蛋白激酶C对鼻咽癌CNE-2Z细胞端粒酶活性的影响

为进一步探讨蛋白激酶C（PKC）调控入低分化鼻咽癌CNE－2Z细胞生长的机制，观察了PKC对CNE－2Z酶粒酶活性的影响。结果显示：CNE－2Z细胞有较高的端粒酶活性；PKC的抑制剂Staurosporine显著降低细胞端粒酶活性（P＜0．001）。提示抑制PKC可以抑制CNE－2Z细胞的端粒酶活性，PKC可通过调控端粒酶活性从而影响CNE－2Z细胞的生长。     

Macrophage migration inhibitory factor enhances neoplastic cell invasion by inducing the expression of matrix metalloproteinase 9 and interleukin-8 in nasopharyngeal carcinoma cell lines

Background Nasopharyngeal carcinoma (NPC) shows highly invasive and metastatic features. This study aims to investigate macrophage migration inhibitory factor (MIF)-induced invasion of NPC cells in vitro and the effects on matrix metalloproteinases (MMPs) and interleukin-8 (IL-8), and to study the mechanism of tumor cell invasion and metastasis in the early stage of NPC. Methods Two nasopharyngeal carcinoma cell lines, CNE-1 and CNE-2, were adopted in this study. The NPC cell invasion and migration were evaluated by microinvasion assay. The variation of expression percentages of MMP2- or MMP9-positive cells was detected by flow cytometry in two cell lines with or without MIF treatment. Western blotting and RT-PCR were used to assay the protein and mRNA expressions of MMP2 and MMP9. The IL-8 concentration secreted by NPC cells was compared with the cells with different treatments using ELISA. Results After treating with MIF for 48 hours, the cell numbers of CNE-1 and CNE-2 which went through the 8-μm filter membrane were increased. Compared with non-MIF treated NPC cells, significant difference could be found both in CNE-1(P=0.005) and CNE-2 cells (P=0.001) . The percentages of MMP9-positive cells were significantly increased in both CNE-1 ［from （28.5±2.5）% to （82.4±3.5）%, P=0.001］ and CNE-2 ［from （32.8±3.5）% to （86.1±1.6）%, P=0.002］. The relative intensity of MMP9 protein expression was also enhanced in both cell lines (CNE-1: from 83.1±6.0 to 242.9±22.9, P=0.002; CNE-2: from 84.4±4.3 to 278.9±29.7, P=0.003). Correspondingly, the increased MMP9 mRNA expression level was significantly detectable in both cell lines.The concentration of IL-8 in the supernatant of CNE-2 was higher ［(1201.8±593.3） pg/ml］ after treatment. It was also remarkably higher than that in the supernatant of CNE-2 without treatment (P=0.026). However, there was no significant difference in the concentration variation of IL-8 in CNE-1 (P=0.581), while the IL-8 mRNA level was only enhanced in CNE-2. Conclusions MIF can induce potent invasion of NPC cell lines in vitro, and the infiltrating lymphocytes in NPC might be responsible for the invasion and metastasis of tumor cells. MIF cytokine which is secreted by these infiltrating lymphocytes might contribute to the invasion as well as metastasis of NPC in the early stages by induction of MMP9 and IL-8 in an indirect pathway.     

DNA pol β,Ku80与鼻咽癌放射敏感性的关系

目的:研究人鼻咽癌细胞系CNE-2Z亚克隆株F1、S1放射后DNA修复相关基因DNA pol β和Ku80的表达,探讨CNE-2Z存在放射敏感性异质性的可能机理。方法:裸鼠体内移植瘤实验观察F1、S1放射后的体内增殖能力,采用Western blot、免疫细胞化学和免疫组织化学方法检测放射后F1和S1 DNA修复相关蛋白(DNA pol β、Ku80)的表达,Feulgen染色法和图像分析方法检测放射后F1、S1裸鼠体内移植瘤的DNA倍体及细胞周期分布情况。结果:未照射前F1细胞DNA pol β和Ku80的表达高于S1;放射后S1细胞DNA pol β及Ku80表达上调的时间较F1早,上调辐度大于F1。鼻咽癌细胞系CNE-2Z确实存在放射敏感性的异质性,放射后S1体内增殖能力大于F1,较多细胞处于有利于DNA修复的G2/M期(P<0.01)。放射后F1、S1裸鼠移植瘤细胞和组织中,DNA pol β和Ku80蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:本实验进一步证实了鼻咽癌细胞系CNE-2Z确实存在放射敏感性的异质性,F1、S1放射敏感性的差异与两株细胞的DNA修复相关基因(DNA pol β、Ku80)的表达差异所致的DNA SSB、DSB修复的速度和忠实性有关。     

肿瘤坏死因子的细胞同步化作用对鼻咽癌放射敏感性的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子(TNFα)使细胞周期同步化对增加鼻咽癌的放射敏感性的影响.方法 用体内实验证实鼻咽癌细胞系中确实存在放射抵抗亚克隆株,然后用流式细胞仪检测TNFα对CNE-2Z-S1细胞周期同步化的作用,应用克隆形成实验及裸鼠实验,于体外体内测定经细胞周期同步化后S1细胞对射线的敏感性.结果 (1)CNE-2Z细胞群中确实存在着放射抵抗的亚群.(2)TNFα能阻滞CNE-2Z-S1细胞周期,达到细胞周期同步化的作用.(3)体外研究证实经TNFα预处理可使CNE-2Z-S1细胞对放射的敏感性显著提高.(4)体内研究提示TNFα有可能提高CNE-2Z-S1细胞对放射的敏感性.结论 TNFα可通过促进CNE-2Z-S1细胞周期同步化进而增加放射敏感性.     

Point mutation of 2.8 kb EcoRI fragment of the NPC transforming gene in NPC cell lines

Ｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｏｆ２．８ｋｂＥｃｏＲＩｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｔｈｅＮＰＣｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｅｎｅｉｎＮＰＣｃｅｌｌｉｎｅｓＤｅｎｇＸｉｙｕｎ邓锡云，ＣａｏＹａ曹亚，ＣａｏＬｉ曹莉，ＬｅｏＭＬｅｅ黎民敬ａｎｄＹａｏＫａｉｔａｉ姚开泰Ｏ...     

姜黄素对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨姜黄素对人鼻咽癌(NPC)CNE-2细胞增殖及凋亡的影响.方法 不同浓度(0、10、20、40、60 μmol/L)姜黄素处理NPC细胞株CNE-2,利用噻唑蓝(MTT)实验检测CNE-2细胞增殖活性,利用流式细胞仪检测CNE-2细胞周期及凋亡率,利用Hoechest33258荧光染色法观察细胞凋亡情况.结果 姜黄素可明显抑制CNE-2细胞增殖作用,且随姜黄素浓度增加,CNE-2细胞抑制率呈上升趋势(P＜0.05),姜黄素作用CNE-2细胞24、48、72 h的半抑制浓度(IC50)分别为(23.54±0.36)、(18.31±0.42)、(8.56±0.37)μmol/L,即姜黄素可明显抑制CNE-2细胞增殖作用,且呈现明显浓度、时间依赖性;流式细胞检测结果显示,0、10、20、40、60 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞,凋亡率随着姜黄素浓度增加而上升;荧光染色结果可见,CNE-2细胞未给予姜黄素处理,细胞呈圆形或者椭圆形,细胞核大小均匀一致,染色质分布均匀的淡蓝色荧光;10 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞24h后,细胞胞体缩小,细胞核染色质凝聚,呈颗粒状亮蓝色荧光;20 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞24 h后,细胞出现胞体缩小,细胞核浓缩、染色质不均匀,出现凋亡小体,甚至出现核碎裂;40和60 μmol/L姜黄素处理CNE-2细胞24 h后,细胞凋亡小体数量增多,出现大量核碎裂.结论 姜黄素对NPC细胞株CNE-2细胞增殖具有明显抑制作用,且促进CNE-2细胞凋亡.     

放射敏感性、X线辐射剂量对鼻咽癌细胞miR-7表达的影响

目的 探讨放射敏感性、X线辐射剂量对鼻咽癌细胞miR-7表达的影响.方法 以低放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE-1、高放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE-2为研究对象,采用析因设计的方法,分别给予CHE-1、CNE-2假照(0 Gy)、低剂量照射(2Gy)、高剂量照射(8Gy).Trizol法提取总RNA,设计特异性茎环引物逆转录miR-7,随机六引物逆转录18 s rRNA,所得cDNA进行染料法荧光定量PCR,以0 Gy照射的CNE-1细胞为参照样本,△△Ct法计算各组细胞miR-7的相对表达值,SPSS13.0行析因设计资料方差分析.结果 CNE-1和CNE-2的miR-7表达量有显著差异(F=135.483,P<0.001),CNE-1的miR-7表达量(x=4.49±3.62)高于CNE-2(x=1.29±1.10),不同剂量照射后,鼻咽癌细胞株miR-7表达量也有显著性差异(F=39.565,P<0.001),CNE-1接受2 Gy X线照射后miR-7表达最高,8 Gy照射组次之,0Gy照射组最低.CNE-2接受2GyX线照射后miR-7表达最低,8Gy照射组次之,0Gy照射组最高.结论 放射敏感性不同导致细胞受X线辐射后,miR-7表达调整方向不同,即低放射敏感细胞上调,而高放射敏感性细胞下调;X线辐射剂量将影响miR-7的表达调整幅度,即低剂量照射后miR-7调整幅度大,高剂量照射后调整幅度小.抑制miR-7表达可能会提高鼻咽癌细胞的放射敏感性.     

鼻咽癌细胞株CNE-2及其亚克隆S-18裸鼠皮下移植生长速度比较

目的 研究鼻咽癌细胞株CNE-2及其亚克隆S-18在体内的生长速度差异及其可能机制.方法 体外培养CNE-2和S-18细胞,以6×105细胞/只移植到裸鼠背部皮下,移植后3、7、10、14 d观测肿瘤大小;移植后第14天处死小鼠,称取肿瘤重量并检测肿瘤组织内的HSP27和NF-ΚB转录水平.结果 (1)裸鼠皮下移植后7 d,S-18已明显成瘤,CNE-2尚未成瘤;移植后10 d和14 d,2种细胞均明显成瘤,但S-18肿瘤体积[(223.13±21.32)mm3,10 d;(420.25±24.52)mm3,14 d]明显大于CNE-2肿瘤体积[(113.70±11.70)mm3,10 d;(279.86±25.78)mm3,14 d],P<0.05;移植后14 d S-18所形成的肿瘤的重量(0.521±0.137)g明显高于CNE-2所形成的肿瘤重量(0.449±0.125)g,P<0.05;(2)S-18肿瘤内的HSP27、NF-ΚB的转录水平明显高于CNE-2肿瘤,P<0.05.结论 鼻咽癌细胞株S-18在体内的生长速度明显快于CNE-2细胞,HSP27和NF-ΚB可能参与了鼻咽癌细胞生长速度的调节.     

鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2(R743)的建立及其差异表达蛋白的初步分析

目的 建立放射抗拒的人鼻咽癌(NPC)细胞株,探讨NPC细胞的放射抗拒机制.方法 应用X射线反复照射NPC CNE-2细胞,总剂量为51 Gy,筛选出放射抗拒的细胞株CNE-2(R743).采用克隆形成实验测定细胞的放射敏感性,流式细胞术检测细胞周期特征;采用双向凝胶电泳结合质谱分析法鉴定差异表达蛋白.结果 与CNE-...     

莱菔硫烷对鼻咽癌RASSF1A基因甲基化及表达的影响

目的探讨莱菔硫烷（SFN）对鼻咽癌CNE-2细胞RASSF1A甲基化及蛋白表达水平的影响。方法体外培养鼻咽癌CNE-2细胞,用0,5、10、30μM的SFN与其孵育24～96h,用MTT法检测细胞的增值情况;流式细胞术分析细胞周期的改变;采用甲基化特异性PCR检测RASSF1A基因启动子区域的甲基化改变情况;提取SFN处理后细胞的RNA,用逆转录PCR检测RASSF1A的表达水平,并用Western blot检测处理前后RASSF1A蛋白的表达。结果 SFN能以时间和剂量依赖性方式抑制CNE-2细胞增值,并能使细胞周期阻滞于S期和G2/M期。随着SNF浓度的增加,甲基化RASSF1A水平逐渐减弱,非甲基化RASSF1A水平逐渐增多。同时SFN能明显上调RASSF1A的mRNA和蛋白表达水平。结论 SFN能使RASSF1A基因去甲基化,并上调非甲基化基因的表达水平,从而抑制细胞的增值和分化而具有抗肿瘤的效应。     

PRMT1通过促进RRM2表达抑制鼻咽癌细胞凋亡

目的 探讨PRMT1能否通过促进RRM2抑制鼻咽癌细胞凋亡。方法 免疫组化和Western blot共同检测鼻咽癌和癌旁组织中PRMT1及RRM2的相对表达量;以人正常鼻黏膜上皮细胞系（HNEpC）作为对照,Western blot实验检测不同鼻咽癌细胞系中PRMT1和RRM2蛋白的相对表达量;对CNE-2细胞中PRMT1分别进行过表达和下调,过表达实验设阴性对照组（oe NC:CNE-2细胞中转染pcDNA3.1质粒）、过表达PRMT1组（oe PRMT1:CNE-2细胞中转染pcDNA3.1 PRMT1质粒）、下调实验设阴性对照组（si-NC:CNE-2细胞中转染NC无关序列）及PRMT1小干涉RNA组（si-PRMT1:CNE-2细胞中转染PRMT1小干涉RNA）,对CNE-2细胞中RRM2分别进行过表达和下调,过表达实验设阴性对照组（oe NC:CNE-2细胞中转染pcDNA3.1质粒）、过表达RRM2组（oe RRM2:CNE-2细胞中转染pcDNA3.1 RRM2质粒）、下调实验设阴性对照组（si-NC:CNE-2细胞中转染NC无关序列）及RRM2小干涉RNA组（si-RR...     

早期鼻咽癌基因甲基化谱的初步构建

摘 要: 【目的】 分析早期鼻咽癌的基因甲基化状态,初步构建早期鼻咽癌的基因甲基化谱?【方法】 收集I期(T1N0M0)鼻咽癌石蜡标本及炎性增生性鼻咽组织各4例,分别提取DNA,富集两组样品基因组甲基化片段后采用甲基化芯片(NimbleGen)对两组标本进行高通量测序分析,对杂交信号进行扫描及初步数据处理,分析并筛选出两组标本的差异甲基化基因?【结果】 4例鼻咽癌石蜡标本中均出现甲基化的基因数目为1 134个,而4例炎性增生性鼻咽组织中均出现甲基化的基因有2 091个,4例鼻咽癌标本全部发生甲基化但4例炎性增生性鼻咽组织全未发生甲基化的基因有218个,提示此218个基因可能为早期鼻咽癌患者的甲基化基因谱?另外,4例鼻咽癌标本全未发生甲基化而4例炎性增生性鼻咽组织全部发生甲基化的基因数目为1 558个?【结论】 本研究初步构建了早期鼻咽癌的基因甲基化谱,为进一步建立更为精确的甲基化谱奠定了基础,同时也为寻找鼻咽癌新的分子标志物提供了可能?     

一种新型基因传输载体-磷酸钙纳米颗粒用于肿瘤基因治疗的研究

目的研究新型非病毒栽体磷酸钙纳米颗粒的生物学特性，评估其在肿瘤基因治疗中应用的前景。方法化学方法制备，氯化钙修饰纳米颗粒，用琼脂糖凝胶电泳分析磷酸钙纳米颗粒与DNA的结合效率及对DNA的保护作用，用绿色荧光蛋白基因作报告基因，将磷酸钙纳米颗粒为基因栽体转染鼻咽癌（CNE-2）细胞和在动物体内转染肿瘤细胞；以及将磷酸钙纳米与自杀基因yCDglyTK结合，并在体外对鼻咽癌进行基因治疗。结果电镜观察证实磷酸钙纳米颗粒进入细胞内，磷酸钙纳米颗粒与DNA结合后，能对DNA起保护作用；磷酸钙纳米颗粒作为基因转染的栽体，将绿色荧光蛋白基因导入CNE-2细胞，用荧光显微镜观察到高水平的绿色荧光蛋白表达；体内转染结果显示，纳米介导的基因在肿瘤组织中有很好的表达：以磷酸钙纳米为栽体介导自杀基因yCDglyTK在体外治疗鼻咽癌的实验中显示，在加入5-FC后大量的CNE-2细胞出现死亡。结论磷酸钙纳米颗粒具有优良的生物学特性。是有应用前景的基因转染和基因治疗栽体之一。     

AKT抑制剂E20诱导鼻咽癌细胞凋亡和自噬

目的：通过细胞实验探讨一种新的AKT抑制剂E20对人类CNE-2细胞的抗肿瘤效应及其内在的调节机制。方法：CCK8法检测E20处理后CNE-2细胞的活性;流式细胞术检测细胞凋亡;Mito-SOX流式数据分析检测线粒体ROS水平的变化;Western blot检测E20处理后细胞凋亡相关蛋白（AIF和Bcl-2）和自噬相关蛋白（LC3B-I、LC3B-II和P62）表达的变化;透射电子显微镜观察细胞线粒体超微结构和自噬小体的变化。结果：E20显著抑制CNE-2细胞增殖,促进其凋亡,且呈时间剂量依赖性（P<0.05）;E20处理后CNE-2细胞线粒体ROS水平显著升高,细胞凋亡蛋白AIF显著升高,抗凋亡蛋白Bcl-2显著降低,自噬相关蛋白LC3B-II显著升高、P62显著降低（均P<0.05）;透射电镜发现E20处理后的细胞线粒体受损,自噬小体增多。结论：E20可以通过线粒体途径诱导细胞凋亡,同时可能激活其自噬来抑制鼻咽癌细胞的增殖,为鼻咽癌的治疗提供了一种潜在的化疗策略。     

鼻咽癌细胞株中乳腺癌转移抑制基因表达的研究

目的:检测乳腺癌转移抑制(BRMS1)基因在不同转移习性的人鼻咽癌细胞株中的表达情况。方法:应用免疫组织化学法和逆转录聚合酶链式反应法在mRNA和蛋白2方面检测人鼻咽癌细胞株高分化磷癌、低分化磷癌、低分化细胞株、高成瘤高转移性细胞株、低成瘤低转移性细胞株中BRMS1的表达。结果:5种细胞株中BRMS1的蛋白表达皆为阳性,在不同转移习性的细胞株中其表达强度明显不同。4种细胞株中扩增出BRMS1 mRNA,而BRMS1 mRNA在高转移性细胞株中未扩增出,高分化鳞癌、低分化鳞癌、低分化细胞株BRMS1mRNA表达水平均显著高于低成瘤低转移性细胞株(P<0.01)。结论:BRMS1的表达与细胞株的转移能力有明显相关性,表明BRMS1可能作为鼻咽癌细胞转移的重要指标。     

EB病毒体外感染NPC病人及IgA/VCA~+者的PBMC上清的作用

本文用EB病毒体外感染鼻咽癌病人,IgA/VCA~+,IgA/VCA~-者和新生儿的外周血单个核细胞,观察其上清对CNE-2Z和Raji细胞生长的影响。结果表明,鼻咽癌病人对CNE-2Z有明显抑制作用,生长指数为0.67～0.74,IgA/VCA阳性者和阴性者对CNE-2Z无明显作用。上述感染组对Raji细胞则均有抑制作用,生长指数为0.49～0.69。未经EBV诱导的5天上清对Raji细胞生长呈促进作用。生长指数为1.31～1.44,但对CNE-2Z细胞无明显作用。经EBV和未经EBV感染的新生儿对两种细胞均呈促进生长的作用。     

血管内皮生长因子受体-2(KDR)在鼻咽癌细胞系(CNE-2)中表达的研究

目的了解KDR是否特异性表达于鼻咽癌组织微血管,为研究特异性杀伤鼻咽癌微血管的自杀基因治疗系统提供启动子。方法通过以人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)为对照组,采用细胞免疫组化染色方法鉴定细胞系CNE-2的KDR表达。结果结果显示KDR在HUVEC细胞系中表达,而鼻咽癌细胞系CNE-2中不表达KDR。结论KDR可作为启动子用应用于特异性杀伤鼻咽癌微血管的自杀基因治疗系统的研究。     

鼻咽癌细胞系抗失巢凋亡特性的研究

目的：探讨鼻咽癌细胞系的抗失巢凋亡特性。方法：采用鼻咽癌细胞系CNE2、C666—1、TW03以及正常鼻咽上皮细胞系NP69作为正常对照,用软琼脂实验、悬浮培养等方法诱导失巢凋亡,并用AnnexinV—PI双染色流式细胞计观察凋亡情况。结果：鼻咽癌细胞株CNE-2、C666—1、TW03均具有抵抗失巢凋亡的特性。3种鼻咽癌细胞均能在软琼脂上形成集落,并在培养24h后即可出现,1周内形成的集落速度较快。悬浮培养的鼻咽癌细胞同样出现细胞集落,而NP69细胞未见细胞集落出现。悬浮培养的鼻咽癌细胞在培养48h后凋亡率并没有升高。而NP69细胞则出现了凋亡。结论：鼻咽癌细胞系CNE-2、C666—1、TW03均具有抵抗失巢凋亡的特性。     

小檗碱对人鼻咽癌CNE-2细胞端粒酶活性的影响

目的:观察小檗碱(Berberine)对人鼻咽癌CNE-2细胞端粒酶活性的影响。方法:不同浓度的小檗碱处理体外培养的人鼻咽癌CNE-2细胞72 h,聚合酶链反应-端粒重复扩增(PCR-TRAP)法测定端粒酶活性,噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制。结果:小檗碱可抑制CNE-2细胞端粒酶活性,随小檗碱浓度增大,端粒酶活性抑制增强。MTT结果显示小檗碱抑制CNE-2细胞增殖且抑制有浓度依赖性。结论:端粒酶活性的抑制可能是小檗碱发挥抗癌活性的作用机制之一,小蘖碱作为鼻咽癌的辅助治疗可能提高疗效。     

A study on apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cell line induced by Tanshinone II A and its molecular mechanism]

OBJECTIVE: To assess effect of Tanshinone II A on the apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line CNE-1 and inquire into the mechanism there in involved. METHODS: The CNE-1 cells cultured in vitro were treated with 0.5 microgram/ml Tanshinone II A for 4 days. The morphology of the cells was observed by microscopy. The cell growth and proliferation were measured by cell counting. The DNA break was examined by gel electrophoresis. The cell cycle, apoptosis index (AI) and the expression of apoptosis associated gene were analysed by flow cytometry. RESULTS: 0.5 microgram/ml Tanshinone II A could induce the apoptosis of CNE-1 cells. In the treatment group, the morphologic characteristics of apoptotic cells were observed, the DNA of cells presented "ladder" break, the cell growth and proliferation were inhibited obviously, and the AI was 16.9% (the AI of control group was 6.4%). The cells were arrested in G0/G1 phase and cellular DNA synthesis was inhibited. The expressions of apoptosis associated gene fas, bax, p53 and p21 were up-regulated; the expression of bcl-2 was down-regulated. CONCLUSION: Tanshinone II A can induce apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cells. Its molecular mechanism may relate to modulation of the apoptosis associated gene expression.