅对细胞加力时ALP活性降低,随SOST浓度升高,ALP活性逐渐发生下降,Runx-2、OCN和BSP的表达也都呈现降低趋势,RANKL的表达随着SOST增加而升高,OPG则随之下降。结论 压应力下,SOST的升高会对骨形态发生蛋白（BMP）/smad 通路产生抑制作用,对β-catenin表达未产生明显改变。外源性SOST对于BMP存在反馈性的负向调节作用。压应力下SOST对OCCM-30的矿化功能是抑制的,其机制或许是一方面利用BMP信号通路对成骨相关因子Runx2、OCN、BSP等实现下调,另一方面提高了与破牙骨质有关分子 RANKL/OPG的比率。     

Expression of Wnt3a,Wnt10b, β-catenin and DKK1 in periodontium during orthodontic tooth movement in rats

Objective: To investigate the expression of Wnt3a, Wnt10b, β-catenin and DKK1 in the periodontal ligament (PDL) during orthodontic tooth movement (OTM) in rats. Materials and methods: Nickel-titanium closed-coil springs were used to deliver an initial 50 g mesial force to the left maxillary first molars in 30 rats. The force was kept constant for 1, 3, 5, 7, 10 and 14 days until the animals were sacrificed. The right maxillary molars without force application served as control. Paraffin-embedded sections of the upper jaws were prepared for histological and immunohistochemical analyses to detect Wnt3a, Wnt10b, β-catenin and DKK1 expression in PDL. Results: Wnt3a, Wnt10b, β-catenin and DKK1 were expressed on both the ipsilateral and contralateral sides of PDL in each group. After the application of orthodontic force, the expression of β-catenin and DKK1 was initially increased and then decreased on both sides, with maximal levels of expression at day 7 and day 10, respectively. On the compression side, Wnt3a and Wnt10b levels started to increase at day 5, while on the tension side, these two molecules began to increase at day 1. Furthermore, the expression levels of Wnt3a, Wnt10b, and β-catenin were much stronger on the tension side than on the compression side at any of the observation points, while DKK1 level was much higher on the compression side. Conclusion: Wnt3a, Wnt10b, β-catenin and DKK1 expression may be related to the periodontal tissue remodeling following the application of an orthodontic force in rats. These observations suggest that the Wnt/β-catenin signaling pathway may play a crucial role in periodontal tissue remodeling during OTM.     

微阵列芯片分析成牙骨质细胞矿化过程中microRNA表达谱的差异

目的:诱导小鼠成牙骨质细胞矿化,研究在成牙骨质细胞矿化过程中microRNA表达谱的变化。方法:体外培养小鼠成牙骨质细胞系OCCM30,使用抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松诱导成牙骨质细胞矿化。实时荧光定量PCR(qPCR)检测碱性磷酸酶和骨钙蛋白表达量变化来验证矿化情况。应用miRNA microarray 芯片技术,分析成牙骨质细胞矿化过程中miRNA表达谱的变化。QPCR对芯片结果进行验证。结果:成功诱导了成牙骨质细胞的矿化。MiRNA microarray 芯片检测发现成牙骨质细胞矿化过程中miRNA表达谱出现明显改变,其中上调的有4个,下调的有39个。QPCR证明芯片结果准确可靠。结论:建立了小鼠成牙骨质细胞矿化的细胞模型,应用miRNA芯片发现小鼠成牙骨质细胞矿化过程中差异表达的miRNA,提示这些miRNA可能参与成牙骨质细胞矿化过程的调控。