叶下珠复方体内抗鸭乙型肝炎病毒作用的实验研究

分别给鸭乙型肝炎病毒实验感染的广州麻鸭和樱桃谷鸭灌服叶下珠复方，前者两个剂量组分别为１０ｇ／ｋｇ和５ｇ／ｋｇ，后者为１０ｇ／ｋｇ，１天次，连续给药１４ｄ，并设病毒模型组和无环岛甙治疗组作为对照。     

乙型肝炎病毒表面抗原单链抗体细菌内免疫抗乙型肝炎病毒基因治疗研究

目的：研究乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)人源单链可变区抗体（ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒（HBV）基因治疗的作用。方法：用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBsAg人源单链可变区抗体，聚合酶链反应（PCR）法扩增HBsAg单链抗体基因，并构建表达HBsAg ScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-HBsAg ScFv,转染PA317细胞，将转染细胞分泌的假病毒颗粒感染2．2．15细胞，酶联免疫吸附法（ELISA）检测其上清HBsAg和HBeAg，定量检测HBV DNA。结果：成功筛选出HBsAg ScFv,PCR扩增出750bp的全基因，构建HBsAg ScFv基因的逆转录病毒载体，转染PA317细胞，在上清中检测出含HBsAg ScFv假病毒颗粒的存在，上清感染2．2．15细胞后第3、5、7、14天，HBsAg,HBeAg逐渐下降，到第14天时HBsAg已变为阴性，DNA定量检测无明显变化。结论：HBsAg ScFv能成功地在逆转录病毒载体中表达，并有抑制HBsAg,HBeAg表达的作用。     

应用RNA干扰技术抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

目的 构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,观察其对HBV复制和表达的影响。方法 将构建成功的pSIHBV／C与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞,转染后24、48、72h,用Abbott试剂检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,并用免疫荧光染色法观察细胞内病毒核心抗原和表面抗原的表达。结果 成功构建了针对HBV核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,并发现它能明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌,转染后第2天抑制率达高峰,分别为92％、85％,而随机序列的siRNA无此作用。免疫荧光染色结果也证实转染24b后,随pSIHBV／C比例的升高,其对HBV抗原表达的抑制作用也随之增加,当pSIRNA／C与pHBV1．3比例为1：20时,pSIHBV／C对细胞内HBsAg和HBcAg表达的抑制作用最强。结论 乙型肝炎病毒核心区的siRNA具有显著和特异的抗HBV复制和表达的作用。     

脱氧核酶抑制乙型肝炎病毒基因表达的实验研究

目的：探讨乙型肝炎病毒(HBV)s基因和c基因特异性的脱氧核酶(DNAzyme)对HBV表面抗原(HB—sAg)和e抗原(HBeAg)表达的抑制效应。方法：设计合成针对HBVs基因ORF A^157UG、e基因ORF A^1816UG的DNAzyme DrzBS、DrzBC,在2.2．15细胞上观察其对HBVs基因、c基因的表达抑制效应。结果：DrzBS、DrzBC作用于2．2．15细胞后,可显著抑制HBVs基因、c基因的表达,有效浓度为0．1—2．5μmol／L并呈剂量依赖性,最高抑制率分别为94．2％和91．8％;有效抑制持续时间可达72h,DrzBS、DrzBC在细胞内对HbeAg、HbeAg表达的抑制效率,明显高于作为对照的反义寡核苷酸AsBS、AsBC,有效浓度较后者低至少l0倍。其对2．2．15细胞的HBVDNA复制无明显影响,亦未见明显的细胞毒性作用。结论：在2．2．15HBV细胞模型系统,DrzBS、DrzBC能高效阻断HBVs基因、e基因的表达,是一种特异性的、高效的抗HBV基因治疗剂。     

HBsAg阴性孕妇乙型肝炎病毒宫内感染检测分析

目的:探讨使用荧光定量PCR方法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性孕妇乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染情况。方法:选择住院分娩的HBsAg阴性孕妇,使用荧光定量PCR方法检测孕妇及其新生儿的血清中HBV-DNA。结果:502例HBsAg阴性孕妇血清HBV-DNA阳性40例,其中27例发生宫内感染,宫内感染总阳性率5.38%。以HBeAb+HBcAb+组合模式的宫内感染率最高,达12.50%,而HBVM全阴性者发生宫内感染率最低,为1.10%。结论:HBsAg阴性孕妇也可能发生HBV宫内感染,采用灵敏度高的荧光定量PCR方法检测HBsAg阴性孕妇及新生儿血清中HBV-DNA,对发现其HBV宫内感染有重要意义。     

乙型肝炎病毒宫内传播的分子生物学证据

采用病毒DNA分子杂交,Southern吸印及PAP等技术,从引产死婴心血及肝组织中发现HBV-DNA及HBsAg,从而为乙型肝炎病毒宫内传播提供了分子生物学证据。本研究还表明HBV宫内传播频率较低,为HBV母婴传播的产后立即特异性免疫预防提供了实践依据。     

乙型肝炎病毒表面抗原单链抗体细胞内免疫抗乙型肝炎病毒基因治疗研究

目的 :研究乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)人源单链可变区抗体 (ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗的作用。方法 :用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBsAg人源单链可变区抗体 ,聚合酶链反应(PCR)法扩增HBsAg单链抗体基因 ,并构建表达HBsAgScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN HBsAgScFv,转染PA317细胞 ,将转染细胞分泌的假病毒颗粒感染 2 2 15细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测其上清HBsAg和HBeAg ,定量检测HBVDNA。结果 :成功筛选出HBsAgScFv ,PCR扩增出 75 0bp的全基因 ,构建HBsAgScFv基因的逆转录病毒载体 ,转染PA317细胞 ,在上清中检测出含HBsAgScFv假病毒颗粒的存在 ,上清感染 2 2 15细胞后第 3、5、7、14天 ,HBsAg、HBeAg逐渐下降 ,到第 14天时HBsAg已变为阴性 ,DNA定量检测无明显变化。结论 :HBsAgScFv能成功地在逆转录病毒载体中表达 ,并有抑制HBsAg、HBeAg表达的作用     

上海市浦东新区乙型肝炎病毒母婴传播的发生率及其影响因素研究

目的 研究乙型肝炎病毒（HBV）母婴传播情况及其影响因素,为乙肝防治工作提供依据。 方法 从上海市浦东新区4家医疗机构中招募445名HBV表面抗原（HBsAg）阳性产妇开展流行病学问卷调查,分别采集母亲外周血和新生儿脐带血检测乙肝血清学指标及HBV DNA滴度。新生儿脐带血HBsAg阳性与HBV DNA阳性者定义为新生儿HBV阳性。新生儿均按国家规定注射疫苗,对104名新生儿开展出生后随访到7月龄,采集血样进行乙肝血清学与HBV DNA滴度检测,7月龄婴儿HBsAg阳性定义为儿童HBV突破免疫感染。 结果 HBsAg阳性产妇所生新生儿HBV阳性率为8.0%。HBsAg和HBV e抗原（HBeAg）双阳性产妇的新生儿HBV阳性率高于HBsAg单阳性产妇的新生儿（26.7% vs 1.8%,P<0.05）;HBV DNA大于10⁶copies/mL产妇的新生儿HBV阳性率高于HBV DNA小于10⁶copies/mL产妇的新生儿（23.6% vs 2.3%,P<0.05）。产后7个月,婴儿突破免疫感染率为3.8%,其母亲均为HBsAg和HBeAg双阳性者。 结论 母体HBeAg阳性与HBV DNA高浓度是新生儿HBV阳性的主要危险因素,并可能导致新生儿免疫失败。     

绵阳市育龄期妇女乙型肝炎病毒表面抗原与表面抗体的 双阴分布现况

目的 了解绵阳市育龄期妇女乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)与表面抗体（HBsAb)的双阴分布现况,为制定育龄期妇女乙肝控制策略提供科学依据。方法 采用多阶段随机抽样方法,抽取绵阳市62 551名15~49 岁妇女作为研究对象,对所有研究对象进行问卷调查并采集其血标本,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对血清中HBsAg和HBsAb进行检测,HBsAg和HBsAb检测结果均为阴性判定为易感。结果 共62 035名育龄期妇女纳入分析,检测出HBV易感者共28 460名,双阴率为45.88%;15~20岁组HBV表面抗原抗体的双阴性最低;汉族HBV表面抗原抗体的双阴性高于其他民族;农村人口HBV表面抗原抗体的双阴性高于城市人口;丧偶/离异HBV表面抗原抗体的双阴性最高,已婚HBV表面抗原抗体的双阴性最低;农民HBV表面抗原抗体的双阴性最高,医务人员HBV表面抗原抗体的双阴性最低;有乙肝家族史育龄期妇女易感性低于无乙肝家族史者;有乙肝接种史者易感性低于无乙肝接种史者,差异均有统计学意义（ P<0.005）。结论 绵阳市育龄期妇女HBV表面抗原抗体的双阴性较高,应加强对其HBV 易感性的监测和接种乙肝疫苗,以减少乙肝母婴传播的概率。     

绵阳市农村居民HBsAg阳性、HBsAg和HBsAb双阴分布现况

目的 了解绵阳市农村居民乙肝表面抗原（HBsAg）阳性、HBsAg和乙肝表面抗体（HBsAb）双阴分布的现况,为制定农村乙肝防控策略提供科学依据。方法 采取多阶段随机抽样方法抽取163 797名农村居民作为调查对象,对其进行一对一问卷调查,并采取血标本,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对分离出的血清进行HBsAg和HBsAb检测,分析其表达分布的流行病学特征。结果 调查对象HBsAg总阳性率为6.57%〔95%可信区间（CI）:6.45%～6.69%〕,双阴率为40.32%（95%CI:40.36%～40.84%）。男性HBsAg阳性率（7.74%）高于女性（5.73%）,双阴率（39.93%）低于女性（40.61%）;56～65岁人群HBsAg阳性率（7.36%）最高,86～96岁人群双阴率（47.61%）最高;已婚人群HBsAg阳性率（6.63%）高于未婚人群（5.54%）和离异/丧偶人群（6.11%）,离异/丧偶人群的双阴率（43.04%）最高;涪城区HBsAg阳性率（9.23%）高于江油市（5.38%）和安县（5.77%）,安县双阴率（55.24%）最高;有乙肝家族史人群的HBsAg阳性率（21.01%）高于无乙肝家族史人群（6.41%）,双阴率（30.10%）低于后者（40.60%）;有乙肝疫苗接种史人群的HBsAg阳性率（3.78%）和双阴率（37.91%）均低于无乙肝疫苗接种史人群（分别为7.30%和40.92%）;上述差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 绵阳市农村居民HBsAg阳性率和双阴率均较高,高龄、未接种乙肝疫苗者应重点防控。     

三螺旋结构寡核苷酸序列对DHBV基因的连接及封锁抑制作用 …

目的 筛选与鸭乙肝病毒（ＤＨＢＶ）－ＤＮＡ Ｘ／Ｃ区目标基因特异连接的三螺旋结构寡核苷酸（ＴＦＯ）,探讨ＴＦＯ对ＤＨＢＶ－ＤＮＡ的特异连接及抑制作用。方法 将人工合成的ＴＦＯ与目标基因片断和含（ＤＨＢＶ）ＤＮＡ的重组细胞反应,用电泳转移印迹、ＰＣＲ和鸭肝原代细胞培养等技术观察ＴＦＯ对相应基因的连接以及对细胞内ＤＨＢＶ－ＤＮＡ复制的抑制效应。结果 在所设计的多条ＴＦＯ中,（３）ＴＦＯ和（５）ＴＦＯ在     

清肝排毒饮抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究

目的观察清肝排毒饮抗鸭乙型肝炎（DHBV）作用。方法用Dot—BLOT法筛选出DHBsAg强阳性1d龄华南麻鸭。随机分为5组，分别为模型组、拉米夫定（ACV）组和清肝排毒饮大、中、小剂量组。除模型组外，其他各组均灌胃口服治疗10d，于用药前（T0）、用药第5d（T5）、第10d（T10）厦停药后第3d（P3）分别采血，采用斑点杂交方法检测用药前后鸭血清乙肝病毒脱氧核糖核酸（DHBV DNA）的动态变化。结果清肝排毒饮中剂量治疗组第5、10d鸭血清DHBV DNA OD值明显低于培药前，差异有显著性（P〈0．05），但与拉米夫定组比较，差异无显著性意义（P〉0．05）。停药3d后无反跳。结论清肝排毒饮有一定的抑制DHBV DNA复制作用。     

一例隐源性肝硬化的分子基础

目的　探讨一例表面抗原阴性的隐源性肝硬化的病原及其分子基础。方法　定性、定量测定患者血清中的乙型肝炎病毒 (HBV)抗原、抗体和DNA ,进行HBVS基因的扩增、克隆和序列分析。结果　HBsAg (- ) ,定量测定结果 (S/N) :0 77(阳性参考值S/N≥ 2 0 0 )。HBeAg (+) ,定量测定结果 (S/N) :5 6 4 3(阳性参考值≥ 2 10 )。抗 HBc (+) ,定量测定结果 (S/CO) :0 0 3(阳性参考值S/CO≤1 0 )。抗 HBs (+) ,抗 HBe (- ) ,HBVDNA (+) ,定量 :1 5 4× 10 9拷贝 /ml。S基因克隆和序列分析发现第 336位核苷酸由C变为A ,导致第 6 1位密码子由UCA(丝氨酸 )变为UAA(终止子 ) ,HBsAg合成受阻。结论　HBV是本例肝硬化的病原 ,S基因终止突变是其分子基础 ,这一发现具有重要的临床意义和病毒学意义。     

慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒DNA序列异质性及准种特点的研究

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)基因异质性来探讨HBV准种群在慢性感染者中的存在状态。方法应用聚合酶链反应（PCR)法,自18例慢性患者血清中分别扩增前C／C基因、P基因逆转录酶区(RT)、HBV全S区、X基因和全基因组序列,克隆人pGEM Teasy质粒,挑选81克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果除外大段缺失突变的克隆,来源于同一患者前C／C区、RT区、全S区、X区和全基因组不同克隆之间的碱基序列同源性分别为98．0％-99．1％、98．7％-99．3％、97．5％-100％、93．0％-98．20A,和96．6％-97．5％。前C区A83点突变、C抗原内部缺失较为常见,缺失突变、终止替换突变、短序列的插入或缺失突变造成的移框突变在各个区域中均可检出,X基因(核心蛋白启动子区,CP)内部缺失突变不仅导致X蛋白羧基端的多样性,而且调控HBeAg的表达。编码截短型表面抗原中蛋白和缺陷病毒基因亦在患者外周血中。结论 多区域测序结果提示HBV慢性患者体内HBV呈现准种群共存,X区(CP区)内存在热点缺失突变区,CP区的变异可能影响前C蛋白的表达,这些变异可能与患者不良预后有关。病毒蛋白的氨基酸的替换突变表现的个体特异性值得进一步研究。     

对流免疫电泳技术检测鸭血清中DHBsAg

用CsCl密度梯度离心法提纯鸭血清中的鸭乙型肝炎病毒表面抗原(D-HBsAg)。以纯化的DHBsAg加等量弗氏佐剂对家兔免疫3次,第3次免疫2周后采血,分离血清,用正常鸭血清对其吸收,得到初步纯化的抗血清,用此作为抗DHBsAg之抗体,用对流免疫电泳技术(CIEP)检测DHBsAg,检测101份,与DHBV DNA斑点杂交法比较,结果:CIEP敏感度80.43%,特异度92.73%,一致性87.13%。重复试验结果相同,表明可用于对鸭血清中的DHBsAg的初步筛选。     

广西麻鸭乙型肝炎感染病毒动物模型的实验研究

目的 探讨广西麻鸭作为乙型肝炎病毒感染动物模型的可能性.方法 应用广西1 d龄雏麻鸭经腹腔感染鸭乙型肝炎病毒（DHBV）,13 d后采用实时荧光定量PCR法检测麻鸭血清DHBV含量,筛选出DHBV强阳性鸭.结果 共检测148份麻鸭血清标本,其中DHBV阳性标本136份,阳性率为91.9%.结论 广西麻鸭可作为乙型肝炎病毒感染动物模型.实时荧光定量PCR法检测DHBV敏感性较高,重复性好,可用于DHBV检测.     

鸭乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR方法的建立及应用

目的：建立鸭乙型肝炎病毒核酸(DHBV DNA)荧光定量的方法。方法：根据DHBV DNAS基因区的序列设计扩增所需3条引物，通过偶联反应用AmpliSensor荧光信号标记半巢式引物，经过前期不对称扩增、半巢式扩增及在线检测建立DHBV DNA阳性标准品QPCR的标准曲线，并将70份鸭血清分别用荧光定量PCR方法和地高辛标记的DHBV DNA探针斑点杂交的方法检测，比较结果的相关性。结果：DHBV DNA阳性标准品经过30次循环后，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可以看出有180bp、70bp两个片段，与设计的片段大小相符，扩增产物的浓度与标准品的起始浓度成正比，扩增指数的数值大小与该循环时己合成的扩增产物的量成正比，起始浓度的大小与要合成的一定扩增产物的量所需的循环次数成反比。用荧定量PCR方法和斑点杂交的方法检测血清中DHBV DNA的结果有良好的相关性(r＝0．97，P＜0.01，ν＝58)。结论：荧光定量PCR方法可作为检测DHBV DNA含量的一个重要手段。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在昆虫细胞中表达产物的鉴定

目的 :在昆虫细胞中表达乙型肝炎病毒 ( HBV)的表面抗原。方法 :利用已构建的含有 HBV S基因的重组杆状病毒 Bac- S,在昆虫细胞中进行表达 ,并用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹对表达产物进行检测。结果 :重组杆状病毒感染昆虫细胞后 ,可表达相应大小的 S蛋白 ,且该蛋白可被 HBs Ag特异性单抗 ( m Ab)所识别。结论 :利用杆状病毒表达系统 ,成功地表达了具有生物学活性的 HBV S蛋白。