牙周韧带细胞膜片技术用于牙周组织再生的研究进展

为了解决中重度牙周炎引发的牙周组织破坏后无法自主再生的问题,细胞膜片工程根据引导性组织再生术的基本原理,通过将使用温敏培养皿等方法获取的完整细胞片层直接移植贴附到缺损部位的方法,实现获取牙骨质、牙槽骨及嵌入二者的牙周韧带同时再生的目标.近年来,细胞膜片技术不断发展,逐步克服了单层细胞膜片厚度偏低、血管化不良及自体细胞来源不足等问题,其中运用牙周韧带细胞膜片进行牙周组织再生已经正式进入临床试验阶段.本文对近年来牙周韧带细胞膜片及其他常用细胞膜片在牙周组织再生方向应用的新进展作一综述.     

牙周膜来源细胞膜片在牙周再生中的应用研究进展

牙周炎作为危害口腔健康的严重疾病之一,其引起的牙周支持组织的损害和丧失却得不到良好的治愈,使得患者的生活质量严重下降。细胞膜片技术作为细胞移植的一种新方法,可以减少细胞的流失,提高细胞的利用率,且在移植的过程中无需外源性支架材料,其在牙周组织工程中表现出了巨大的潜力。本文就组织工程中细胞膜片技术及牙周膜来源的细胞膜片在牙周再生中的研究进展做一综述。     

牙周韧带细胞的异质性

牙周韧带细胞是一群具有异质性的多能干细胞,在牙周再生中发挥着重要作用、本文从体内实验、体外实验及细胞移植学方面对牙周韧带细胞的异质性进行了综述。     

细胞膜片技术在牙周、牙髓牙本质再生中的应用研究

细胞膜片技术作为一种细胞移植的新方法,能够最大程度保留细胞外基质和细胞间黏附蛋白,减少细胞流失、避免外源性生物材料的应用且提高细胞植活率,被广泛关注。本文就近年来细胞膜片技术在牙周、牙髓牙本质再生中的应用研究作一综述。     

人牙周韧带细胞与壳聚糖-胶原支架体外培养的实验研究

目的:探讨壳聚糖-胶原支架在人牙周韧带细胞(PDLC)体外培养中的作用.方法:将体外培养PDLC接种于壳聚糖-胶原支架上,通过MTT法测定细胞增殖情况,通过半定量PCR检测细胞mRNA合成变化.结果:与传统的平板培养相比,PDLC在壳聚糖-胶原支架上的增殖及mRNA合成情况有显著性差异(P<0.05).结论:该复合支架可以作为PDLC的载体;对PDLC的增殖及细胞外基质的合成均有较好地促进作用.     

利用细胞膜片技术进行牙周重建的研究进展

牙周炎是人类牙齿缺失的最主要病因,危害人类口腔及全身健康.牙周再生的目标是再生牙周组织和重建功能性牙槽骨-牙周膜-牙骨质牙周复合体.随着组织工程学和牙周再生技术的发展,细胞膜片技术的出现为牙周重建提供了新思路.现就细胞膜片技术在细胞膜片构建和不同来源种子细胞两方面的研究进展作一综述.     

构建一种新型牙周膜牙囊复合细胞膜片的研究

目的：拟构建一种牙周膜牙囊复合细胞膜片,并比较其与单一膜片的性能差异,以期寻找一种更加优越的牙周缺损修复材料。方法：将第三代牙周膜干细胞及牙囊干细胞直接混合共同培养,将牙周膜牙囊混合细胞、牙周膜干细胞及牙囊干细胞分别制备成细胞膜片,应用HE染色,扫描电镜比较三种膜片形态学差异,应用茜素红染色,RT—PCR比较三种膜片成骨能力差异。结果：扫描电镜结果显示,牙囊牙周膜混合细胞膜片分泌更多的细胞外基质。HE染色结果也显示牙囊牙周膜混合细胞膜片细胞层数更多,基质分泌量更大。同时,牙囊牙周膜混合细胞膜片AIJP、Runx2、OCN表达显著高于单一细胞膜片。成骨诱导21天后,茜素红染色结果显示,与单一细胞膜片相比,牙囊牙周膜混合细胞膜片染色更深。结论：牙周膜牙囊复合细胞膜片较单一细胞膜片,细胞层数更多,基质分泌量更大,骨向分化能力更强,为牙周再生提供了新的思路。     

黄芩苷对人牙周韧带细胞超微结构的影响

目的：观察黄芩苷对人牙周韧带超微结构的影响。方法：10ng/mL的黄芩苷孵育人牙周韧带细胞5d，采用透射电镜观察人牙周韧带细胞超微结构的变化。结果：与对照组比较，用药组细胞的内质网、线粒体等明显增多。结论：黄芩苷能促进细胞的代谢和蛋白质的合成，与细胞增殖实验和总蛋白测定结果一致。     

两种体外培养人牙周韧带成纤维细胞方法比较

目的探索一种在体外短时间内简便、可靠获取大量人牙周韧带成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblast,HPLF)、建立稳定的体外培养体系的方法。方法采用酶消化法和组织贴块法进行HPLF体外原代培养及传代培养的对比研究。通过细胞形态学、超微结构观察及波形蛋白和角蛋白免疫组化染色等对细胞进行定性研究;测定细胞生长曲线了解细胞生长基本规律及其增殖能力。结果采用酶消化法和组织贴块法均可成功的进行HPLF连续传代培养。最高传代数为30代。培养的细胞具有成纤维细胞的典型形态,波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,生长稳定期倍增时间为48~72h。组织块培养法需培养时间长,原代培养获取的细胞量较少,较难传代。酶消化法可短时间内获取大量细胞,细胞产量高,但操作手续复杂易污染,细胞易受损伤。结论成功建立了一个稳定的HPLF体外培养体系。除常用的组织块法外,胰蛋白酶及胶原酶联合消化法不失为一种简便、快速、可靠的组织原代分离培养方法。     

富血小板血浆对人牙周膜细胞增殖及分化的影响

目的:探索不同浓度富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对人牙周膜细胞体外增殖和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响.方法:两步离心法制备PRP,用酶联免疫吸附法检测血浆、PRP、激活后PRP上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factors-β1,TGF-β1)和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factorAB,PDGF-AB)的水平.分别用2%、5%、105、20%激活后的PRP作用于人牙周膜细胞,以DMEM培养液为阴性对照.在作用24h和72h后,用细胞计数试剂盒检测细胞增殖状况,以对硝基磷酸二钠为底物,检测细胞ALP的活性.用SPSS10.0软件包中的方差分析和配对t检验进行统计学分析.结果:激活后的PRP上清中,TGF-β1和PDGF-AB的水平均高于未经激活的PRP和血浆.各浓度PRP促细胞增殖和ALP活性的作用均显著强于阴性对照组(P＜0.001);各浓度PRP 72h时促细胞增殖和ALP活性的作用均高于24h时(P＜0.01);不同浓度PRP组问存在显著差异(P＜0.001),PRP浓度从2%渐增至10%时,细胞增殖和ALP活性随之增加;当PRP浓度达到20%时,促细胞增殖作用开始下降,而促ALP活性作用继续增强.结论:在1～3d内,PRP对人牙周膜细胞的体外增殖和ALP活性均有促进作用,并在一定范围内呈剂量依赖关系.     

体外培养的人牙周膜细胞成骨样细胞表型特征的研究

目的 对体外培养的人牙周膜细胞成骨样细胞的表型特征进行研究探讨。方法 组织块 法培养人牙周膜细胞,放射免疫法检测条件培养基中碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和骨钙素（ＯＣＮ）的分泌活性,免疫 组化法检测非分泌型的ＡＬＰ和ＯＣＮ的表达,原位杂交方法检测二者的ｍＲＮＡ水平的表达。结果 人牙 周膜细胞具有成骨细胞的部分表型,碱性磷酸酶在蛋白水平包括分泌和非分泌型及基因转录水平都有一 定的表达,随培养时间的变化不大;而不具有成熟的成骨细胞的表型特征——骨钙素的表达,其无论是在 基因和蛋白水平都没有表达二这一结果为进一步研究人牙周膜细胞在机械力作用下参与骨改建打下基础。     

脂联素对人牙周膜成纤维细胞的作用

目的:原代培养人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament cell,hPDLC),研究脂联素受体(adiponectinreceptor,Adipo R)在hPDLC中的表达情况,以及脂联素(adiponectin,ADP)对hPDLC增殖的作用。方法:收集因正畸需要而拔除的健康前磨牙10颗,玻片覆盖组织块法原代培养hPDLC,RT-PCR法检测分析AdipoR1和AdipoR2在hPDLC中的表达。使用不同浓度ADP(0,5,10,20ng/μL)刺激体外培养的hPDLC,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,分别测定第1、4、7天的细胞增殖活性。采用SSPS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果:免疫组化显示,培养的细胞波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,证明体外原代培养细胞及传代细胞均为中胚层组织来源的hPDLC,且无上皮来源细胞混杂。琼脂糖凝胶电泳检测显示,Adipo R2在人牙周膜成纤维细胞中表达阳性。MTT法检测的生长曲线显示,随着ADP浓度的增加,细胞增殖活性增加。培养24h后,C、D组与对照组相比差异显著(P相似文献   

诱导成体人牙周韧带干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的从成体人牙周组织中分离培养牙周韧带干细胞，研究其分化为软骨细胞的可行性。方法选取10～15岁的年轻患者因正畸拔除的健康牙齿，刮取根中1／3的牙周膜，采用组织块培养法得到牙周韧带细胞，待细胞达一定量后用有限元稀释法进行单细胞克隆，筛选牙周韧带干细胞（PDLSC），体外采用离心管聚集体诱导法进行软骨化诱导培养，光镜下观察诱导细胞形态学的改变，甲苯胺蓝染色、免疫组化、RT-PCR等方法检测胶原和糖蛋白的体外表达情况。结果体外离心管聚集体诱导培养3周后，实验组呈白色半透明状，甲苯胺蓝染色显示在外周区域有大量软骨基质成分沉积，组织学显示有较为明显的软骨陷窝。免疫组化及RT-PCR检测到Ⅱ型胶原表达，Ⅱ型胶原染色呈强阳性。对照组细胞团块逐渐收缩、崩解，组织学检测无软骨陷窝结构，Ⅱ型胶原免疫组化结果阴性。结论从成体人牙周组织中可分离培养出干细胞，在体外能有效增殖且保持低分化状态，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能，也为牙周组织工程的应用奠定了实验基础。     

人骨髓基质干细胞对人牙周膜干细胞膜片再生牙周膜样组织的影响

目的:研究人骨髓基质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,HBMMSCs)对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,HPDLSCs)膜片再生牙周膜样组织的影响。方法:利用Transwell共培养HBMMSCs和HPDLSCs,通过ALP和MTT的方法检测共培养HPDLSCs的ALP活性和增殖活性。将共培养的HPDLSCs制成膜片与煅烧的陶瓷牛骨(ce-ramic bovine bone,CBB)复合,行裸鼠体内异位移植。结果:体外结果显示,HBMMSCs可以提高HPDLSCs的ALP活性,促进细胞增殖。体内结果显示,共培养的HPDLSCs膜片不仅可以再生含矿化结构的牙周膜样组织,而且再生出丰富的血管。结论:HBMMSCs促进HPDLSCs膜片再生血管化的牙周膜样组织。     

Scleraxis在牙周韧带细胞、牙龈成纤维细胞中的表达

目的研究碱性螺旋-环-螺旋转录因子 Scleraxis 能否在人牙周韧带细胞、牙龈成纤维细胞、骨髓基质细胞中表达,及其与牙周韧带细胞分化能力的关系。方法体外培养人牙周韧带细胞、牙龈成纤维细胞和骨髓基质细胞,RT-PCR 法检测牙龈成纤维细胞、骨髓基质细胞及不同代次牙周韧带细胞中 Scleraxis 的表达。结果 Scleraxis 在牙周韧带细胞、骨髓基质细胞及牙龈成纤维细胞中的表达差异有统计学意义(P<0.05)。其 Scleraxis 与β-肌动蛋白吸光度比值分别为0.877±0.024,0.438±0.031,0.313±0.083。Scleraxis 在牙周韧带细胞中的表达最强,在牙龈成纤维细胞中表达最弱。牙周韧带细胞中 Scleraxis 的表达随培养代次的增加而减弱。结论 Scleraxis 可表达于体外培养的牙周韧带细胞、牙龈成纤维细胞和骨髓基质细胞,Scleraxis 可能在牙周韧带细胞的分化过程中起重要作用。     

Effects of connective tissue growth factor on human periodontal ligament fibroblasts

ObjectiveThe aim of this study was to evaluate the effects of different concentrations of connective tissue growth factor (CTGF) on human periodontal ligament fibroblasts(HPLFs).DesignHPLFs were cultured and identified. Then, different concentrations of CTGF (1, 5, 10, 50, 100 ng/ml) were added to the HPLF culture. Next, CCK-8 assays, alkaline phosphatase (ALP) assays, hydroxyproline determination, alizarin red staining methods, Transwell chambers and real-time PCR methods were applied to observe the effects of CTGF on the proliferation, ALP activity, synthesis of collagen, formation of mineralized nodules and migration. We also studied expression of ALP, fiber link protein (FN), integrin-binding sialoprotein (IBSP), osteocalcin (OC), and integrin beta 1 (ITGB1) mRNA by HPLFs. Statistical significance was assumed if P < 0.05 or P < 0.01.ResultsThe addition of CTGF (1, 5, 10 ng/ml) remarkably promoted the proliferation and collagen synthesis of HPLFs compared with controls. CTGF (1, 5, 10, 50 ng/ml) improved ALP activity of HPLFs, and at all concentrations, CTGF (1, 5, 10, 50, 100 ng/ml) improved the expression of ALP, FN, IBSP and ITGB1 mRNA. In addition, CTGF (1, 5, 10, 50, 100 ng/ml) promoted the migration of HPLFs, which was dose-dependent, with maximal promotion in the 10 ng/ml group (P < 0.05 or P < 0.01).ConclusionsThus, in a certain range of concentrations, CTGF can promote the biological effects, including proliferation, migration and collagen synthesis of HPLFs, to promote the differentiation of HPLFs in the process of osteogenesis.     

Immunohistochemical investigation on the pattern of vimentin expression in regenerated and intact monkey and human periodontal ligament

The expression of vimentin is well documented in the intact animal and human periodontal ligament (PDL), but there is limited information on the pattern of vimentin expression in the regenerated PDL. The aim of the present study was to investigate the pattern of vimentin expression in the regenerated and intact monkey and human PDL. A total of 12 chronic recession-type defects were created in three monkeys (Macaca fascicularis) and treated either with guided tissue regeneration (GTR), or with an enamel matrix protein derivative (EMD). After 5 months, the animals were sacrificed and specimens containing the defects and surrounding tissues were dissected free, decalcified in EDTA and embedded in paraffin. Sections were labelled immunohistochemically by using monoclonal antibody against vimentin (VIM 3B4). Twelve patients, each of whom displayed one deep intrabony defect scheduled for extraction were treated with GTR, EMD or combination of EMD+natural bone mineral (NBM). Following a healing period of 6 months, the teeth were extracted "en block" and immunohistochemically analysed according to the same protocol as described in monkeys. The results revealed that in both monkeys and humans the newly formed PDL was labelled similarly for vimentin to the intact (non-treated) PDL. In all specimens, the newly formed PDL was in continuation with the intact parts of PDL, thus suggesting that the mesenchymal cells capable of regenerating the attachment apparatus may have their origin in the intact PDL. In conclusion, the present findings indicate that (a) the reformed PDL displayed a similar expression of vimentin to the intact (original) PDL, and (b) the cells capable of regenerating new PDL and new cementum appear to be of mesenchymal origin and their source may be in the intact PDL.     

静压力对体外人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的研究静压力对体外人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLFs)增殖活性的影响。方法用静压力加载装置对第4代HPDLFs分别施加0、15、30、45 kPa的持续性静压力,加力时间为1 h。加力后采用流式细胞术及噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法观察HPDLFs增殖活性。结果流式细胞术检测结果显示0、15、30 kPa静压力下HPDLFs增殖指数分别为(40.11±0.59)%、(49.89±0.75)%、(55.77±1.57)%,呈递增趋势(P<0.05);静压力达到45 kPa时,HPDLFs增殖指数有所降低,为(35.35±0.85)%。MTT法检测结果显示在0、15、30 kPa静压力下吸光度值分别为0.30±0.04、0.35±0.05、0.40±0.07,呈递增趋势(P<0.05);静压力达到45 kPa时,吸光度值有所降低,为0.25±0.04。结论适当大小的静压力能促进HPDLFs的增殖,过大的静压力会抑制HPDLFs的增殖。     

盐酸小檗碱对体外培养人牙周膜细胞生物活性的影响

目的:探讨盐酸小檗碱对原代培养的人牙周膜细胞(PDLC)生物活性的影响。方法:采用细胞培养技术、噻唑蓝(MTT)比色法、考马斯亮蓝法、酶动力学方法观察盐酸小檗碱对PDLC增殖活性、蛋白合成及碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。结果:①与对照组比较,作用24h,盐酸小檗碱(0.005～0.030g/L)能明显增强人牙周膜细胞增殖能力(P<0.05);作用48h,盐酸小檗碱(0.005～0.020g/L)能明显增强人牙周膜细胞增殖能力(P<0.05);作用72h,盐酸小檗碱(0.010～0.020g/L)能明显增强人牙周膜细胞增殖能力(P<0.05)。②盐酸小檗碱(0.005～0.020g/L)细胞培养液中蛋白总含量均明显高于对照组(P<0.05)。③盐酸小檗碱(10～20g/L)细胞培养液中ALP活性均明显高于对照组(P<0.05)。结论:盐酸小檗碱在0.010～0.020g/L浓度范围内有促进PDLC的增殖及生物合成作用,能增强牙周膜细胞ALP活性。