EDC交联结合化学萃取制备脱细胞脊髓支架及其生物学特性研究

[目的]采用EDC(碳化二亚胺)交联结合化学萃取法制备脱细胞脊髓支架,探讨脱细胞脊髓支架制备效率,分析支架的生物学特性,观察支架能否保留细胞外基质黏多糖成分。[方法]采用EDC交联结合化学萃取法(液氮结合42℃恒温水浴反复冻融6次+1%Triton X-100+1%脱氧胆酸钠+EDC交联+液氮结合42℃恒温水浴反复冻融6次+1%Triton X-100+1%脱氧胆酸钠)处理正常脊髓20根,得到脱细胞脊髓支架(支架组);对照于正常大鼠脊髓组织(对照组)。通过HE染色检验支架组脱细胞效果,统计脱细胞脊髓支架的等级评分"优"、"良"、"一般"、"差"的百分比;选取HE染色脱细胞彻底、评分为"优"的脊髓支架,DAPI染色验证其内部细胞残留情况的等级评分是否一致为"优";通过电镜扫描观察两组内部三维结构并分析其孔径;分析脊髓组织脱细胞处理前后的含水率、孔隙率、抗酶解性的变化;通过免疫组化的方法,观察两组材料细胞外基质中黏多糖分布情况。[结果]支架组通过HE染色观察到脱细胞彻底、评分为"优"的百分比为80%;HE染色观察评分为"优"支架经DAPI染色验证其内部细胞残留量评分也为"优";其三维结构完整,其孔径均值为9.07μm;含水率为(228.14±19.39)%;孔隙率为(71.82±2.10)%;在胰酶中,第20 h的酶解率平均为(35.904±1.911)%;免疫组化分析鉴定细胞外基质中包含一定的黏多糖。对照组中正常脊髓经HE染色和DAPI染色观察到大量细胞;三维网孔状结构,孔径均值为40.7μm;含水率和孔隙率分别为(109.32±12.44)%和(61.18±4.19)%;在胰酶中,第20 h的酶解率平均为(25.704±1.030)%;细胞外基质中包含大量的黏多糖成分。[结论]EDC交联结合化学萃取法制备的支架脱细胞彻底、制备效率高,具有三维网状结构、良好的含水率、空隙率、抗酶解性,一定程度上保留细胞外基质中黏多糖成分,符合组织工程学支架制备要求,为脊髓支架提供了一种新的选择。     

大鼠脱细胞异体脊髓支架的免疫原性研究

[目的]评价脱细胞脊髓支架的免疫原性,为其在组织工程中的应用奠定理论基础。[方法]将脱细胞脊髓(冻融 3%脱氧胆酸钠 DNase,RNase消化)及新鲜大鼠脊髓分别植入SD大鼠椎旁肌内,于术后1～4周分别取材进行组织学观察,通过HE染色评价炎症反应程度;应用免疫组织化学方法观察移植物及周围组织中的CD3、CD4和CD8阳性T细胞浸润程度,评价免疫排斥反应强度。[结果]组织学观察显示术后均引起周围组织炎症反应,脱细胞组术后1周可见中性粒细胞和淋巴细胞浸润,但2周后只有少量淋巴细胞浸润;新鲜异体脊髓移植组术后1周可见大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润,术后4周仍有大量淋巴细胞浸润;与新鲜异体脊髓移植比较,化学去细胞异体脊髓植入后免疫原性明显降低,但仍有轻度细胞介导的免疫反应存在。[结论]移植经化学去细胞处理的异体脊髓后,仅引起轻微的炎症反应和免疫排斥反应,具有良好的组织相容性,并有可能成为良好的脊髓组织工程替代材料。     

粗大去细胞神经移植物的化学萃取及组织学研究

目的：发展新的化学处理方法，清除犬周围神经中的细胞和髓鞘，萃取粗大长段的去细胞神经移植物。方法：以Triton X-100和脱氧胆酸钠溶液化学处理犬坐骨神经，萃取神经行组织学及免疫组织化学观察。结果：去细胞神经弹性好，细胞和髓鞘被彻底清除，雪旺细胞基底板层保留完好，成为空的神经基质管。结论：该方法可有效清除大型哺乳类粗大神经的细胞及髓鞘，该神经移植物保持了网管柱状结构，保留了雪旺细胞基底板层及其主要成分一板层素。     

人类去细胞同种异体神经移植物化学萃取方法的研究

目的：新鲜同种异体神经免疫排斥反应的标靶是细胞、髓鞘。发展新的化学处理方法,清除人类周围神经中的细胞和髓鞘 ,萃取粗大和长段的去细胞神经移植物。方法：切取年轻男性遗体捐献者的长段尺神经,以triton X-100和脱氧胆酸钠溶液按一定浓度和程序进行化学处理。萃取神经及新鲜神经行HE染色、髓鞘染色及纤维素染色,以观察细胞、髓鞘及神经基底膜;免疫组织化学染色以显示许旺细胞基底板层;行半薄切片及超薄切片透射电镜检查,观察超微结构。结果：去细胞神经的延展性及神经外膜的韧弹性良好。细胞和髓鞘被彻底清除,神经基底膜被保留;许旺细胞基底板层保留完好;去细胞神经为一种没有细胞髓鞘及其碎片的空的神经基质管。结论：Triton X-100及脱氧胆酸钠化学处理方法,可有效清除人类周围神经中的细胞及髓鞘,萃取粗大和长段的去细胞神经;该神经移植物保持了网管柱状组织结构,保留了许旺细胞基底板层及板层素。     

化学萃取法制备人类同种异体神经支架的实验研究

目的发展化学萃取方法去除人类周围神经中的细胞和髓鞘，获得粗大和长段的去细胞神经支架。方法取三段长10cm，直径8mm的坐骨神经，以Triton-100和脱氧胆酸钠溶液按一定浓度和程序进行萃取，萃取神经及新鲜神经于中段取材，行HE染色、纤维素染色、砂罗铬花青染色、S-100免疫组化染色，在扫描电镜及放射电镜下观察超微结构。结果萃取两次后，去细胞神经具有良好的粘性和弹性，细胞和髓鞘被彻底清除，神经纤维支架被保留，成为一种没有细胞髓鞘及其碎片的空的基底膜管架结构。结论应用Triton-100及脱氧胆酸钠萃取两次，可去除人类长段、粗大周围神经中的细胞和髓鞘而保留神经的基底膜管和纤维支架结构。     

化学萃取同种异体神经种植许旺细胞的体外实验

目的：通过自体许旺细胞与化学萃取同种去细胞异体神经桥接物体外结合培养的研究，寻找一种在结构功能上与自体神经相似而抗原性少或无的物质来修复较长距离的神经缺损。方法：使用近交系F344乳鼠和双差速贴壁及Arab-C抑制成纤维细胞生长的细胞培养方法来获得大量纯度的许旺细胞。成年SD大鼠作为异体神经来源，利用化学萃取去除其中细胞成分降低其抗原性，制备去细胞神经桥接物，再把前者通过微注射方法注入到后者内部继续培养观察细胞生长情况。用抗S-100标记许旺细胞计算纯度，用HE染色、电镜观察神经萃取及细胞种植其内后生长情况。结果：许旺细胞培养纯度达92%以上。Triton-X-100及脱氧胆酸钠具有完全萃取掉神经纤维中的许旺细胞及髓鞘，萃取后所得到的桥接物适合于许旺细胞体外生长，并且细胞在其内有迁移排成行的特性。结论：通过化学萃取方法所得到的异体去细胞神经桥接物种植自体许旺细胞后可能为一种理想的神经缺损修复材料。     

粗大异体神经两种化学萃取方法的比较

[目的]采用两种不同的化学法萃取粗大的异体神经,对比观察这两种方法在萃取效果方面的差别。[方法]取新鲜猪坐骨神经,每段长60mm,分别在Triton-100、脱氧胆酸钠及SB-10、SB-16、Triton-200中去细胞处理。实验分两组:Ⅰ组,Triton-100、脱氧胆酸钠去细胞2遍;Ⅱ组SB-10、SB-16、Triton-200去细胞处理2遍。另设对照组:新鲜未处理的猪坐骨神经。从去细胞程度、基底膜板层素活性、脱髓鞘程度及神经纤维管道完整性4个方面进行评价。[结果]所有实验组神经段神经纤维管道尚可,Ⅰ组较Ⅱ组去细胞完全,laminin成分保存;Ⅰ组脱髓鞘完全,Ⅱ组髓鞘成分有残留;Ⅰ组和Ⅱ组神经管道完整性比正常神经管道结构完整性差,在去细胞神经的制备过程中,应考虑基底膜的活性、去细胞、脱髓鞘及结构完整性的程度。[结论]对于粗大神经的处理,Triton-100、脱氧胆酸钠法作去细胞神经处理可能是一种较好的方法。     

不同脱细胞方案制备主动脉细胞外基质支架的比较研究

目的 应用不同方法对猪升主动脉进行脱细胞,从脱细胞有效性、细胞外基质破坏、生物力学和组织相容性等方面进行综合比较,以期获得适宜的组织工程血管支架。方法 取市售猪升主动脉30根随机分成6组(n=5),分别行以下脱细胞处理:A组0.1%胰蛋白酶/0.02%EDTA/PBS,B组1%Triton X-100/0.02%EDTA/蒸馏水,C组1%脱氧胆酸钠/蒸馏水,D组0.5%脱氧胆酸钠/0.5%SDS/蒸馏水,E组1%脱氧胆酸/蒸馏水;F组未行脱细胞处理,作为对照。观察各组支架大体结构,行HE染色观察支架显微结构和脱细胞有效性,DNA定量分析评价脱细胞效率;免疫组织化学染色观察Ⅰ型胶原和弹性蛋白损伤;扫描电镜观察内膜表面结构,测定生物力学性能。取90只SD大鼠随机分为6组(n=15),于腹壁肌内分别植入各组支架,术后7、14、28 d行HE染色评价支架免疫原性和组织相容性。结果 HE染色及DNA定量分析示,仅A、D组支架完全去除细胞成分。A组Ⅰ型胶原表达量显著低于其余各组(P<0.05),基底膜破坏严重,生物力学性能下降,最大应力和抗张强度显著低于其余各组(P<0.05),断裂伸长率显著高于其余各组(P<0.05)。D组Ⅰ型胶原破坏较B、C、E、F组严重(P<0.05),但基底膜完整,生物力学性能接近于F组(P>0.05)。植入大鼠体内实验显示,D组支架免疫原性和组织相容性明显优于其余各组,炎性细胞浸润程度轻(P<0.05)。结论 采用0.5%脱氧胆酸钠/0.5%SDS/蒸馏水对猪主动脉进行脱细胞,获得的细胞外基质支架具有用于构建组织工程血管的潜能。     

细胞衍生的细胞外基质支架在骨科组织工程的研究进展

[目的]对细胞衍生的细胞外基质支架在骨科组织工程中的应用及制备细胞衍生的细胞外基质支架的方法进行综述。[方法]查阅近年国内外相关文献,总结细胞衍生的细胞外基质支架在骨科组织工程中的研究进展,对细胞衍生的细胞外基质脱细胞方法进行归纳和分类。[结果]近年来细胞衍生的细胞外基质支架在来源细胞、培养条件和脱细胞方法等方面有了一些进展,但仍然没有统一的标准。[结论]目前来看,细胞衍生的细胞外基质在骨科组织工程中有很大的应用价值,是很有希望的研究方向。     

人源性同种异体去细胞外周神经材料标准制备方法的研究

目的 对目前文献报道使用的5种不同方法制备的人源性同种异体去细胞外周神经材料进行综合分析比较其优劣,以确定可供临床使用的标准的制备流程.方法 将人源性神经按5种不同方法进行化学萃取,制备的外周神经支架材料分别行苏木精-伊红(HE)染色、免疫组化(S-100、Col I)和透射电镜、氮含量测定等检测,观察5种方法去除许旺细胞、髓鞘和轴突等抗原成分以及基底膜保存完好的情况.结果 分别萃取2次持续24 h组神经的HE染色显示去除细胞和轴突彻底,纵切片上未见任何细胞,红染的神经内膜呈波浪状纵形排列,轴突、髓鞘结构消失而形成管柱状空隙;S-100染色呈阴性;Col I染色结果可以看出其结构呈松散不规则的棕黄色结构,而其它处理组则结构相对整齐的纵向带状结构.透射电镜显示该组与各处理之间髓鞘去除差异无统计学意义.氮含量测定显示该组蛋白含量比值最低.结论 使用Triton X-100处理24 h再分别脱氧胆酸钠24 h持续萃取2次,可作为供临床使用的制备人源性去细胞同种异体神经支架材料的标准流程.     

去细胞组织工程化神经支架的制备与形态学研究

目的 探讨如何去除人类长段粗大神经中的细胞。为构建人类组织工程化神经提供具有仿生结构的支架。方法 取4段长10cm、直径6mm人的胫神经，其中3段用3％三硝基甲苯和4％脱氧胆酸钠分别萃取1、2和3次，在萃取神经和未萃取神经的中段取材，行HE染色、砂罗铬花青染色和S—100免疫组化染色，在光镜和电镜下观察神经萃取前后形态学的变化。结果 用三硝基甲苯和脱氧胆酸钠萃取后，胫神经内的细胞消失，而纤维性支架结构与未经萃取的神经相仿，电镜下可见萃取后的神经由空的神经基底膜管和管之间的胶原纤维构成。随着萃取次数的增加，神经内残留的S—100蛋白显著减少，但反复萃取后神经的支架结构受破坏。结论 用三硝基甲苯和脱氧胆酸钠萃取2次可去除人体长段、粗大神经的细咆而保留完整的神经基底膜管和纤维支架结构，可能是制备具有仿生结构的人类组织工程化神经支架较为理想的方法。     

Study in vitro of populating autogenous Schwann cells into chemical extracted allogenous nerve

Objective:To look for an ideal substance to repair large gap of nerve difect after injury by culture of Schwann cells(Scs)and preparation of acellular allogenous nerve grafts(ANG) with chemical extraction.Methods:The double adhesion culture and Arab-c to prohibit the fibroblast growth were used to achieve high-purified Scs.Triton-x-100 and sodium deoxycholate were used to achieve ANG.Finally the Scs were microinjected into the acellural nerve grafts and cultured in vitro.The consequence was analysed.Results:High purified Scs and ANG were acquired, which could integrate each other well.Scs could survive and transfer to aline in vitro.Conclusions:Populating Scs into chemical extracted ANG may be an ideal substance to repair the large gap of nerve defect after injury.     

Ⅰ型胶原半月板支架负载纤维软骨细胞体外培养

[目的]观察Ⅰ型胶原半月板支架对纤维软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为半月板组织工程支架的可行性及价值。[方法]构建Ⅰ型胶原半月板支架，将体外培养的兔半月板纤维软骨细胞吸附于该支架上三维立体培养，通过相差倒置显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对半月板纤维软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。[结果]Ⅰ型胶原能制成理想大小、形状的三维立体多孔半月板支架，纤维软骨细胞在支架孔壁贴附良好，维持表型稳定，分泌胞外基质。[结论]Ⅰ型胶原半月板支架细胞相容性良好，但力学性能相对较差，通过与其它生物材料复合以提高其机械力学强度，可望制得理想的半月板组织工程支架。     

Development of a tissue-engineered composite implant for treating traumatic paraplegia in rats

This study was designed to assess a new composite implant to induce regeneration of injured spinal cord in paraplegic rats following complete cord transection. Neuronal xenogeneic cells from biopsies of adult nasal olfactory mucosa (NOM) of human origin, or spinal cords of human embryos, were cultured in two consecutive stages: stationary cultures in a viscous semi-solid gel (NVR-N-Gel) and in suspension on positively charged microcarriers (MCs). A tissue-engineered tubular scaffold, containing bundles of parallel nanofibers, was developed. Both the tube and the nanofibers were made of a biodegradable dextran sulphate–gelatin co-precipitate. The suturable scaffold anchored the implant at the site of injury and provided guidance for the regenerating axons. Implants of adult human NOM cells were implanted into eight rats, from which a 4 mm segment of the spinal cord had been completely removed. Another four rats whose spinal cords had also been transected were implanted with a composite implant of cultured human embryonic spinal cord cells. Eight other cord-transected rats served as a control group. Physiological and behavioral analysis, performed 3 months after implantation, revealed partial recovery of function in one or two limbs in three out of eight animals of the NOM implanted group and in all the four rats that were implanted with cultured human embryonic spinal cord cells. Animals of the control group remained completely paralyzed and did not show transmission of stimuli to the brain. The utilization of an innovative composite implant to bridge a gap resulting from the transection and removal of a 4 mm spinal cord segment shows promise, suggesting the feasibility of this approach for partial reconstruction of spinal cord lesions. Such an implant may serve as a vital bridging station in acute and chronic cases of paraplegia.     

大鼠胚胎脊髓移植后增加损伤脊髓生长抑素mRNA的表达

[目的] 研究大鼠胚胎脊髓移植后是否能够影响生长抑素（SOM）mRNA的表达。[方法]将动物分为单纯半切洞损伤组（A组）、胚胎脊髓移植组（B组）。术后1、3、7、14、28d，采用原位杂交方法观察SOM mRNA的表达，采用计算机图像分析技术，进行定量分析。[结果] 胚胎脊髓移植组SOM mRNA蛋白表达明显多于单损伤组。[结论] 作者的研究表明胚胎脊髓移植后可使损伤脊髓SOM mRNA表达增多。     

骨髓基质细胞体外分化移植治疗大鼠脊髓损伤的初步研究

[目的]探讨大鼠骨髓基质细胞体外分化为神经干细胞后移植治疗大鼠脊髓损伤的可行性。[方法]骨髓基质细胞经培养及定向分化为神经干细胞，后者由5-溴脱氧尿嘧啶核苷法标记，制备大鼠脊髓损伤模型，伤后第9d移植神经干细胞，实验分组：细胞移植组、PBS填充组、正常对照组。应用组化法观察移植细胞是否存活，取材前24h显露坐骨神经，行辣根过氧化物酶逆行示踪法观察脊髓损伤处的修复重建。[结果]骨髓基质细胞在定向分化为神经干细胞后标记并移植于脊髓损伤区，标记的阳性细胞可在受体脊髓内检测到，辣根示踪技术显示细胞移植组较PBS填充组阳性细胞明显增多，差别有统计学意义。[结论]大鼠骨髓基质细胞在体外分化为神经干细胞后移植于脊髓损伤区，移植细胞可以存活，并参与脊髓损伤处神经传导通路的结构重建。     

骨髓间充质细胞与速固化磷酸钙支架共培养的实验研究

[目的]观察人骨髓间充质干细胞在速固化磷酸钙骨水泥支架中的增殖和生长情况。[方法]将速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥支架材料预先成形。采用全骨髓法分离人骨髓间充质细胞并在体外对细胞进行培养和扩增。72h首次换液,细胞融合80%传代,取第3代细胞用于实验。将细胞与磷酸钙骨水泥支架复合培养,分别利用四甲基偶氮唑蓝MTT法及扫描电镜等检测细胞在材料中的增殖和生长情况。[结果]用酶标仪检测OD值提示共培养后,支架内的细胞数量逐渐增加。扫描电镜结果显示支架材料内部为多孔结构,孔内见有细胞生长,细胞表面可见分泌颗粒。[结论]速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥对人骨髓间充质干细胞有较好的细胞相容性,细胞可在材料内黏附和增殖,是理想的骨组织工程支架材料。     

Rapid repair and regeneration of damaged rabbit sciatic nerves by tissue-engineered scaffold made from nano-silver and collagen type I

A tissue-engineered scaffold with nano-silver and collagen type I was constructed and investigated for its ability to adsorb laminin and the usefulness in the repair and regeneration of damaged peripheral nerves in animals. The nano-silver scaffold displayed ideal microtubule structure under electronic microscope; even distribution of the nano-silver particles was also seen with energy spectrometry. After immersion in a laminin solution, the laminin-attached scaffolds were implanted into rabbits to repair a 10-mm injury of the sciatic nerve. At 30 days post-implantation, regeneration of the damaged nerve was evaluated by transmission electron microscopy, electrophysiological examination and fluoro-gold (FG) retrograde labelling. Compared with the control collagen-scaffold without nano-silver, the nano-silver-containing scaffold showed a higher rate of laminin adsorption, regenerated a nerve with a thicker myelin sheath and improved the nerve conduction velocity and nerve potential amplitude. FG retrograde labelled the newly grown axons in the spinal cord cortex anterior horn and the dorsal root ganglion. These results demonstrate the superior functionality of the nano-silver-collagen scaffold in the adsorption to laminin and subsequent regeneration of damaged peripheral nerves.     

基因重组BDNF感染脊髓神经干细胞及其表达

[目的]探讨脊髓神经干细胞（NSC）被重组逆转录病毒感染后目的基因的表达。[方法]用人脑源性神经生长因子（hBDNF）基冈重组逆转录病毒上清液感染脊髓NSCs，取感染后的NSCs培养液（BDNF条件培养液）培养背根神经结（DRG）和小鼠嗜铬瘤细胞（PC12细胞）检测培养液中BDNF活性；酶联免疫吸附反应（ELISA）检测培养液中BDNF浓度；逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测BDNF mRNA。[结果]感染hBDNF基因重组逆转录病毒的NSCs上清中有BDNF、的表达，经hBDNF条件培养液培养的PC12细胞．数量增多，突起明显变长。经hBDNF条件培养液培养背根神经结，神经元突起伸出，逐渐增多，长度大于神经节直径。[结论]脊髓NSC可直接作为基因靶细胞，被BDNF基因重组逆转录病毒有效感染而表达和分泌有生物学活性的BDNF、