耳蜗内毛细胞中带状突触相关钙离子通道的研究进展

在内毛细胞(inner hair cell,IHCs)中,突触对声音的启动做出反应,驱动受神经支配的螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons,SGN)以kHz为单位的频率产生动作电位,并支持以几百赫兹的频率对持续的声音进行反应.我们认为突触前带状结构和其他特殊的分子组成是获得这些功能特征的基础....     

耳蜗内毛细胞带状突触与感音神经性聋相关研究进展

耳蜗内毛细胞传入神经突触是声音信息传递到中枢神经系统的第一个传入性突触结构,因其空间分布呈带状,故常被称为“带状突触”。这些带状突触是声音信号传导和释放的重要节点,在听觉形成和听力损伤过程中起着不可替代的作用。但是由于耳蜗体积小,带状突触所在的位置深、数量少,长期以来,关于内毛细胞带状突触结构及功能的研究进展缓慢。     

内毛细胞带状突触的形态及功能研究进展

耳蜗作为哺乳动物的听觉器官,能够编码不同频率和强度的声音,这一过程由两种机械力感受细胞参与,即内毛细胞和外毛细胞.具有电运动性的外毛细胞,使耳蜗对声音的频率具有高度敏感性和选择性,对声音有放大作用;而内毛细胞才是真正将声音的频率和强度信息传递给中枢神经系统的感受细胞.耳蜗内毛细胞将声波的振动模拟为电信号,形成电势差,刺激神经递质释放到相应的螺旋神经元,再由螺旋神经元投射到中枢神经系统.     

耳蜗内毛细胞突触对氨基糖甙类药物毒性的反应特性

目的 探讨氨基糖甙类药物毒性对小鼠耳蜗内毛细胞突触数量的影响.方法 采用固定剂量(100 mg/kg)的庆大霉素对C57BL/6J小鼠每日进行腹腔注射造模,分别在注射后的第4天、7天和10天观察耳蜗基底膜顶回区域的内毛细胞突触数量的变化,以同窝未注射小鼠的耳蜗基底膜顶回作为实验对照.内毛细胞突触前后膜分别采用CtbP2和GhR2/3进行免疫荧光标记,在激光共聚焦显微镜下进行观察.采用3dmax 8.0对实验结果进行三维重建,在此基础上计数耳蜗内毛细胞突触的数量.结果 所有小鼠内外毛细胞均无缺失和错排,但和对照组相比,内毛细胞突触数量存在明显变化(P<0.01);其数量在庆大霉素注射第7天时达到峰值,之后明显减少.结论 在氨基糖甙类药物毒性环境中,耳蜗内毛细胞突触数量表现先增加后下降的规律.这提示在氨基糖甙类药物毒性作用的过程中,内毛细胞突触数量的增加可能表明耳蜗内毛细胞带状突触存在通过改变自身数量来反映氨基糖甙类药物毒性损害的机制.     

长时程低强度噪声暴露对豚鼠内毛细胞带状突触的影响分析

目的 观察日常生活可遇低强度噪声多次暴露对豚鼠耳蜗带状体突触的损失和恢复,以及对听觉功能的影响。 方法 对豚鼠行95 dB声压级白噪声环境下4 h/d暴露,连续暴露7 d,于噪声后1 d、1周、1个月分组行听力学检查,并与对照组动物比较(每组10只),以免疫荧光法双标法对突触前膜Ctbp2和突触后膜PSD95进行标记并计数。 结果 长时程、低强度噪声暴露后听觉脑干诱发电位阈值提高(P<0.05),豚鼠内毛细胞排布、形态、数量均无明显改变,但内毛细胞带状突触数量有明显减少(P<0.05)并有不完全恢复。 结论 “安全剂量”低强度噪声多次暴露后可造成可逆听觉阈值升高,伴随内毛细胞带状体突触的明显减少和不完全恢复。     

C57BL/6J小鼠随年龄增长耳蜗内毛细胞带状突触数量变化的观察

目的探讨C57BL/6J小鼠随年龄增长耳蜗内毛细胞带状突触(ribbon synapses,RS)的数量变化情况。方法分别取2、6、10、12月龄C57BL/6J小鼠耳蜗基底膜(每组5只),应用免疫组织化学染色方法对RS前、后膜进行双重标记,激光共聚焦显微镜下定位成像,并应用三维重建技术对基底膜各段RS的数量进行计数。结果与2月龄小鼠相比较,6月龄C57BL/6J小鼠耳蜗基底膜RS数量减少主要发生在底回,10月龄时各回RS数量均明显减少,12月龄时顶回、中回RS数量继续减少,底回反而有少许增多。结论RS数量减少可能发生在C57BL/6J小鼠老年性聋的早期阶段,探索阻止RS数量减少的治疗措施可能成为早期干预老年性聋的重要途径。     

中-低强度噪声暴露对耳蜗带状突触的影响

哺乳动物耳蜗是编码声音信号的器官,其中外毛细胞(Outer Hair Cells, OHCs)、内毛细胞(Inner Hair Cells, IHCs)与螺旋神经节神经元(Spiral Ganglion Neurons,SGNs)是将声波振动转化成神经信号的三个关键结构,其对声音暴露、耳毒性物质、衰老以及遗传缺陷等因素都很敏感。高强度的噪声暴露可以损伤耳蜗毛细胞等结构进而导致耳聋,最新研究表明,中-低强度噪声暴露可导致暂时性听阈升高,然而这种暴露常常并未引起耳蜗毛细胞的缺失或损伤;进一步的研究则发现内毛细胞和螺旋神经纤维之间的带状突触很容易受到噪声损伤,从而产生不可逆转病变,进而导致各种形式听功能的异常表现。内毛细胞带状突触(Ribbon Synapses)是听觉通路中第一个兴奋性传入突触,该结构对于声音的编码具有决定性作用。不同强度和频率的声刺激会引起带状突触在数量、结构、形态及功能方面发生相应的改变。本文通过对中-低等强度噪声暴露对小鼠耳蜗带状突触的影响以及它所引起的听觉障碍做一简要综述,希望对感音神经性耳聋患者的疾病预防有一定的指导。     

突触内吞关键蛋白Dynamin在小鼠耳蜗内毛细胞中的表达研究

目的研究生理情况下Dynamin各亚型在小鼠耳蜗内毛细胞(IHC)的表达分布特点,为探讨其在毛细胞内可能发挥的生理功能以及与听信号传导的关系做铺垫。方法取成年小鼠耳蜗基底膜行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察Dynamin各亚型表达及定位分布情况。结果 Dynamin各亚型在小鼠耳蜗内毛细胞中均有表达。其中,Dyna-min-1表达于整个内毛细胞内,Dynamin-2点状分布在内毛细胞胞质,Dynamin-3高表达于内毛细胞核下近螺旋神经节区域。结论网格蛋白介导内吞过程是毛细胞内吞作用的重要机制,作为该过程中的关键蛋白,Dynamin各亚型在耳蜗内毛细胞中均有表达,提示Dynamin在内毛细胞中可能发挥着重要的生理功能。     

电离辐射对耳蜗毛细胞超微结构的影响

目的 观察电离辐射对耳蜗毛细胞超微结构的损伤情况.方法 将健康豚鼠15只随机分成二组:单纯放射组(单放组)10只,对照组5只,每组观察10耳.对照组不放射,单放组用直线加速器所产生的6Mev电子线对豚鼠的耳颞部予以分次放射(2 Gy/天),总剂量达到60 Gy,行透射电镜及扫描电镜观察两组豚鼠耳蜗毛细胞的形态学变化.结果 透射电镜观察见对照组耳蜗外毛细胞边界清楚,细胞无肿胀,表皮板完整,线粒体嵴完整,核膜完整;单放组耳蜗外毛细胞边界不清,细胞肿胀变形,线粒体空泡变,线粒体嵴断裂,核膜不完整,异染色质增多.扫描电镜观察见对照组耳蜗外毛细胞的纤毛排列整齐无倒伏、缺失;单放组耳蜗外毛细胞的纤毛明显倒伏、缺失、排列紊乱.结论 分割剂量电离辐射对豚鼠耳颞部放射可造成耳蜗毛细胞超微结构损害.     

噪声引起的耳蜗内毛细胞病变

为进一步搞清正常及病变耳蜗的声音编码,对内毛细胞和外毛细胞及此两种感受器间的关系必须澄清。为此目的,通常有二种研究途径,一是用细胞内微电极记录法;一是选择性感受器破坏法,例如使用噪声或耳毒性药物来破坏外毛细胞。迄今为止,还没有一种能使内毛细胞发生广泛的慢性病变的方法。本文报告一种试使外毛细胞无损而内毛细胞发生严重病变的方法。试验用28只小兔鼠在无麻醉下进行。将动物的一侧外耳道堵塞,免受噪声刺激,留作对照;将另一耳暴露于2～7千赫,115dB声压级的噪声15分钟或30分钟。实验发现,动物的外耳道共振特性为2千赫及4千赫。115dB声压级的噪声,经外耳道共振后,2千赫及4千赫各增加20dB声压级,相当于135dB声压级。另用7只动物10只耳分别以2、4、8及16千赫高声压级的纯音刺激,找出不同频率的纯音造成基底膜损害     

噪声暴露对豚鼠耳蜗内毛细胞谷氨酸样免疫反应的影响

目的：了解噪声暴露对豚鼠耳蜗内毛细胞谷氨酸样免疫反应的影响，探讨噪声暴露引起耳蜗传入神经损伤的谷氨酸兴奋毒机制。方法：采用免疫组织化学方法结合计算机图像分析，观察噪声暴露后不同时间豚鼠耳蜗内毛细胞谷氨酸样免疫反应的改变。结果：在噪声后8小时，豚鼠耳蜗内毛细胞谷氨酸样免疫反应减弱。结论：噪声可引起耳蜗内毛细胞传入神经递质谷氨酸的过度释放，继而对耳蜗传入神经产生兴奋毒损伤，这可能是噪声后耳蜗传入神经损伤的机制之一。     

听神经病与内毛细胞和突触

编者按2007年11月在广州召开的2007年全国听神经病专家论坛上,非常荣幸地邀请了美国加州大学尔湾分校的听觉言语研究实验室主任,神经科学专业的Arnold Starr教授进行了关于听神经病的专题报告.报告的中心内容是介绍近年来国际上对听神经病认识的进展,尤其在内毛细胞、听神经及突触病变所引起听神经病在临床特征及病理机制方面认识的变化与思考.在征求了Starr教授的意见后,摘录了Starr教授报告的主要内容,发表在本刊与国内同行共享.     

丹参注射液对豚鼠耳蜗毛细胞的影响

目的观察丹参注射液对豚鼠庆大霉素耳中毒引起的耳蜗毛细胞酸性磷酸酶变化的影响。方法选用耳廓反射正常,体重250g～300g的健康杂色豚鼠,雌雄不限,随机分成3组,正常对照组15只,肌肉注射生理盐水2ml/(kg·d);庆大霉素组15只,肌肉注射庆大霉寨80mg／(kg·d);丹参注射液组15只,腹腔注射丹参注射液6mg／(kg·d),然后肌肉注射庆大霉素同庆大霉素组。各组动物连续注射药物均20天。用脑干听觉诱发电位(auditory brainstem response audiometry,ABR)检查豚鼠的听阈变化情况;用组织化学方法检测耳蜗毛细胞酸性磷酸酶的变化情况。结果正常对照组、庆大霉素组和丹参注射液组动物的ABR阈值分别为：(34.50±1.22)dB peSPL、(34.25±1.18)dBpeSPL和(34.39±1.27)dB peSPL;用药后第22天,反应阈值分别为：(34.65±1.32)dB peSPL、(71.25±24.73)dB peSPL和(41.05±10.93)dB peSPL。对照组分别与庆大霉素、丹参注射液组比较,差异显著(t=8.097,3.184,P＜0.01);丹参注射液组与庆大霉察组比较,有显著性差异(t=6.118,P＞0.01)。耳蜗铺片光镜下观察毛细胞酸性磷酸酶染色：正常对照组呈棕褐色,显色分布均匀,毛细胞排列整齐;庆大霉素组毛细胞依动物耳聋程度不同而出现不同程度染色缺失,庆大霉素组染色缺失显著,丹参注射液组染色缺失轻,两组比较有明显差异。结论丹参注射液能明显降低庆大霉素的耳毒性;保护耳蜗毛细胞溶酶体的完整性,降低庆大霉素对溶酶体的损坏而造成的毛细胞自溶性损伤,是丹参注射液降低庆大霉索耳毒性的机制之一。     

冲击波对豚鼠耳蜗毛细胞碳酸酐酶的影响

用组织化学、细胞化学方法结合图像分析和听觉电生理技术,研究了冲击波对豚鼠耳蜗毛细胞碳酸酐酶（ＣＡ）的影响及其与听阈阈移的关系。结果表明冲击波后６、１２、２４、４８、７２小时组,毛细胞中ＣＡ阳生产物的灰度值较正常组明显降低,其灰度值的变化与听觉脑干反应（ＡＢＲ）阈移呈负相关。提示毛细胞中ＣＡ活性减低是冲击波致听力损失的因素之一,文中讨论了ＣＡ在耳蜗毛细胞的作用及其与听阈的关系。     

冲击波对豚鼠耳蜗毛细胞碳酸酐酶的影响

用组织化学、细胞化学方法结合图像分析和听觉电生理技术,研究了冲击波对豚鼠耳蜗毛细胞碳酸酐酶（CA）的影响及其与听阈阈移的关系。结果表明冲击波暴露后6、12、24、48、72小时组,毛细胞中CA阳性产物的灰度值较正常组明显降低（P＜0．01）,其灰度值的变化与听觉脑干反应（ABR）阈移呈负相关（r=-0．9369,P＜0．01）。提示毛细胞中CA活性减低是冲击波致听力损失的因素之一。文中讨论了CA在耳蜗毛细胞的作用及其与听阈的关系。     

庆大霉素对内毛细胞带状突触CaVl．3钙离子通道蛋白表达的影响

目的：研究庆大霉素对C57BL／6J小鼠听力及耳蜗内毛细胞带状突触CaVl．3钙通道蛋白数量的影响,探讨听力损失与其剂量相关性变化之间的关系及意义。方法：采用固定剂量[100mg／（kg·d）]的氨基苷类抗生素（庆大霉素）对C57BI。／6J小鼠每日进行腹腔注射造模,分别在注射后的第7天、第14天、第28天（注射14d停药14d）应用ABR分别测得小鼠的听力。免疫荧光方法观察耳蜗基膜内毛细胞带状突触caVl．3钙通道蛋白的分布和表达（其中0天为空白对照组）,内毛细胞突触前后膜分别采用CtbP2和CaVl．3进行免疫荧光标记。结果：随着注射药物天数的增长ABR反应阈值明显提高,所有小鼠内毛细胞数量、形态均无明显变化,但内毛细胞带状突触CaVl．3钙离子通道蛋白量的表达存在显著差异（P〈0．01）。CaVl．3钙离子通道蛋白在庆大霉素腹腔注射CaVl．3／CtBP2表达数量在第7天时略有增加,在第14天时其表达数量明显减少,第28天与第14天比较CaVl．3／CtBP2表达数量有所增加,但低于正常。结论：在氨基苷类抗生素毒性环境中耳蜗内毛细胞CaVl．3蛋白表现为先增加后减少再增加的趋势,提示内毛细胞带状突触CaVl．3蛋白数量的增加可能存在对这类药物毒性的代偿作用,而随着药物毒性作用时间的增加,这种失代偿作用表现为听力下降,可能是损伤听力的机制之一。     

老年大鼠耳蜗毛细胞凋亡的信号通路

目的通过观察耳蜗基底膜毛细胞凋亡相关因子caspase-3、caspase-8和caspase-9表达的变化,揭示老年大鼠耳蜗毛细胞凋亡的信号通路。方法入选Fischer344大鼠27只,青年组12只,3～4月龄;老年组15只,20～27月龄。3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶荧光标记青年大鼠耳蜗各8个,老年大鼠耳蜗各10个。应用电位反应测听仪检测不同频率短纯音(5、10、20和40kHz)诱发的青年和老年大鼠双侧听性脑干诱发电位反应阈值(ABR)。听觉功能测试后,用微量注射器分别将新鲜配制的3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶荧光染色液缓慢注入动物内耳,耳蜗内灌注后1h,动物断头处死。采用细胞核DNA荧光染料碘化丙锭(PI)染色耳蜗基底膜细胞,荧光显微镜下观察不同月龄大鼠耳蜗基底膜毛细胞3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶荧光染色的变化。结果老年大鼠的不同频率听性脑干反应阈值均高于青年对照组(P<0.05)。青年大鼠耳蜗毛细胞核周围未见3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶阳性荧光标记物,老年大鼠耳蜗基底膜以核固缩为特征的凋亡外毛细胞核周围存在caspases-3和caspases-9绿色荧光标记物,未见caspases-8标记物。以核肿胀为特征的坏死外毛细胞核周围未见3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶阳性荧光标记物。结论老年大鼠耳蜗毛细胞凋亡可能通过caspases-9相关的线粒体信号转导通路而不是cas-pases-8相关的死亡受体通路启动完成。     

老年性聋耳蜗带状突触数量在时空上的改变

目的研究年龄相关性听力损失过程中听力阈值变化与耳蜗内毛细胞带状突触标记物数量之间的关系。方法应用C57BL/6J小鼠进行本研究。在本研究中,对鼠龄为1、2、4、6和12个月的C57BL/6J小鼠分别进行ABR阈值检测分析(Click&Tone burst)。对被检测小鼠的耳蜗基底膜标本进行突触前特异蛋白RIBEYE/CtBP2进行免疫荧光标记,采用激光共聚焦观察结合三维重建的方法来计数突触标记物(RIBEYE/CtBP2)的数量并进行统计学分析。结果小鼠的ABR阈值从鼠龄4个月时开始出现显著抬高(P<0.05),以后在鼠龄为6和12个月时抬高更加明显。在频率分布上,这种阈值的抬高在高频区域(8KHz&16KHz)表现的最为明显。同时,本研究发现标记物的数量和ABR阈值的变化呈现一致性的改变:突触标记物数量也在4个月时开始出现减少(P<0.05),且随着鼠龄的增加数量减少更加明显。这种数量减少的表现在高频区域(8KHz&16KHz)表现得尤为显著(P<0.01)。在听力减退的早期阶段(鼠龄4-6个月),小鼠毛细胞,尤其是内毛细胞数量并未现明显的减少。结论老年性听力损失和耳蜗带状突触的数量改变密切相关,突触数量的减少可能是导致年龄相关性听力损失的一个重要因素。     

大鼠耳蜗毛细胞前体细胞与耳蜗间质细胞共培养的实验研究

目的探讨耳蜗间质细胞对耳蜗毛细胞前体细胞--大上皮嵴（greater epithelial ridge,GER）细胞的诱导分化作用。方法取出生后第1天大鼠20只,随机分为2组,每组各10只,利用酶消化和机械分离相结合的方法分别分离出纯耳蜗GER细胞和耳蜗间质细胞,并进行体外混合培养及形态学的观测,对共培养10天的标本行抗Calretinin（标记幼稚毛细胞）及抗p27抗体（标记支持细胞）的免疫细胞组织化学染色鉴定。结果混合培养的耳蜗GER细胞和间质细胞易形成片状细胞岛,共培养10天后,有部分细胞表达Calretinin,亦有少数细胞表达p27,但无Calretinin及p27双标记者。结论GER细胞与耳蜗间质细胞共培养,可以诱导GER细胞分化为毛细胞及支持细胞表型。     

非聚焦超声对豚鼠耳蜗毛细胞的影响

为探讨超声（Ultrasound，FU）对豚鼠耳蜗毛细胞的影响，分别以2．5MHz、8MHz非聚焦超声（NFU）照射豚鼠耳蜗3h、6h，于30min后行耳蜗毛细胞组织学及酶组织化学观察。发现照射6h组在基底膜第2周起始段0．87±0．20mm节段及基底周起始段0．80±0．20mm节段，耳蜗毛细胞琥珀酸脱氢酶（SDH）活性降低，乳酸脱氢酶（LDH）活性升高。提示：2．5MHz、8MHzNFU照射豚鼠耳蜗达一定剂量能引起不同部位耳蜗毛细胞有氧代谢改变。