Smads蛋白在成牙本质细胞系MDPC-23中的表达及功能

目的研究Smads蛋白在成牙本质细胞系MDPC-23作为转化生长因子(TGF)β信号分子的作用。方法常规条件下培养MDPC-23细胞,在TGF-β1刺激培养1h后,观察细胞内Smad分子的定位变化。将Smads真核表达载体分别与报告基因载体p3TP-Lux瞬时共转染至MDPC-23,在TGF-β1刺激培养24h后,裂解细胞,用双荧光素酶报告基因检测系统检测细胞裂解液中的荧光素酶活性。结果MDPC-23细胞表达Smad2和Smad3蛋白分子,主要定位于细胞质,在TGF-β1刺激1h后,Smad2和Smad3从胞质向胞核转位聚集。TGF-β1可诱导p3TP-Lux基础启动子活性,约增加13倍。过表达野生型Smad3蛋白可促进TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导,但是过表达Smad3突变体抑制TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导。和Smad3作用相比,过表达Smad2野生型或突变型蛋白对TGF-β1诱导p3TP-Lux启动子活性无明显影响。结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,Smad信号途径存在并参与介导TGF-β1诱导的转录调控。     

MDPC-23细胞内Smad信号途径在转化生长因子β1调控Smad7基因转录中的作用

目的：研究成牙本质细胞系MDPC-23内Smad信号途径在转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)调控Smad7基因转录调控中的作用，从基因转录水平探讨成牙本质细胞内TGF-β调控Smad7基因表达的分子机制。方法：培养MDPC-23细胞，通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad蛋白分子对Smad7启动子活性的影响，实验数据采用单因素方差分析。结果：当Smad7启动子(-408bp至 112bp)荧光素酶活性载体表达在MDPC-23细胞时，其基础启动子活性被TGF-β1显著诱导增加，而骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)对其活性无明显影响。单独过表达Smad1、2、4、5对Smad7启动子活性无明显影响。Smad3过表达显著增强Smad7启动子活性，而Smad3与Smad4共转染进一步增强了Smad3的作用。过表达Smad3突变型载体或Smad3反义cDNA(AS-Smad3)均显著抑制TGF-β1对Smad7启动子活性的诱导作用。结论：在成牙本质细胞系MDPC-23内，TGF-β通过Smad3与Smad4协同调控Smad7基因转录。     

MDPG-23细胞内Smad信号途径在转化生长因子β1调控Smad7基因转录中的作用

目的研究成牙本质细胞系MDPC-23内Smad信号途径在转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)调控Smad7基因转录调控中的作用,从基因转录水平探讨成牙本质细胞内TGF-β调控Smad7基因表达的分子机制.方法培养MDPC-23细胞,通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad蛋白分子对Smad7启动子活性的影响,实验数据采用单因素方差分析.结果当Smad7启动子(-408 bp至+112bp)荧光素酶活性载体表达在MDPC-23细胞时,其基础启动子活性被TGF-β1显著诱导增加,而骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)对其活性无明显影响.单独过表达Smad1、2、4、5对Smad7启动子活性无明显影响.Smad3过表达显著增强Smad7启动子活性,而Smad3与Smad4共转染进一步增强了Smad3的作用.过表达Smad3突变型载体或Smad3反义cDNA(AS-Smad3)均显著抑制TGF-β1对Smad7启动子活性的诱导作用.结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,TGF-β通过Smad3与Smad4协同调控Smad7基因转录.     

Smad8在成牙本质细胞系MDPC-23内BMP-2信号转导中的作用

目的：观察成牙本质细胞系MDPC-23内Smad8蛋白的表达,以及Smad8蛋白在骨形成蛋白-2（bonemorphogenetic protein-2,BMP-2）信号转导中的作用.方法：免疫组化法观察MDPC-23细胞内Smad8蛋白的表达,以及BMP-2和转化生长因子β1（TGF-β1）对MDPC-23细胞内Smad8分子定位的改变.结果：MDPC-23细胞的胞浆和胞核均有Smad8表达,在BMP-2刺激1 h后,Smad8从胞浆向胞核转位聚集.TGF-β1刺激后无类似现象发生.结论：成牙本质细胞系MDPC-23内存在Smad8的表达,且Smad8可特异性地将BMP-2的信号由胞浆转至胞核,但不能转导TGF-β1信号.     

Smad7在成牙本质细胞系MDPC-23内转化生长因子β信号转导中的作用

目的研究Smad7在成牙本质细胞系MDPC-23内转化生长因子(transforming growth factor-β1, TGF-β)信号转导的作用.方法培养MDPC-23细胞,免疫组化法观察TGF-β1对MDPC-23细胞内Smad7分子定位改变.通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad7分子对TGF-β1调控目的基因转录的影响.结果MDPC-23细胞表达Smad7蛋白,主要定位于细胞胞浆,在转化生长因子β1刺激30 min后,Smad7从胞核向胞浆转位聚集.TGF-β1显著诱导p3TP-Lux基础启动子活性.过表达Smad7完全抑制TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导,而过表达Smad7反义cDNA载体则显著促进了TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导.结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,Smad7可能作为一种抑制性Smad分子在拮抗TGF-β1信号转导过程中发挥重要的作用.     

人牙乳头细胞内Smad2在TGF-β_1信号转导中作用的研究

目的　观察体外原代培养的人牙乳头细胞内Smad2蛋白的表达 ,以及Smad2蛋白在转化生长因子 β1信号转导中的作用 ,探讨Smad2信号途径在TGF β1调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用机制。方法　原代培养人牙乳头细胞 ,Westernblot杂交方法检测内源性Smad2的表达和TGF β1调控下的表达变化 ,用免疫组化方法观察Smad2细胞内定位变化。结果　培养的人牙乳头细胞表达Smad2蛋白 ,TGF β1能引起Smad2从胞浆转位至核内聚集 ,而BMP 2无此功能 ;TGF β1或BMP 2刺激作用 6h、12h、2 4h和 48h ,牙乳头细胞内Smad2蛋白表达水平未见明显的改变。结论　人牙乳头细胞内存在Smad2基因的表达 ,Smad2能被TGF β1活化后转位至核内发挥作用 ,但Smad2基因的表达无明显变化 ,提示TGF β1在调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化的过程中 ,Smad2信号途径可能发挥一定的作用。     

TGF-β1/Smad3信号途径对牙本质涎磷蛋白基因表达的调控

目的：研究小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中TGF-β1及其信号分子Smad3对小鼠牙本质涎磷蛋白（dentinsialophosphoprotein，DSPP）基因表达中的调控作用。方法：PCR法制备DSPP引物、构建带有DSPP启动子片段的萤火虫荧光素酶基因报告载体，通过瞬时转染入MDPC-23细胞后，检测报告基因活性。结果：在TGF-β1的作用下，Smad3可以发生转位表达，由细胞浆转入细胞核内。同时，过表达野生型Smad3可以显著增强TGF-β1对DSPP启动子活性的下调作用。结论：TGF-β1可以通过Smad3信号通路对DSPP启动子进行调控；在DSPP启动子-2525-＋54bp之间，存在TGF-β1／Smad3信号途径的结合位点，从而发挥对DSPP基因的调控作用。     

TGF-β3作用下人牙髓细胞内Smad2、Smad3蛋白表达水平的变化

目的：探讨TGF—B3对人牙髓细胞内Smad2、Smad3蛋白表达的调控作用和差异。方法：取生长良好的第5代人牙髓细胞，分为实验组和对照组，实验组用5ng／mL TGF—β3刺激并培养6、12、24、48h，对照组不予刺激。提取各组总蛋白质，分别用Smad2、Smad3抗体进行Western印迹杂交。结果：与对照组相比，Smad3在TGF—β3刺激后6h、12h，其蛋白表达量无明显变化，而在刺激后24h表达量明显下降，刺激48h后表达十分微弱；Smad2在对照组以及刺激后各时间组，其蛋白表达量无显著变化。结论：人牙髓细胞内存在Smad2、Smad3蛋白的表达，TGF—β3对二者表达的调控方式有所不同，刺激后期Smad3表达水平的下调可能与TGF-β3负反馈调节自身的信号有关。     

成牙本质细胞系MDPC-23的生物学特性

目的：观察成牙本质细胞系MDPC-23的生物学特性。方法：细胞培养，细胞计数和逆转录多聚酶链反应。结果：MDPC-23为上皮样细胞形态，有多个细胞膜突起，易形成细胞结节，细胞倍增时间少于24h。在mRNA水平证实MDPC-23表达Ⅰ型原胶原a2、碱性磷酸酶和牙本质涎磷蛋白。结论：MDPC-23保持其成牙本质细胞系的生物学特性。     

人牙髓细胞内Smad 2、3在转化生长因子β1信号转导中的作用

目的：探讨人牙髓细胞内Smad 2、3在转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1)信号转导过程中的作用。方法：原代培养人牙髓细胞，用激光共聚焦显微镜观察TGF－β1刺激初期牙髓细胞内Smad 2、3由胞质向胞核转位的现象，同时采用Western blot方法检测刺激后期Smad 2、3蛋白表达的变化。结果：TGF－β1刺激2h内，Smad2、3在胞质中表达渐弱，在胞核内表达渐强，呈现由胞质向胞核逐步转位的趋势。Smad 2蛋白总量在TGF－β1刺激前后几乎无变化，而Smad 3在刺激后24h表达量明显下降，48h后表达十分微弱。结论：Smad 2、3可能是人牙髓细胞内TGF－β1的信号转导分子。TGF－β1刺激初期Smad 2、3通过发生转位参与转导TGF－β1信号至核内，刺激后期Smad 3表达水平的下调可能与TGF－β1负反馈调节自身的信号有关。     

人牙乳头细胞内Smad2在TGF-β1信号转导中作用的研究

目的观察体外原代培养的人牙乳头细胞内Smad2蛋白的表达,以及Smad2蛋白在转化生长因子-β1信号转导中的作用,探讨Smad2信号途径在TGF-β1调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用机制.方法原代培养人牙乳头细胞,Westernblot杂交方法检测内源性Smad2的表达和TGF-β1调控下的表达变化,用免疫组化方法观察Smad2细胞内定位变化.结果培养的人牙乳头细胞表达Smad2蛋白,TGF-β1能引起Smad2从胞浆转位至核内聚集,而BMP-2无此功能;TGF-β1或BMP-2刺激作用6h、12h、24h和48h,牙乳头细胞内Smad2蛋白表达水平未见明显的改变.结论人牙乳头细胞内存在Smad2基因的表达,Smad2能被TGF-β1活化后转位至核内发挥作用,但Smad2基因的表达无明显变化,提示TGF-β1在调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化的过程中,Smad2信号途径可能发挥一定的作用.     

转录因子c-Jun和c-Fos在牙本质涎磷蛋白基因表达中的作用

目的 研究成牙本质细胞内转录因子c-Jun和c-Fos在牙本质涎磷蛋白（DSPP）基因转录调控中的作用, 探索成牙本质细胞内DSPP基因表达的调控机制。方法 细胞免疫组化观察MDPC-23细胞内c-Jun和c-Fos蛋白分子的表达。瞬时转染和报告基因检测c-Jun和c-Fos在DSPP基因转录中的作用。结果 MDPC-23细胞表达c-Jun和c-Fos蛋白,c-Jun和c-Fos主要分布在MDPC-23细胞胞核。c-Jun或c-Fos过表达均显著抑制DSPP基因启动子活性。结论 证实成牙本质细胞内转录因子c-Jun和c-Fos参与下调DSPP基因表达。     

人牙胚发育过程中Smad2分子的表达与分布变化

目的 观察转化生长因子β（transforming growth factor－β，TGF－β）特异的细胞内信号转导分子Smad2在人牙胚发育过程中的表达与分布变化，探讨Smad2在牙发育过程中的作用。方法 制备人牙胚发育各期标本，免疫组化方法检测Smad2分子的表达。结果 Smad2在牙胚发育的各个时期存在特异的时空分布模式，其分布与TGF－β有相似之处。结论 首次观察到Smad2信号分子在人牙胚发育过程中的表达，Smad2作为TGF－β细胞内信号分子，可能参与上皮－间充质的信号诱导，同时也参与成釉细胞和成牙本质细胞的分化本质细胞原分化以及牙釉质和牙本质的形成。     

人牙乳头细胞内Smad2在TGF—β1信号转导中的作用的研究

目的 观察体外原代培养的人牙乳头细胞内Sad2蛋白的表达,以及Smad2蛋白在转化生长因子-β1信号转导中的作用,探讨Smad2信号途径在TGF-β1调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用机制。方法 原代培养人牙乳头细胞,Western blot杂交方法检测内源性Smad2的表达和TGF-β1调控下的表达变化,用免疫组化方法观察Smad2细胞内定位变化。结果培养的人牙乳头细胞表达Ｓmad2蛋白,ＴＧＦ－β１能引起Ｓmad2从蛋白表达水平未见明显的改变。结论 人牙乳头细胞内存在Ｓmad2基因的表达,Ｓmad2能被ＴＧＦ－β１能引起Smad2从胞浆转位至核内聚集,而BMP-2无此功能;TGF-β或BMP-2刺激作用6h、12h24h和48h,牙乳头细胞内Smad2蛋白表达水平未见明显的改变。结论 人牙乳头细胞内存在Smad2基因的表达,Smad2能被TGF-β1活化后转位至核内发挥作用,但Smad2基因的表达无明显变化,提示TGF-β1在调控牙乳头细胞向成牙本质细胞分化的过程中,Smad2信号途径可能发挥一定的作用。     

RNA干涉法观察成纤维细胞生长因子18对成牙本质样细胞涎磷蛋白表达的影响

目的：通过RNA干涉的方法研究成纤维细胞生长因子18（Fibroblast Growth Factor18．FGF18）对成牙本质样细胞中牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）表达的影响。方法：RNA干涉质粒pH1-siFGF18瞬时转染成牙本质样细胞MDPC-23，RT-PCR检测FGF18和DSPP的表达，观察FGF18低表达对DSPP表达的影响。结果：瞬时转染RNA干涉质粒后，MDPC-23细胞内FGF18表达明显减少，与此同时DSPP的表达量也明显减少。结论：FGF18可以调控DSPP的表达，影响成牙本质细胞的分化。     

TGF-β1对MDPC-23细胞DPP表达调控的体外研究

目的 :研究转化生长因子 β1(TGF -β1)对成牙本质细胞表达DPP的调控作用。方法 :给体外细胞培养的MDPC -2 3成牙本质细胞不同浓度的TGF -β1刺激 ,利用原位杂交的方法观察细胞内DPPmRNA的变化 ,所得结果进行图像分析和统计处理。结果 :TGF -β1刺激前后的成牙本质细胞均表达DPPmRNA ,但刺激后的成牙本质细胞DPPmRNA表达下降 ,不同浓度TGF -β1刺激成牙本质细胞后DPPmRNA表达程度不等。结论 :外源性TGF -β1下调成牙本质细胞表达DPP ,并有浓度差异。     

BMP2作用下人牙乳头细胞内Smad 1 mRNA表达的变化

目的：观察人牙乳头细胞内Smad1 mRNA的表达及在BMP2作用下，细胞内Smad1 mRNA的表达变化，探讨人牙乳头细胞内Smad1信号途径在BMP2调控牙乳头细胞分化中的作用。方法：原代培养的人牙乳头细胞用BMP2处理后，提取总RNA，采用Northern blot法，从mRNA水平观察Smad1基因的表达及含量变化。结果：从mRNA水平观察到Smad1基因在人牙乳头细胞内的表达，但在BMP2作用6、12、24h后，Smad1 mRNA表达量无显著变化。结论：人牙乳头细胞内存在Smad1信号转导途径，牙乳头细胞内Smad1 mRNA表达量不受BMP2调控。     

Cbfa1在Smad3调控牙本质涎磷蛋白基因转录过程中的作用

目的：研究转录因子核心结合因子a1（Cbfa1）在Smad3分子调控牙本质涎磷蛋白（DSPP）基因表达中的作用。方法：培养MDPC-23细胞,通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Cbfa1对TGF-β1调控目的基因dspp转录的影响。结果：Cbfa1可以抑制DSPP启动子的活性,TGF-β1可以降低Cbfa1对DSPP的抑制作用,当Cbfa1与Smad3共同作用于DSPP启动子时,对DSPP转录活性的抑制作用更强。Cbfa1的两个亚型Osf2和PEBP2αA在DSPP转录调控过程中可能发挥的功能不完全一致。结论：转录因子Cbfa1可以与Smad3共同作用,调控DSPP基因启动子的转录表达。     

TGF—β1在修复性牙本质形成早期的基因表达

目的：利用原位杂交技术，观察TGF－β1在大鼠牙髓修复性牙本质形成早期的基因表特征。方法：在Wistar大鼠上下颌第一磨牙近中面制备一单面洞。分别观察3天和15天后处死动物。组织学处理后切片。体外转录合成单链RNA探针并标记地高辛。将标记探针与标本进行原位杂交。利用生物素标记的抗地高辛抗体和SABC标记，DAB显示杂交信号。苏木素复染。结果：TGF－β1mRNA在备洞3天后的成牙本质细胞和成牙本质细胞层下方的牙髓细胞内表达强阳性。15天后，修复性牙本质下方的成牙本质细胞样细胞表达TGF－β1。结论：在牙髓修复早期，TGF－β1通过自分泌途径，参与了修复性牙本质的形成。     

Smad分子在骨形成蛋白2调控成牙本质细胞Ⅰ型胶原基因表达中的作用

目的　研究Smad蛋白在骨形成蛋白 2 (bonemorphogeneticprotein 2 ,BMP 2 )调控小鼠成牙本质细胞系MDPC 2 3内Ⅰ型胶原α2链 [collagenα2 (Ⅰ ) ,COL1A2 ]表达中的作用。方法　细胞免疫组化观察MDPC 2 3细胞内BMP 2细胞内信号分子Smad1、Smad5和Smad6的表达。瞬时转染和报告基因检测观察Smad1、Smad5和Smad6在BMP 2调控COL1A2基因转录中的作用。结果　MDPC 2 3细胞表达Smad1、Smad5和Smad6。BMP 2能诱导含COL1A2基因启动子的荧光素酶报告基因活性。Smad1或Smad5过表达增强BMP 2诱导的COLIA2基因启动子活性 ,而Smad6过表达抑制BMP 2诱导的COL1A2基因启动子活性。过表达Smad1或Smad5突变型载体可以阻断BMP 2的诱导能力。结论　在MDPC 2 3细胞内 ,Smad信号途径存在并发挥功能 ,参与调控BMP 2对COL1A2基因的转录。Smad信号途径可能在BMP 2调控成牙本质细胞分化和牙本质形成过程中发挥重要作用