菌液SYBR实时荧光PCR快速检测金黄色葡萄球菌

目的建立菌液SYBR荧光PCR法快速检测金黄色葡萄球菌的方法。方法根据金黄色葡萄球菌的特异基因耐热核酸酶nuc设计引物,PCR方法和SYBR荧光PCR溶解曲线法验证引物的特异性;建立菌液SYBR荧光PCR快速检测方法,奶粉加标实验和菌株特异性实验评价方法的特异性,制备基因组浓度梯度和菌落梯度检验方法的灵敏性。结果利用引物对实验室的3个标准菌株进行PCR扩增,出现的条带均为单一条带,且与目的片段长度一致。16株金黄色葡萄球菌菌株的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,无非特异性扩增。建立的菌液SYBR荧光PCR方法对金黄色葡萄球菌有很好的特异性和灵敏性,灵敏度达1pg／山DNA浓度,并可检测1 CFU／ml的复杂样品。结论本研究建立的菌液SYBR荧光PCR方法快速、特异性好、灵敏性高,对快速检测样品中金黄色葡萄球菌有重要意义。     

PCR法检测葡萄球菌肠毒素A基因

目的 建立PCR方法快速检测葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal enterotoxin A,SEA)基因.方法 根据SEA基因的序列,设计PCR引物特异性扩增靶基因片段,对1株产SEA金黄色葡萄球菌和9株对照菌株进行PCR检测,评价其特异性和敏感性.另检测30株金黄色葡萄球菌SEA基因的携带情况.结果 建立PCR方法快速检测SEA基因,扩增产物长度为439bp.PCR反应体系中有29cfu的产SEA金黄色葡萄球菌即可检出SEA基因,30株分离的金黄色葡萄球菌中有10株携带有SEA基因.结论 PCR法可以快速、敏感地检测SEA基因,为金黄色葡萄球菌食物中毒诊断提供依据.     

多重PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的建立多重PCR方法,快速鉴定金黄色葡萄球菌并同时检测耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的mecA基因。与PBP2a乳胶凝集法及头孢西丁纸片扩散法进行比较。方法以nuc基因以及mecA基因合成2对引物,采用多重PCR扩增法,在279bp和310bp处出现扩增条带,表示检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。结果 171株临床分离菌的mecA基因检出率为52.63%;nuc基因扩增结果与常规检测结果的符合率为100%;以PBP2a乳胶凝集法为＂金标准＂,PCR法和头孢西丁纸片扩散法的敏感性均为100%,特异性分别为98.78%和92.68%。3种方法结果差异无统计学意义（P〉0.05）。Kappa值均大于0.90。结论此多重PCR法能准确鉴定金葡菌,并可同步检测MRS,可作为临床实验室检测MRS的可靠方法。     

金黄色葡萄球菌食物中毒病原检测及方法比较

目的:可疑金黄色葡萄球菌食物中毒事件病原学检测,传统的分离培养与荧光PCR检测方法的方法比较。方法:本实验采用国家标准方法对食物中毒标本进行金黄色葡萄球菌分离培养,并对食物中毒标本及分离的阳性菌株作肠毒素定性测定;用荧光PCR(FQ-PCR)方法对可疑食品及患者呕吐物标本进行金黄色葡萄球菌快速检测。结果:用国标方法,9份呕吐物标本中7份分离出金黄色葡萄球菌,阳性率77.78%,荧光PCR快速法检测相同标本,9份呕吐物均呈阳性,阳性率100%,食品卤香干检出金黄色葡萄球菌,8个阳性菌株C型肠毒素检出率100%。结论:该中毒确诊为金黄色葡萄球菌C型肠毒素中毒,中毒食品为卤香干。荧光PCR检测法快速、灵敏,尤其适用于药后患者标本及已加热杀菌的可疑中毒食品的检测,作为初筛、辅助诊断手段,在食物中毒病原检测中值得广泛推广。     

金黄色葡萄球菌nuc基因特异性核酸探针的制备及应用

目的　建立核酸探针检测实验动物金黄色葡萄球菌的方法。方法　将重组质粒pGEM NUC中金黄色葡萄球菌nuc基因特异性片段酶切回收 ,经生物素标记后作为核酸斑点杂交试验探针 ,对细菌菌株及临床样品进行了检测。结果　核酸探针与金黄色葡萄球菌DNA呈杂交阳性 ,而与表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌等其他细菌DNA呈杂交阴性 ,斑点杂交检测的灵敏度为 1pg基因组DNA。用斑点杂交试验和PCR对 32 2份SPF小鼠的临床样品进行了检测 ,检出率为 3 1% (10 /32 2 ) ,符合率为 10 0 % ,与细菌学检查的结果相一致。结论　建立的DNA探针检测金黄色葡萄球菌方法具有高度的特异性和敏感性 ,且较快速 ,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的监测。     

一起食物中毒的金黄色葡萄球菌肠毒素检测

目的 对一起食物中毒样品进行致病菌检测,准确分析食物中毒原因,为食物中毒的处理提供依据.方法 依据《食品卫生微生物学检验》国家标准GB4789.10-2010、GB 14938-94《食物中毒诊断标准及技术处理总则》和WS/T80-1996《葡萄球菌食物中毒诊断标准及处理原则》方法对采集的12份食物中毒样品进行病原菌金黄色葡萄球菌检测;应用荧光定量PCR法对检出的金黄色葡萄球菌进行肠毒素检测.结果 在12份样品中检出5株金黄色葡萄球菌,分别来自患者呕吐物4份,砧板棉拭子1份,全部检出A型肠毒素,未检出其他病原菌.金黄色葡萄球菌总检出率为41.7％.结论 金黄色葡萄球菌A型肠毒素是此次食物中毒的病原体.实时荧光PCR快速检测方法适用于金黄色葡萄球菌肠毒素的基因分型.     

实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7

目的建立改良分子信标一双重实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌0157：H7,应用于细菌性食物中毒的快速诊断。方法根据GeneBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因序列和大肠杆菌O157：H7rfbE基因序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标一双重实时PCR检测体系。结果双重荧光PCR反应体系检测151株金黄色葡萄球菌和27株大肠杆菌O157：H7,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对8762份大便、食品等标本进行检测,315份标本金黄色葡萄球菌实时荧光PCR阳性,其中286份金黄色葡萄球菌培养阳性;31份标本大肠杆菌O157：H7实时荧光PCR阳性,其中26份大肠杆菌O157：H7培养阳性。从样品处理到检测结果仅需要时间2h～1d。结论改良分子信标-多重实时荧光PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7食物中毒的快速诊断和肠道传染病的初筛,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR方法的建立与初步应用

目的建立金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR检测方法,为实验动物细菌检测提供快速、灵敏、简便的方法。方法根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌Las I基因、肺炎克雷伯杆菌Pho E基因和细菌通用16S rRNA基因设计出特异性引物;经过多重PCR引物浓度和退火温度的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系对人工感染标本、实验动物粪便样本进行验证检测,与传统检测方法对比。结果多重PCR分别扩增出金黄色葡萄球菌(153 bp)、绿脓杆菌(600 bp)、肺炎克雷伯杆菌(368 bp)和通用(520 bp)的目的条带。多重敏感性为10 pg,特异性检测未从其他细菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测出不同组合的人工感染标本,从76只粪便检测出绿脓杆菌阳性1例,与传统检测方法结果一致。结论本文建立的多重PCR方法具有特异、灵敏、简便、快速等优点,为实验动物微生物的快速检测提供了可靠的方法。     

婴幼儿奶粉中病原菌多重PCR检测研究

目的建立婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重PCR检测方法。方法根据阪崎肠杆菌外膜蛋白A（ompA）基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）基因序列，设计两对特异性引物。对反应条件进行优化，建立针对婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重PCR检测方法，并对奶粉进行模拟检测。结果两对引物能特异扩出282bp和482bp的目的条带；在优化条件下，可同时检测模拟样品中两菌DNA，灵敏度达到10^3CFU／ml。结论与传统方法比较，研究建立的多重PCR方法敏感、特异，为快速检测奶粉中病原菌提供了有效手段。     

金黄色葡萄球菌反向线性杂交探针检测方法的建立

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌的简单、快速、灵敏、准确的方法。方法根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶nuc 基因,设计一对通用引物及两条特异性探针,用生物素标记通用引物的5′端,将两条特异性探针固定于硝酸纤维膜上,使PCR产物与探针杂交。结果建立的反向线性杂交探针方法,其检测限为2 ng/μL,检测特异性和准确性均为100%。结论建立的反向线性杂交检测方法具有较高的敏感性和特异性,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的快速检测。     

金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的克隆和序列测定

根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列，设计并合成一对特异性的引物。以鼠金黄色葡萄球菌临床分离株SA.m0109的基因组DNA为模板，利用PCR技术对其耐热核酸酶nuc基因片段进行扩增，获得了预计大小的片段。将这一片段克隆到质粒载体pGEM-T中，对重组质粒pGEM-NUC进行限制内切酶分析，PCR鉴定和克隆片段的序列测定。证实了克隆片段的可靠性。     

PCR方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

目的:建立一种快速准确检验食品中单核细胞增生李斯特氏菌的方法。方法:采用聚合酶链反应（PCR）特异性扩增单核细胞增生李斯特氏菌溶血素基因(hly A),用PCR方法检测80份长春地区的食品样品。结果:在706 bp处出现hlyA基因的目的片段,食品样品中单核细胞增生李斯特氏菌阳性检出12份,阳性率为15%,与吉林省疾病预防控制中心同步进行的国标法检测结果一致,二者符合率100%。结论:PCR方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌更简便、快速、敏感、特异性高,适用于基层单位开展食品中单核细胞增生李斯特氏菌污染的调查及监测。     

改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157：H7

目的建立改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157：H7的快速方法。方法根据GenBank公布O157：H7的rfbE保守序列，设计一对引物和改良分子信标探针，用FAM荧光剂标记探针的5’端，建立改良分子信标实时PCR检测O157：H7的反应体系，应用于食物中毒快速诊断和食品微生物检测。结果共检测11种细菌。只有大肠杆菌O157：H7有荧光信号，其余10种全无荧光信号，且与其他细菌无交叉反应，DNA灵敏度为64fg，菌液灵敏度为59cfu／ml或2cfu／PCR反应体系。应用改良分子信标实时PCR反应体系检测10株O157：H7均出现特异的荧光信号，无干扰。对89份食品样品进行检测，5份O157：H7实时PCR阳性，其余样品为阴性，检测仅需2h。5份阳性样本，经传统方法培养，有3份检出大肠杆菌O157：H7。结论改良分子信标实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于大肠杆菌O157：H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

三基因PCR检测志贺菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的研究

目的探索一种快速、经济、敏感的诊断方法,对常见的食品中的腹泻致病菌进行基因检测研究。方法建立一种快速标本处理和多基因PCR反应(multiplePCR)诊断方法,在一次PCR反应中同时扩增3种菌的致病基因:志贺菌的侵袭性(ipaH)基因、副溶血弧菌的热稳定直接溶血素(tdh)基因和霍乱弧菌Ο139的霍乱毒素(ctx)基因。扩增产物经电泳,出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的条带即判断为阳性标本;另外对这些标准菌株进行Southernblot杂交鉴定。结果对标准志贺菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测,多基因PCR法检测为阳性;PCR作为诊断方法较培养法阳性率高。结论三基因PCR具有简便、快速、特异、经济和不需要培养等特点,适用于食品检测。     

荧光PCR技术批量快速筛查肠道致病菌混合样本的研究

目的：寻找从业人员肠道传染病菌的快速筛查技术方法。方法以参加健康体检的从业人员作为研究对象,采集健康体检从业人员的肛拭子标本,采用荧光PCR技术批量快速筛查肠道致病菌混合样本的方法进行沙门氏菌和志贺氏菌检测,并与国家标准方法进行对照,比较两种检测方法的检出率结果。结果58176份样本中,共检出52份沙门菌阳性标本,阳性率为0.89‰,检出51份志贺氏菌阳性标本,阳性率为0.88‰。合计共检出致病菌103份,检出率为1.77‰。荧光PCR对沙门菌和志贺氏菌的灵敏度达到了100%,特异性也保持在99%以上。结论采用荧光PCR技术进行肠道致病菌的快速筛查能缩短检验时间,检验准确性高,从而有效阻断肠道传染病的传播和食物中毒的发生。     

利用多重PCR检测3种食源性致病菌

目的旨在建立一种可以同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的多重PCR方法。方法以金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌invA、志贺氏菌ipaH基因作为靶序列设计3对特异性引物,进行PCR反应得到223bp、302 bp、369 bp扩增片段,经测序证实扩增产物为目的片段。结果采用建立的FTA滤膜结合多重PCR的检测方法同时对这3种食源性致病菌进行检测,灵敏度均达到102 cfu/ml。结论该方法灵敏度高、耗时短,可用于同时检测3种致病菌,为预防控制细菌性食物中毒的暴发流行提供了新的检测方法。     

急性坏死性胰腺炎继发细菌感染的早期诊断

目的：探讨针对细菌16srRNA基因的通用引物聚合酶链反应（PCR）技术诊断急性坏死性胰腺炎继发感染的价值。方法：采用PCR检测急性坏死性胰腺炎患者的胰周渗液和坏死组织,并与常规培养结果作比较。结果：43份胰周渗液PCR检测阳性40份,阴性3份,而培养阳性39份,阴性4份;5份坏死组织PCR阳性4份,阴性1份,而培养阳性4份,阴性1份,PCR检测需时间仅4h。结论：该PCR方法可快速、敏感地诊断急性坏死性胰腺炎继发细菌感染。     

连接酶链反应结合荧光PCR法检测UGT1A1*28基因多态性

目的: 建立一种连接酶链反应结合荧光PCR的方法,检测结肠癌患者外周血UGT1A1*28基因多态性,并探讨其临床应用价值。方法: 设计连接酶荧光PCR引物和探针,首先通过连接酶反应,然后结合荧光PCR技术检测UGT1A1*28基因多态性,构建标准品评判该体系的特异性和敏感性,并检测50例结肠癌患者外周血标本,与DNA测序进行平行比较。结果： 此方法能准确地区分UGT1A1*28基因TA6/6、TA7/7及TA6/7基因型,且最低可检测5 ng人基因组DNA, 50例结肠癌患者外周血标本的检测结果与测序结果一致。 结论： 连接酶链反应结合荧光PCR可准确检测出UGT1A1*28基因多态性。     

套式聚合酶链反应扩增尿素酶A基因检测幽门螺杆菌

应用互补于幽门螺杆菌(HP)尿素酶A基因片段的两对引物进行套式聚合酶链反应(N-PCR),外引物的扩增片段为552bp,内引物扩增片段为310bp,用该方法检测1株HP标准菌株(N-CTC14126)和20个HP临床分离株均阳性,而其他12种肠道菌均为阴性,特异性100％,敏感性可检测到0.1fg细菌DNA的水平,优于目前国外的报道。取胃粘膜活检标本30例,用细菌培养、尿素酶试验、组织学染色作为参照方法检测,20例为阳性,10例阴性,N-PCR检测结果与之完全一致。