兔骨髓基质细胞的体外培养

目的　探讨兔骨髓基质细胞在体外的培养条件 ,为研制骨组织工程材料选择种子细胞奠定实验基础。方法　取兔新生仔长骨骨髓进行培养 ,观察其传代细胞生长特性和生长曲线 ,测定培养细胞分裂指数和贴壁率。结果　兔骨髓基质细胞生长至第 5代 ,性状稳定 ,生长曲线相似 ;第 4天分裂指数最高 ,为 92‰ ;传代后 10h贴壁率最高。结论　兔骨髓基质细胞在体外培养条件下 ,早期生长性状稳定 ,增殖速度快 ,适应性强 ,可作为骨组织工程学的种子细胞。     

不同浓度血清对大鼠骨髓基质细胞生长的影响

目的：探讨不同浓度血清对大鼠原代培养骨髓基质细胞(BMSCs)功能的影响，寻求培养所需的适宜血清浓度。 方法： 利用MTT法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪分析细胞生长周期及细胞凋亡的变化，PCR-ELISA法分析细胞端粒酶活性的改变。 结果： ①血清能明显促进BMSCs增殖，表现为G0/G1期细胞减少，S期细胞增加，群体细胞倍增时间缩短。②在组成BMSCs的Ⅰ型和Ⅱ型细胞发育生长过程中，血清对Ⅱ型细胞的增殖无明显促进作用；对Ⅰ型细胞，血清能明显促进细胞增殖。③短时间内血清对于BMSCs端粒酶活性无明显影响。 结论： ①对于BMSCs中不同类型的细胞采用的培养条件应因类而异。②血清对Ⅰ型细胞的增殖具有明显促进作用。③血清并不能促进Ⅱ型细胞增殖，但在短时间内对其分化亦无明显影响。     

三嵌段高分子骨组织工程支架材料的制备及细胞粘附性研究

目的　制备三嵌段高分子骨组织工程支架材料———聚丙交酯 /乙交酯 /天冬氨酸 聚乙二醇 ,并比较与聚丙交酯 共 乙交酯材料对骨髓基质细胞的粘附性 ,为骨组织工程支架材料的选择提供依据。方法　通过本体开环共聚法合成聚丙交酯 /乙交酯 /天冬氨酸 聚乙二醇三嵌段共聚物 ,用红外光谱检测 ;利用高温显微镜测定两种材料的表面接触角 ;体外培养骨髓基质细胞 ,然后分别接种至上述两种材料上 ,测定细胞粘附率和细胞粘附力 ,并进行扫描电镜观察。结果　红外光谱证明聚丙交酯 /乙交酯 /天冬氨酸 聚乙二醇三嵌段共聚物形成 ;聚丙交酯 /乙交酯 /天冬氨酸 聚乙二醇材料的表面接触角是 6 3 3度 ,聚丙交酯 共 乙交酯材料的表面接触角是 6 7 5度 ;细胞粘附率分别为 6 9 .7%和 6 1. 3% ;细胞粘附力分别为 32 1 . 1 5± 92. 39× 1 0 - 1 0 牛顿和 2 1 6. 96± 73 .76× 1 0 - 1 0 牛顿 ;扫描电镜观察结果为聚丙交酯 /乙交酯 /天冬氨酸 聚乙二醇材料表面粘附的细胞数明显多于聚丙交酯 共 乙交酯材料表面粘附的细胞数。结论　聚丙交酯 /乙交酯 /天冬氨酸 聚乙二醇材料的粘附性优于聚丙交酯 共 乙交酯材料的粘附性 ,是一种理想的骨组织工程支架材料。     

骨髓基质细胞成骨的研究进展

骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞具有广阔前景。许多实验证实骨髓基质细胞具有间充质干细胞特性 ,表现为较强的增殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能。目前已建立了体外培养骨髓基质干细胞的方法 ,而且正在摸索进一步纯化的方法和诱导分化的条件。本文就骨髓基质细胞的研究现状与前景作一综述。     

骨髓基质细胞和壳聚糖/明胶共混材料生物相容性研究

目的:研究壳聚糖/明胶共混材料对离体培养的骨髓基质细胞粘附及增殖的影响,寻找骨髓基质细胞新的载体材料。方法:取2周龄幼兔的长骨采集骨髓,培养骨髓基质细胞,体外扩增1周后,种植于纯壳聚糖和壳聚糖/明胶共混材料的表面。在倒置光学显微镜、扫描电镜的辅助下,观察细胞的粘附和生长情况,种植7d后用透射电镜观察细胞功能状况,用MTT方法检测种植后2d、4d、6d、8d细胞的增殖情况。结果:壳聚糖/明胶共混材料和纯壳聚糖能促进骨髓基质细胞在材料表面粘附并保持其在机体内的形态。壳聚糖/明胶共混材料表面的骨髓基质细胞功能活跃。在材料表面和培养板表面培养的骨髓基质细胞均能持续增殖,而壳聚糖/明胶共混材料能显著促进骨髓基质细胞的增殖(P<0.01)。结论:壳聚糖/明胶共混材料保持了壳聚糖的某些生物活性,同时由于加入明胶,能促进骨髓基质细胞的增殖,可作为骨髓基质细胞的载体应用于组织工程。     

小鼠白血病骨髓基质细胞对白血病细胞体外生长的作用

用Dexter培养体系作L615小鼠白血病骨髓长期培养,观察基质细胞对白血病细胞体外生长的影响。结果显示:大量白血病细胞在1周内死亡。少数粘附于骨髓基质的细胞能在此体系繁殖,经过8周以上传代后获得独立生长能力,成为不死的细胞系,命名为L615-1。这种细胞能在BALB/C裸鼠皮下形成淋巴肉瘤,但不能诱发同系小鼠发生白血病。本文结果提示骨髓基质细胞能支持恶性造血细胞体外生长。     

β-磷酸三钙/聚磷酸钙纤维/聚左旋乳酸支架复合骨髓基质细胞修复节段性骨缺损

背景：组织工程β-磷酸三钙/聚磷酸钙纤维/聚左旋乳酸支架材料具有良好的生物相容性。 目的：评估骨髓基质细胞与β-磷酸三钙/聚磷酸钙纤维/聚左旋乳酸复合体修复兔桡骨大段骨缺损成骨的效果。 方法：取新西兰大白兔40只,建立桡骨双侧大段骨缺损模型,其中35只右侧植入自体骨髓基质细胞与β-磷酸三钙/聚磷酸钙纤维/聚左旋乳酸复合物作为实验组,左侧植入β-磷酸三钙/聚磷酸钙纤维/聚左旋乳酸支架材料作为对照组;另5只作为空白对照不作任何处理。植入后4,8,12,16周拍摄X射线片观察骨缺损修复情况。 结果与结论：实验组术后2周可见缺损处有散在的、少量模糊状骨痂生成,术后4周可见明显骨生成影像,成云雾状,均匀分布在骨缺损区,术后8周整个缺损区均可见骨痂生成,成骨现象更加明显,部分髓腔已通,术后12~16周,缺损区已完全被新生骨组织充填,骨髓腔已完全再通,修复区较正常桡骨细,骨缺损修复效果明显优于对照组与空白对照组(P < 0.01)。说明自体骨髓基质细胞与β-磷酸三钙/聚磷酸钙纤维/聚左旋乳酸复合移植可较完全修复大节段骨缺损。     

骨髓基质细胞与凋亡

骨髓基质细胞、细胞间基质(ECM)、血管神经等构成了骨髓造血微环境。骨髓基质细胞由成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞等多种成分组成,是造血干细胞生长、分化、和自我更新的重要场所。骨髓基质细胞在造血调控方面发挥     

嗅鞘细胞/细胞外基质夹层支架的制备和形态学观察

目的研究嗅粘膜嗅鞘细胞在细胞外基质夹层支架内的生长特性,为治疗神经系统损伤寻找新的移植供体。方法嗅鞘细胞/细胞外基质夹层支架由四层毯状细胞外基质支架和三层嗅粘膜嗅鞘细胞相间叠加构成。纤维蛋白原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白按一定比例混合后,在新鲜大鼠血浆促凝作用下,构建单层毯状细胞外基质支架,在支架表面种植嗅粘膜来源的嗅鞘细胞。于倒置显微镜下观察嗅鞘细胞在支架上/内的生长过程,培养3d后,在细胞表面再次滴加上述细胞外基质混合胶以构建第二层毯状支架,依次重复两次。夹层支架制成组织切片和超薄切片后,用光镜和电镜观察和分析夹层支架的内部结构以及嗅鞘细胞在支架内的生长情况。结果由顶层至底层,支架内的嗅鞘细胞数量逐渐增多,细胞突起逐渐延长,细胞内分泌颗粒逐渐增多及其电子密度逐渐增高;细胞可在支架之间迁移,其水平排列方向具有一致性;嗅鞘细胞的细胞膜可与支架紧密粘附,支架内局部区域出现组织间隙。结论嗅粘膜嗅鞘细胞可在细胞外基质夹层支架内正常增殖和分化,细胞与支架具有良好的组织相容性。该夹层支架可作为嗅鞘细胞三维生长的载体,用于移植治疗神经损伤。     

小鼠骨髓间充质干细胞在体内向肝细胞的转化

为探讨小鼠骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)在体内向肝细胞转化的可能性,将来源于6-8周龄雄性BALB/c小鼠的BMSCs,通过尾静脉注射或经皮肝穿刺直接注入肝脏组织的途径移植入同源正常雌鼠体内。分别于移植术后1、2、4周处死受体雌鼠,取其肝组织,通过荧光原位杂交法(FISH)和免疫组化法同时检测Y染色体的存在和白蛋白的表达,以观察确定所注入的BMSCs在受鼠体内向肝细胞转化的情况。采取经皮直接肝穿刺注射途径移植BMSCs的两个实验组,无论移植细胞是新鲜分离的、还是P3代BMSCs,均可于移植后1周,在受鼠肝脏内检出Y染色体阳性细胞的存在,此类阳性细胞并可同时表达白蛋白。另一方面,经尾静脉注射法进行移植的实验组,于移植后2周,也可在其肝组织内检测到同时表达Y染色体和白蛋白的细胞。本研究证明了骨髓间充质干细胞在体内向肝细胞转化的可能性。     

碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间充质干细胞向颞下颌关节盘细胞分化的影响

为观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的影响,采用bFGF诱导山羊BMSCs,通过组织学、免疫组织化学和酶联免疫吸附实验(ELISA)等方法检测BMSCs产生的细胞外基质(ECM)包括Ⅰ型胶原和蛋白多糖的情况,初步评价BMSCs做为颞下颌关节(TMJ)盘组织工程种子细胞的可行性。结果表明:经bFGF诱导,BMSCs向成纤维细胞样细胞分化,能够合成糖胺聚糖(GAG)和I型胶原,因此认为BMSCs作为工程化关节盘种子细胞是可行的。     

蚕丝丝素纤维的制备及其与骨髓间充质干细胞相容性的研究

组织工程为韧带损伤修复提供了可行途径，但韧带修复对支架材料各方面性能要求都很高。在力学性能方面，不仅要求材料有一定的强度而且需要有良好的韧性。在满足力学性能的同时，支架材料还必须兼具优良的生物相容性。蚕丝作为一种天然生物蛋白质，由于其良好的力学性能显示了在组织工程方面应用的前景。但由于丝胶存在污染问题，因此脱胶成为蚕丝在医学领域应用的首要问题。本实验首先比较了三种脱胶试剂对蚕丝力学性质的影响，选择了影响最小的碳酸钠作为脱胶试剂，进而确定了碳酸钠脱胶的最佳条件为：试剂浓度0．40%，温度90℃，时间为1h。然后在脱胶后的丝紊纤维上种植了大鼠骨髓问充质干细胞（Rat bone marrow mesenchymal stem cells，rMSCs），通过扫描电镜（SEM）、荧光显微镜检测了丝素上细胞的生长情况，结果显示蚕丝具有良好的生物相容性，细胞亲和力。为蚕丝在韧带组织工程方面的进一步应用奠定了基础。     

骨髓间充质干细胞在肝部分切除模型小鼠体内向肝细胞分化

以含20%胎牛血清的DM EM低糖培养基,原代细胞直接贴壁培养,48 h后换液继续培养,分离BALB/C小鼠的骨髓间充质干细胞,该细胞分为CD44 CD29 与CD44-CD29 两群。将第5代骨髓间充质干细胞注入部分肝切除小鼠肝右叶,术后5 d和14 d分别处死动物,测体重、肝重与肝功,制备肝组织芯片,原位杂交和免疫荧光同步检测Y染色体与肝细胞标记(白蛋白或CK 18),并作图像叠加。发现移植组小鼠在移植后5 d与14 d在注射肝叶与非注射肝叶内皆可检出大量同时表达Y染色体与白蛋白及Y染色体与CK 18的细胞。术后14 d,移植组肝重与肝脏器指数高于模型组。表明骨髓间充质干细胞能在有再生需求的小鼠体内向肝细胞分化并参与再生。     

恒河猴骨髓间充质干细胞分离培养及其生长特性

采用密度梯度离心和贴壁筛选方法分离纯化了恒河猴骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells from bone marrow of Rhesus monkey,RhBMSCs);通过表面抗原检测和核型分析对细胞进行了初步鉴定;通过生长曲线的绘制和细胞凋亡的检测探讨了细胞的生长特点。本实验获得的RhBMSCs形态以梭型为主,核型正常,CD29表达率为99.2%,CD34、CD45、HLA-DR表达率均低于3.2%,RhBMSCs表型符合间充质干细胞的特点,且纯度较高,细胞生长旺盛,但倍增时间有随传代数的增加而逐渐延长的趋势。本实验探讨了RhBMSCs的体外分离、扩增培养及鉴定的方法,并对其生长特点进行了初步观察,这不仅有助于进一步了解与之近似的人的骨髓间充质干细胞的相关特性,而且为以猕猴为对象的BMSC定向分化和组织修复等动物体内实验打下了基础。     

力学应变对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响

探讨周期性双轴力学应变对大鼠骨髓间充质干细胞(M esenchym a l stem ce lls,M SC s)增殖和成骨分化能力的影响。选用9月龄健康SD雌性大鼠,分离股骨、胫骨提取骨髓,采用密度梯度离心法分离M SC s。体外培养M SC s传至第3代,以1×105细胞浓度接种于双轴力学应变系统,选取4 000μstra in,频率为1hz的力学应变对M SC s加载。每天加载3次,每次2 h,间隔2 h。观察力学应变作用后1 d、3 d,M SC s增殖和成骨分化能力的变化,并与相应未加力学应变对照组比较。结果表明:(1)力学应变可增高M SC s的碱性磷酸酶(ALP)和骨桥蛋白(OPN)表达量;力学应变作用3 d后M SC s的ALP和OPN表达量明显高于力学应变作用1 d。I型胶原(COL I)仅在力学应变作用3 d增高;骨钙素(OCN)在各组无明显变化。(2)力学应变可促进M SC s增殖,但力学应变作用1 d和3 d对M SC s增殖的作用无明显差异。上述结果提示:力学应变可以促进M SC s的增殖和成骨分化能力。     

去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞体外成脂肪分化能力的研究

探讨不同月龄、去卵巢对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向脂肪细胞分化能力的影响。选用健康3月龄和6月龄Spraque-Dawley(SD)雌性大鼠行双侧卵巢切除术,建立骨质疏松症的动物模型;使用密度梯度离心法分别获取各组骨髓间充质干细胞(MSCs),体外培养传至3代,加入成脂肪诱导液进行诱导,油红O染色观察细胞内脂滴;并用RT-PCR法检测成脂肪分化标志物脂蛋白脂酶(LPL)mRNA表达水平。实验分为8组:1)3月龄正常大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs3control);2)3月龄去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs3ovx);3)6月龄正常大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs6control);4)6月龄去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs6ovx);5)3月龄正常大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪诱导组(MSCs ADI3control);6)3月龄去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪诱导组(MSCs ADI3ovx);7)6月龄正常大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪诱导组(MSCs ADI6control);8)6月龄去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪诱导组(MSCs ADI6ovx)。结果显示:(1)年老组大鼠MSCs成脂肪细胞分化能力大于年幼组大鼠;(2)成脂肪诱导后,成脂肪诱导各组MSCs胞浆内均有脂滴形成,MSCs ADI3ovx和MSCs ADI6ovx明显多于相应对照组。(3)成脂诱导后,与相应的对照组相比,MSCs ADI3ovx和MSCs ADI6ovx LPL mRNA表达水平明显增高。研究结果表明,年老组和去卵巢骨质疏松大鼠(MSCs)向脂肪细胞分化能力皆增强。     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

探索在体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞 (Bone m arrow m esenchym al stem cells,BMSCs)的最适条件。以密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合 ,在体外分离 BAL B/C小鼠的 BMSCs,通过 MTT法测定了不同离心力、不同换液时间、不同血清浓度、不同种植密度等因素对 BMSCs分离和培养的影响。在 5 0 0 g× 30 min的离心力下分离细胞 ,加入 10 %的胎牛血清 ,原代按 (12～ 2 0 )× 10 5/m l的细胞密度接种 ,接种 2 4 h后换液 ,继代种植密度为 6 .4～ 2 5 .6× 10 4 /ml时最适宜细胞生长 ;在此条件下 ,细胞快速增殖 ,传代后 8h贴壁达 90 %以上 ,2 4 h便进入对数生长期 ,直至第 5 d,细胞约增殖 3倍。本研究建立了在体外分离培养骨髓间充质干细胞的细胞生物学方法和技术参数。     

骨组织工程中人骨髓间质干细胞动态种植和静态种植的比较研究

分别采用动态种植(旋转烧瓶法)和静态种植方法种植人骨髓间质干细胞,于种植后的两周内测定细胞-载体构件中DNA含量;利用组织学光镜和扫描电镜观察细胞的分布情况;运用荧光标记RT-PCR技术测定相关成骨基因的表达。构件中DNA含量测定表明,对于静态种植,当初始种植密度为每载体400×103(8.9×104/mm3)时,DNA的含量达到最高;在此基础上提高初始种植密度,并不能进一步提高构件DNA含量。光镜和扫描电镜观察可见动态种植后人骨髓间质干细胞在载体中的分布相对均匀,静态种植后细胞在载体中出现聚集现象;荧光标记RT-PCR证明,体外构件培养两周后,动态种植后的细胞-载体构件中有较多的成骨基因表达。提示人骨髓间质干细胞的静态种植效率较低;动态种植是一种优于静态种植的可行方法。     

骨桥蛋白对骨髓间充质干细胞核力学特性的影响及相关分子机制

目的研究骨桥蛋白(osteopontin,OPN)对骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)核力学特性的影响及相关分子机制。方法采用Transwell法分析BMSCs迁移能力。利用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)检测细胞核弹性模量,分析OPN作用下BMSCs细胞核硬度的变化。通过Western blot技术检测OPN作用对黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)和胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK 1/2)的影响,并利用FAK或ERK1/2抑制剂考察FAK-ERK1/2信号通路在OPN影响BMSCs核力学特性中的作用。通过RT-PCR和Western blot技术检测OPN作用下核纤层蛋白Lamin A/C的表达变化。结果 OPN处理组细胞核弹性模量与对照组相比明显降低。OPN作用显著上调FAK、ERK1/2磷酸化水平,加入FAK或ERK1/2抑制剂在一定程度上回救OPN降低的细胞核弹性模量,并显著抑制BMSCs迁移。OPN处理BMSCs后Lamin A/C mRNA和蛋白水平的表达出现下调,但FAK或ERK1/2抑制剂能够抑制OPN诱导的Lamin A/C表达下调。结论 OPN可能通过FAK-ERK1/2信号通路下调BMSCs核骨架蛋白Lamin A/C表达,降低细胞核硬度,促进BMSCs迁移。该研究结果为深入认识OPN调控BMSCs迁移行为的机制及其临床应用提供了实验依据。