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1.
本实验分别用两种融合表达载体(pGEX-2T及pDS-6H)在大肠杆菌XL1-Blue中表达人促红细胞生成素(h-EPO)。结果发现,虽然h-EPO基因中大肠杆菌使用频率为0%或1%的密码子占密码子总量的14.3%,但实验中却取得了较高的蛋白表达量。pGEX-2T和pDS-6H中表达的融合蛋白(分子量:44400和23800)分别占细菌总蛋白的29.7%和17.5%。从而提示,一个基因中的密码子使用频率与翻译延长速率之间可能不是一种简单的对应关系。表达载体pGEX-2T中5'融合基因长度达1300bp,而pDS-6H中仅为36bp,而pDS-6H但两者表达水平却无显著差异,因此作为翻译起始限制因素的翻译起始区的ATG下游顺序仅需长约36个核苷酸。 相似文献
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血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:用大肠杆菌融合蛋白表达载体pMAL-c2构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒pMAL-TOPM,方法:采用基因重组和表达,SDS-聚丙烯酰胺胶电泳和蛋白纯化技术。结果:SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导5h后大肠杆菌JM109表达到最高水平,约占大肠杆菌菌体总体蛋白的36.6%,除了大肠杆菌RR1不表达以外,大肠杆菌DH5αH101均有较高水平的表达,表达产物血小板生成素突变体融合蛋 相似文献
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为在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原(SAG1),进一步研究其生物学功能。将SAG1基因重组于pGEMEX-1融合型表达载体上,转化大肠杆菌JM109(DE3),得到含重组表达质粒pGEMEX-1/SAG1的工程菌。结果表明IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE和Western-blot检测证实含有SAG1蛋白。提示pGEMEX-1大肠杆菌系统可以表达具有免疫活性的SAG1蛋白。 相似文献
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为在大肠菌中表达弓形虫主要表面抗原(SAG1),进一步研究其生物学功能。将SAG1基因重组于pGEMEX-1事例型表达载体上,转化大肠杆菌JM109(DE3),得到含重组表达质粒pGEMEX-1/SAG1的工程菌。结果表明IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE和Western-blot检测证实含有SAG1蛋白。提示pGEMEX-1大肠杆菌系统可以表达具有免疫活性的SAG1蛋白。 相似文献
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高密度培养大肠杆菌TG1/pGEX-hCT和高表达重组人降钙素 总被引:6,自引:0,他引:6
目的:高密度、高表达培养重组大肠杆菌TG1/pGEX-hCT,生长重组人降钙素(rhCT)。方法与结果:应用NBS BioFlo3000型5L自控发酵罐,采用分批培养和补料分批培养相结合的培养技术,控制碳源和氮源的补加,控制溶解氧,使重组菌E.coti TG1/pGEX hCT发酵光密度(D(600))达到58.6,人降钙素和GST融合蛋白(GST-hCT)的含量达到3.2g/L。结论:本研究为工 相似文献
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目的:利用含强启动子的融合表达载体pGEX-2T对编码人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的基因进行高效表达。方法:基因重组技术及蛋白纯化技术。结果:SDS-PAGE显示表达产物占菌体蛋白的50%。Western Blot检测表明,表达产物可与抗MCP-1抗体特异反应。 相似文献
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目的:通过融合蛋白表达方式将编码人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)cDNA在大肠杆菌DH5a中的表达,为bFGF进一步研究提供材料来源,方法:用多聚酶链反应(PCR)及DNA重组技术将PCR产物克隆到pGEM-5Z载体并测序,然后克隆到表达载体pXH上。结果:转化重组质粒pLX1的大肠杆菌经42℃温控诱导4 ̄5h,SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约35000,薄层扫描分析表明该蛋白占菌体 相似文献
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人骨形成蛋白2碳端肽在大肠杆菌中的高表达及活性测定 总被引:4,自引:2,他引:4
利用基因工程技术生产人骨形成蛋白(hBMP),为其诱骨机理及临床应用研究提供前提条件。作将hBMP2 cDNA3’端732bp片段,克隆入大肠杆菌表达载体pGEX-2T,经IPTG诱导后,表达产物存在于包涵体中,将其纯化复性后,进行SDS-PAGE和FPLC分析,并作小鼠体内异位诱骨活性检测。表达的hBMP2与GST的融合蛋白Mr=51ku,占菌体总蛋白的30%,纯化、复性后,FPLC分析示尖而 相似文献
11.
人黑色素瘤单抗VH—TNF融合蛋白基因的构建和表达 总被引:2,自引:0,他引:2
在大肠杆菌中表达人黑色素瘤单抗VH-TNF融合蛋白基因。方法;在人肿瘤坏死因子基因上游插入了抗黑色素瘤单抗Mel3的重链可变区基因,将此融合基因插入大肠杆菌表达系统pGEX-2T的GST基因下游,IPTG诱导表达,表达产物经凝血酶消化后,测定其对L929细胞的杀伤活性,并进行SDS-PAGE,用抗TNF抗体进行蛋白印迹分析。 相似文献
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目的:利用含强启动子的融合表达载体pGEX-2T对编码人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的基因进行高效表达。方法:基因重组技术及蛋白纯化技术。结果:SDS-PAGE显示表达产物占菌体蛋白的50% 。Western Blot检测表明,表达产物可与抗MCP-1 抗体特异反应。生物学活性测定结果表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性。结论:融合蛋白对MCP-1 趋化活性无影响 相似文献
13.
目的:利用DNA重组技术在大肠杆菌中融合表达水蛭素基因。方法:将水蛭素变体1的基因HV1克隆到pEZZ318表达载体,转化E.coliJM109菌株,IPTG诱导表达,培养上清液经SDS-PAGE凝胶电泳检测,hIgG-agarose亲和层析纯化。结果:表达的融合蛋白相对分子质量为20kD,表达上清的抗凝血酶活力为47ATU(AntithrombinUnit)/ml。结论:在大肠杆菌中表达的水蛭素融合蛋白对凝血酶的凝血功能具有显著的抑制作用 相似文献
14.
研究了百日咳杆菌毒素S1亚单位与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白(GST-S1)在大肠杆菌(E.coli)中的表达,并一步纯化了重组GST-S1。首先用聚合酶链反应(PCR)扩增出长度为560bp的编码百日咳毒素S1亚单位的DNA片段。该片段比原编码S1蛋白的DNA片段在其3′端缺失了138个碱基,将其按正确的阅读框克隆入质粒pGEX中GST基因的3′端,构成GST-S1融合基因表达载体pGEX-S1。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),可见所表达的GST-S1融合蛋白存在于细菌上清,为可溶性蛋白。分子量为49ku处有明显的蛋白表达带。用谷胱甘肽(GSH)亲和层析系统,一步纯化出GST-S1融合蛋白。最后经凝血酶的消化,得到23ku的重组百日咳杆菌毒素S1亚单位蛋白。为百日咳疫苗的发展提供了依据 相似文献
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目的:通过融合蛋白表达方式将编码人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)cDNA在大肠杆菌DH5α中的表达,为bFGF进一步研究提供材料来源。方法:用多聚酶链反应(PCR)及DNA重组技术将PCR产物克隆到pGEM-5Z载体并测序,然后克隆到表达载体pXH上。结果:转化重组质粒pLX1的大肠杆菌经42℃温控诱导45h,SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约35000,薄层扫描分析表明该蛋白占菌体总蛋白量的99%。经FactorXa酶切后得到分子量约为17000的bFGF,其生物学活性ED50为229ng/ml。结论:经PCR方法扩增的bFGF可在大肠杆菌中高效表达,为其进一步结构与功能研究打下基础 相似文献
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目的:用大肠杆菌融合蛋白表达载体pGEX-2T构建人单核细胞趋化蛋白-1融合表达质粒PGT-MCP-1,方法:采用PCR技术和DNA重组技术,结果:将编码人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因克隆至融合表达载体PGEX-2T ,DNA测序证实正确。结论:获得融合表达的质粒PGT-MCP-1,为进一步研究MCP-1的同效表达奠定了基础。 相似文献
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目的:使重组人促红细胞生成素(rhEPO)在CHO细胞中获得高效表达。方法:利用基因重组构建了两个人促红细胞生成素cDNA重组表达质粒pED-EPO和pEF-EPO,分别用DEAE-dextran法转染COS7细胞,作瞬时高表达,选pEF-EPO用磷酸钙共沉淀法转染CHO-dhfr-细胞,加入氨甲喋呤(MTX)扩增、选择,作稳定性高表达。结果:pED-EPO和pEF-EPO转染COS7细胞后72h表达量分别为17.8和21.0ng/ml,pEF-EPO转染CHO-dhfr-细胞,随着MTX浓度的增加,CHO-dhfr+的克隆数减少,而混合克隆的EPO表达量逐渐升高。筛选了一株稳定性高表达rhEPO的细胞株,其3d表达量为16μg/ml。结论:rhEPO在CHO细胞中获得了高表达 相似文献
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饰胶蛋白(Decorin)基因的cDNA克隆与表达 总被引:5,自引:0,他引:5
目的 通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因cDNA克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法 应用PCR技术从T细胞cDNA文库获得饰胶蛋白全长基因cDNA片段。并克隆到pUC19载体中,采用Sanger双脱氧末端终止法测定全部cDNA序列,将测序正确的饰胶蛋白cDNA序列插入pGEX-4T-1表达载体中,经BamHI和EcoRI双酶切后1.2%凝胶电泳鉴定,IPTG诱导表达产物经SDS-PAGE分析。结果 克隆的饰胶蛋白cDNA序列与GenBank中AF138300记载的序列完全一致,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值(65.6KD)也一致并为可溶性蛋白。结论 本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了GST-Decorin融合蛋白。 相似文献
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人脑髓鞘碱性蛋白基因cDNA在大肠杆菌中表达的初步研究 总被引:4,自引:1,他引:4
将BamHI酶切的人脑髓鞘碱性蛋白(MBP)基因cDNA克隆片段和表达载体pGEX5T重组后转化大肠杆菌,再筛选、趱IPTG诱导,结果显示:阳性克隆10%SDS-PAGE有2条特异区带(49kd和35kd),Western印迹杂交证实文具区带具MBP抗原特异性,蛋白质含量测定、免疫斑点杂交和ELISA分析,该膜蛋白表达量占菌体裂液蛋白质总量6%(50mg/L菌液)。 相似文献
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将BamHⅠ酶切的人脑髓鞘碱性蛋白(MBP)基因cDNA克隆片段和表达载体pGEX-5T重组后转化大肠杆菌,再筛选、增殖和IPTG诱导。结果显示:阳性克隆10%SDS-PAGE有2条特异区带(49kd和35kd);Western印迹杂交证实该区带具MBP抗原特异性;蛋白质含量测定、免疫斑点杂交和ELISA分析,该膜蛋白表达量占菌体裂解液蛋白质总量6%(50mg/L菌液)。 相似文献