小分子干扰RNA逆转胃癌SGC7901/VCR细胞mdr1介导的多药耐药

目的研究小分子干扰RNA（siRNA）逆转胃癌多药耐药细胞亚系SGC7901／VCR mdr1介导的多药耐药效应。方法根据mdr1cDNA已知序列,设计并体外转录2条含21个核苷酸的siRNA（mdr1si2631和mdr1si3071）,转染SGC7901／VCR细胞,用RT-PCR检测mdr1基因mRNA的表达,免疫组织化学检测P-gp的表达,流式细胞仪检测阿霉素在细胞内的蓄积,MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性。结果siRNA转染SGC7901／VCR细胞48h后,mdr1基因mRNA和P-gp的表达水平下降,细胞内阿霉素积累量增加,对阿霉素敏感性的相对逆转率各达79．59％及59．98％。结论siRNA可逆转SGC7901／VCR细胞mdr1介导的多药耐药。     

HSP90β反义核酸载体转染细胞HSP90β蛋白的表达

目的了解HSP90β 反义核酸转染细胞中HSP90β蛋白的表达。方法通过lipofectamine介导将HSP90β反义核酸重组子pcDNA HSP90转染人胃癌细胞系SGC7901、人胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR、人肝癌细胞系HCC7402及人食管癌细胞系Ec109。经用G418进行筛选 ,对筛选出的阳性克隆用Westernblot检测HSP90β蛋白的表达。结果pcDNA HSP90转染人胃癌细胞系SGC7901 ,人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR ,人肝癌细胞系HCC7402及人食管癌细胞系Ec109后 ,用G418筛选出的阳性克隆 ,分别被命名为:AH SGC7901 ,AH SGC7901/VCR ,AH HCC7402及AH Ec109。Westernblot检测结果表明 ,AH SGC7901,AH SGC7901/VCR ,AH HCC7402及AH Ec109表达的HSP90β蛋白低于其亲本细胞。结论HSP90β反义核酸可封闭HSP90βmRNA ,使pcDNA HSP90转染的细胞AH SGC7901 ,AH SGC7901/VCR ,AH HCC7402及AH Ec109表达的HSP90β蛋白减少 ,为研究HSP90下调对肿瘤细胞生物学活性的影响提供了实验材料。     

RegⅠ在胃泌素促胃癌细胞体外增殖通路中的作用

目的 探讨再生蛋白I (RegⅠ)在胃泌素刺激胃癌细胞增殖通路中的作用.方法 根据RegⅠ cDNA已知序列,在线设计3个小干扰RNA,并经基因库同源性比较,构建其RegⅠ-shRNA表达载体(pSUPER-EGFP-REG/1、pSUPER-EGFP-REG/2和pSUPER-EGFP-REG/3),利用脂质体2000转染试剂分别转染胃癌细胞BGC823细胞株、SGC7901细胞株,同时设转染空质粒的实验对照组和无质粒转染的空白细胞组.后经G418筛选建立稳定转染细胞株.RT-PCR检测RegⅠ基因mRNA的转录水平,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测胃泌素孵育对胃癌细胞增殖的效应.结果 酶切及测序鉴定,插入片段正确,3个RegⅠ-shRNA表达载体构建成功;RT-PCR显示,pSUPER-EGFP-REG/1可有效抑制RegⅠ mRNA在胃癌细胞BGC823、SGC7901的转录.Western boltting结果显示,BGC823和SGC7901细胞的RegⅠ蛋白表达率分别下调到空载体对照组的(45±4)%和(53±4)%;MTT结果显示,RegⅠ基因表达抑制胃癌细胞系的增殖效率均降低(P＜0.05).胃泌素孵育后,胃癌细胞BGC823、SGC7901的增殖效率均增加(P＜0.05),而RegⅠ基因表达抑制的胃癌细胞系增殖效率则无明显改变(P＞0.05).结论 实验成功建立了RegⅠ基因表达抑制的胃癌细胞系; RegⅠ基因可能对胃泌素促胃癌细胞的增殖有促进的作用.     

MAD2 RNA干扰载体的构建及其对胃癌细胞生长的影响

目的：构建MAD2（有丝分裂阻滞缺陷蛋白2）特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制MAD2基因表达对胃癌细胞生长和细胞周期的影响.方法：构建MAD2 siRNA真核表达载体,脂质体法将pSilencer3.1空载体和pSilencer3.1/MAD2-siRNA1和pSilencer3.1/MAD2-siRNA2真核表达载体分别导入人胃癌细胞系SGC7901.稳定转染后Western blot和RT-PCR检测胃癌细胞内MAD2蛋白及mRNA水平的表达情况,挑选出抑制效果最好的单个克隆.MTF法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测纺锤体抑制剂长春新碱作用后,胃癌细胞MAD2-siRNA转染组和空载体组细胞周期的分布.结果：成功构建MAD2 siRNA真核表达载体,转染胃癌细胞SGC7901可使其MAD2蛋白及mRNA表达显著下调.MAD2表达降低的胃癌细胞生长速度明显增快（P＜0.01）,经长春新碱作用后不能被阻滞于有丝分裂期.结论：小干扰RNA技术可以有效地特异性抑制胃癌细胞纺锤体检查点关键蛋白MAD2的表达.MAD2的抑制可使胃癌细胞SGC7901生长加速,增殖能力增强,同时减弱纺锤体抑制剂长春新碱阻滞细胞周期的作用.     

人死亡受体5全长基因的构建及转染胶质瘤细胞

目的构建人死亡受体5(death receptor5,DR5)全长基因真核细胞表达载体pcDNA3.1/DR5,pcDNA3.1/GFP/DR5,并观察其转染胶质瘤细胞U138的效果。方法通过重叠PCR获得DR5全长编码序列,构建pcDNA3.1/GFP/DR5,pcDNA3.1/DR5表达载体,利用脂质体转染试剂盒,分别将2种质粒pcDNA3.1/GFP/DR5、pcDNA3.1/GFP共转染胶质瘤细胞U138,转染后72h,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测DR5mRNA的表达,流式细胞术检测DR5的表达强度、检测Anti-DR5对胶质瘤细胞U138生长的影响。结果获得了DR5全长编码序列,成功瞬时转染U138,RT-PCR、流式细胞术检测结果表明,转染后U138细胞DR5mRNA、蛋白水平的表达明显增加,Anti-DR5可以明显抑制U138细胞的生长。结论获得了DR5全长编码序列,探索到成功转染DR5的最佳方法,为稳定筛选高表达DR5的U138细胞提供依据。     

RNA干扰技术抑制耐药细胞MDR1基因表达的研究

目的： 探讨载体表达的小干扰RNA (siRNA)抑制MDR1基因的表达，并逆转卵巢癌耐药细胞多药耐药的可行性。 方法： 浓度梯度诱导法和人MDR1基因载体转染法建立阿霉素耐药细胞株OVCAR/AR和多药耐药亚株OVCAR/MDR细胞。脂质体介导将MDR1特异性siRNA的表达载体(pSN/mdr1a和pSN/mdr1b)转染耐药细胞，实时定量RT-PCR方法检测MDRl mRNA的表达，流式细胞术检测P-gp的表达，MTT法检测耐药细胞对化疗药的抵抗性。 结果： 耐药细胞OVCAR/MDR细胞MDR1 mRNA的表达高于OVCAR/AR细胞，两者均高于其亲代细胞OVCAR-3；转染pSN/mdr1a和pSN/mdr1b可显著抑制两株耐药细胞MDR1 mRNA和P-gp的表达，OVCAR/MDR和OVCAR/AR细胞对阿霉素抗药性的逆转率分别为79.5%和93.9%。 结论： 载体表达的MDR1特异性siRNA可抑制卵巢癌耐药细胞亚株MDR1基因的表达，因而增加耐药细胞对化疗药物的敏感性。     

PAK2真核表达载体的构建及在胃癌细胞内的表达与定位

目的 构建PAK2真核表达载体及证实在胃癌细胞内的表达与定位.方法 提取HeLa细胞的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增PAK2全长编码基因,克隆至pcDNA3.1A表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,Western blot检测蛋白表达,免疫荧光检测PAK2在胃癌细胞内的定位.结果...     

pcDNA3.1-MORC2重组质粒的构建及其在胃癌细胞SGC-7901中的表达和定位

目的 构建真核表达载体pcDNA3.1-MORC2并瞬时转染人胃癌细胞SGC-7901,观察融合蛋白在细胞内表达及定位.方法 以人MORC2 cDNA为模板,PCR扩增MORC2全长编码基因,亚克隆至pcDNA3.1-hisA表达载体.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,提取细胞蛋白进行Wester...     

TNFAIP8 与胃癌耐药关系的初步研究

目的:探讨TNFAIP8 与胃癌耐药性的关系。方法:选取47 例进行新辅助化疗患者手术前后的标本,免疫组化检测TNFAIP8 蛋白的表达;Western blot 检测胃癌细胞株SGC-7901 及其顺铂耐药细胞株SGC7901/ DDP 中TNFAIP8 蛋白表达差异,利用RNA 干扰技术降低顺铂耐药细胞株中TNFAIP8 的蛋白表达后,MTT 检测其对顺铂的敏感性有无变化。结果:TNFAIP8 在新辅助化疗前后的表达差异不大,在新辅助化疗无效组中的表达较有效组高(P<0.05);SGC7901/ DDP 细胞中TNFAIP8 蛋白的表达高于SGC7901 细胞,siRNA-TNFAIP8 质粒转染SGC7901/ DDP 细胞后蛋白表达显著下降,MTT 结果显示降低TNFAIP8 蛋白表达,细胞对顺铂的IC50 较SGC7901/ DDP 显著下降(P<0.05),敏感性提高。结论:TNFAIP8 参与了胃癌的化疗耐药性。     

支架蛋白活化蛋白激酶C受体1在胃癌细胞中的表达及其与胃癌细胞增殖的关系

目的 探讨活化蛋白激酶C受体1C(RACK1, GNB2L1)在胃癌细胞HGC27中的表达及过表达RACK1对HGC27生长增殖的影响。方法 体外培养胃癌未分化细胞HGC27和正常胃黏膜上皮细胞系GES-1,收集细胞48 h后,提取mRNA和蛋白,利用RT-PCR检测RACK1 mRNA在HGC27和GES-1细胞中的表达;利用Western blotting法检测RACK1蛋白在两种细胞中的表达;以人胚肾HEK293细胞cDNA为模板,构建pcDNA3.1A-flag-RACK1重组质粒,利用Lipo2000转染入HGC27细胞中,Western blotting法检测质粒的转染效率,MTT法检测过表达RACK1对HGC27胃癌细胞系生长增殖的影响。 结果 HGC27胃癌细胞中RACK1的mRNA和蛋白水平表达低于GES-1细胞（P<0.01）。双酶切鉴定和测序分析表明,pcDNA3.1A-flag-RACK1重组质粒构建成功。将该质粒转入HGC27细胞后,与未转染组相比,空载转染组RACK1蛋白表达无明显区别（P>0.05）,pcDNA3.1-RACK1转染组RACK1蛋白表达明显升高（P<0.01）;转染pcDNA3.1A-flag-RACK1转染组细胞存活率在72 h和96 h明显少于pcDNA3.1空载对照组（P<0.01）。结论 支架蛋白RACK1的mRNA和蛋白水平在HGC27细胞中低表达,上调RACK1的表达可明显抑制HGC27细胞增殖。     

Fas基因转导逆转胃癌耐药细胞的作用及其机制分析

目的　 观察Fas基因转导人胃癌耐药细胞SGC790 1/VCR对化疗药物的敏感性 ,并初步探讨其机制。方法　 以流式细胞仪检测Fas基因转导和对照胃癌细胞在细胞周期中的分布 ;用MTT实验检查癌细胞对多种药物的敏感性 ;用免疫细胞化学染色法检测胃癌细胞P 糖蛋白 (P gp)和拓扑异构酶II(TopoII)的表达。结果　与胃癌细胞SGC790 1和pBK SGC790 1/VCR相比较 ,Fas SGC790 1/VCR在G2期减少 ,S期增多 ,并出现明显的凋亡峰 ;Fas SGC790 1/VCR对DDP ,MMC和 5 Fu的敏感性增加 ,但对VCR和DOX的敏感性无明显变化 ;SGC790 1,pBK SGC790 1/VCR和Fas SGC790 1/VCRTopoII的表达无明显差别 ;Fas SGC790 1/VCRP gp的表达水平明显低于 pBK SGC790 1/VCR ,仅显示弱阳性。 结论　Fas基因可在一定程度上逆转人胃癌耐药细胞SGC790 1/VCR的多药耐药性 (MDR) ,其涉及的相关机制可能是增强细胞对凋亡诱导剂的敏感性 ,以及降低细胞P gp的表达水平     

Reversal of P‐glycoprotein‐mediated multi‐drug resistance by the E3 ubiquitin ligase Cbl‐b in human gastric adenocarcinoma cells

P‐glycoprotein (P‐gp)‐mediated multi‐drug resistance (MDR) is a major barrier to the effective chemotherapy of many cancers. Recent studies have shown that inhibition of the PI3K/Akt signalling pathway can reverse P‐gp‐mediated MDR. We investigated the expression of activated Akt (p‐Akt) in 124 human gastric carcinoma tissue samples. Ubiquitous p‐Akt expression was recorded in the majority (88/124). There was a significant correlation between p‐Akt expression and the expression of P‐gp. In the adriamycin‐resistant MDR gastric carcinoma cell line SGC7901/ADR, p‐Akt expression was increased in comparison with the parental cell line SGC7901. Treatment of SGC7901/ADR cells with the PI3K inhibitor LY294002 reduced the expression of both p‐Akt and P‐gp. To explore the role of ubiquitin ligase Cbl‐b in this regulatory pathway, SGC7901/ADR cells were transfected with a plasmid overexpressing wild‐type Cbl‐b. This down‐regulated the expression of both p‐Akt and P‐gp. Furthermore, resistance to chemotherapeutic drugs was partially reversed. These results demonstrate an important role for Cbl‐b in reversing P‐gp‐mediated gastric cancer MDR through suppression of the PI3K/Akt signalling pathway and the down‐regulation of P‐gp expression. Copyright © 2009 Pathological Society of Great Britain and Ireland. Published by John Wiley & Sons, Ltd.     

人钙周期素结合蛋白(hCacyBP)基因的原核表达及其鼠抗血清的制备

目的 :原核表达hCacyBP并制备小鼠抗hCacyBP多克隆抗体。观察该蛋白组织分布情况 ,研究其可能在胃癌多药耐药形成中的作用。方法 :将hCacyBP基因的全编码区克隆进原核表达载体pET2 8a中 ,转化E .coli,以IPTG诱导重组目的蛋白的表达。以纯化的重组目的蛋白作为免疫原免疫小鼠 ,制备相应的多克隆抗体。以Westernblot法检测hCacyBP在兔 10种组织的表达情况 ;以Westernblot和免疫组化染色法检测hCa cyBP在胃癌耐药细胞SGC790 1/VCR及其亲本药敏细胞SGC790 1中的表达和分布。结果 :成功地表达重组目的蛋白并制备了小鼠抗hCacyBP的多克隆抗体 ,Westernblot分析显示 ,hCacyBP在兔的 10种组织中均有表达 ,在脑和肝组织中表达略高 ;hCacyBP在胃癌耐药细胞SGC790 1/VCR及其亲本药敏细胞SGC790 1中的表达未见明显差异。结论 :CacyBP是在多种组织中广泛表达的一种蛋白质。制备的小鼠抗hCa cyBP多克隆抗体特异性较高 ,为进一步研究hCacyBP的功能提供了工具。     

ZAC基因在奥曲肽抑制胃癌细胞体外增殖通路的作用

目的 探讨ZAC基因在生长抑素类似物奥曲肽（OCT）抑制胃癌细胞增殖通路的作用。方法 分别以不同浓度OCT处理胃癌细胞BGC823和 SGC7901不同时间,MTT法筛选其增殖抑制的有效条件。OCT处理胃癌细胞（有效浓度/不同时间,有效时间/不同浓度）,Western blotting检测
OCT对胃癌细胞ZAC基因的效应。设计3条ZAC基因RNA干扰片段,分别插入pSUPER-EGFP-I载体,构建3个ZAC-shRNA表达载体（pSUPER-EGFP-ZAC/1 pSUPER-EGFP-ZAC/2和pSUPER-EGFP-ZAC/3）。经酶切和序列分析鉴定后,分别转染胃癌细胞BGC823和SGC7901。经G418筛选,RT-PCR鉴定,建立
ZAC基因敲低（knock-down）的胃癌细胞系。以有效条件OCT孵育胃癌细胞（对照组）和ZAC基因敲低胃癌细胞（实验组）,MTT法检测OCT对胃癌 细胞的生长抑制效应。结果 OCT抑制胃癌细胞增殖的有效条件为10nmol/L 孵育24h;OCT以时间和浓度依赖的方式诱导胃癌细胞ZAC基因表达。酶切及序列分析鉴定表明ZAC-shRNA表达载体构建成功。转染shRNA-ZAC/2的胃癌细胞,其ZAC mRNA水平明显降低（P<0.05）,为ZAC基因敲低胃癌 细胞。ZAC基因敲低胃癌细胞的增殖明显高于对应的BGC823细胞和SGC7901细胞（P<0.05）。OCT孵育后,BGC823细胞和SGC7901细胞的增殖明显降低（P<0.05）。然而,ZAC基因敲低胃癌细胞的增殖无明显改变（P>0.05）。结论 OCT以时间和浓度依赖的方式诱导胃癌细胞ZAC基因表达;ZAC 基因在OCT抑制胃癌细胞增殖通路中具有重要作用。     

MDR相关性单克隆抗体MGr－1逆转胃癌细胞耐药的体外研究

目的：研究胃癌细胞耐药相关性单克隆抗体ＭＧｒ－１对耐长春新碱胃癌细胞（ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ）多药耐药性（ＭＤＲ）的影响。方法：用ＭＴＴ法检测阿霉素的细胞毒性；用流式细胞仪检测阿霉素在细胞内的蓄积及潴留。结果：ＭＧｒ－１能明显逆转ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞对阿霉素的耐药性（Ｐ＜０．０１），并可增加ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞内阿霉素的蓄积（Ｐ＜０．０１）及潴留（Ｐ＜０．０１）。结论：ＭＧｒ－１具有通过增加细胞内药物蓄积及潴留逆转ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞耐药性的功能。提示ＭＧｒ－１所对应的细胞膜抗原可能为一种新的有活性功能并与ＭＤＲ相关的分子。     

MicroRNA-126通过靶向抑制EZH2增加胃癌SGC-7901细胞的放射敏感性

目的:探讨微小RNA-126(miR-126)增强胃癌细胞放射敏感性的分子生物学机制。方法:体外培养胃癌SGC-7901细胞,通过转染miR-126模拟序列上调细胞内的miR-126水平,使用RT-q PCR及Western blot检测miR-126上调后zeste基因增强子同源物2(EZH2)的mRNA及蛋白水平的变化。双萤光素酶报告基因实验确认miR-126与EZH2的靶向结合关系。在上调miR-126水平的同时,通过共转染pc DNA3.1-EZH2真核表达质粒提高细胞内的EZH2表达,CCK-8法及流式细胞术分析照射后胃癌细胞的活力及凋亡率的变化,从而评估EZH2过表达对miR-126放射增敏作用的影响。结果:上调胃癌SGC-7901细胞中的miR-126水平可以显著抑制EZH2的mRNA及蛋白水平(P0.05)。双萤光素酶报告基因实验提示miR-126与EZH2的mRNA间存在直接靶向关系。与仅上调miR-126的细胞相比,上调miR-126水平的同时过表达EZH2水平,将导致照射后SGC-7901细胞的活力增加,凋亡率减少(P0.05)。结论:对EZH2靶向抑制是miR-126增强胃癌SGC-7901细胞放射敏感性的机制之一。     

人ArgBP2基因真核表达载体的构建及其在胃癌细胞的表达

目的人ArgBP2基因真核表达载体的构建及其在胃癌细胞系中的表达。方法从人胃癌细胞系SCG7901中提取RNA,反转录为cDNA,并以此为模板,扩增ArgBP2的全长编码基因,并构建到真核表达载体pcDNA3.1/HisC中,同时应用Western blot方法检测其表达,然后利用RT-PCR方法检测在各种胃癌细胞系内源性ArgBP2的表达。结果人ArgBP2编码序列已被克隆至pcDNA3.1/HisC表达载体,双酶切鉴定片段大小为1935bp,Western blot验证其表达成功,大小为70kDa,并在RNA水平上检测ArgBP2在胃癌细胞系中的表达。结论成功构建了人ArgBP2基因真核表达载体,在胃癌细胞系表达,为进一步研究ArgBP2的生物学特性及其信号转导通路奠定了基础。