小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化的形态学观察

目的探讨5-氮胞苷（5-aza）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外诱导作用。方法分离2同龄小鼠胫骨、股骨，冲洗出骨髓，利用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传2代MSCs培养48h后加10μmol／L5-aza进行诱导，3周后刮取贴壁细胞，离心收集，免疫细胞化学检测心肌特异性蛋白α-actin的表达对所诱导细胞进行鉴定，电镜观察细胞超微结构。结果电镜下见胞质内出现大量肌丝，线粒体数量增多，分布在肌丝周围，可见细胞膜电子密度增高的缝隙连接；免疫细胞化学显示α-actin呈强阳性表达。结论MSCs经5-aza体外诱导分化，可获得形态上类似、表达心肌特异性蛋白的心肌样细胞。     

丹酚酸B对大鼠骨髓间充质干细胞分化过程中Desmin、α-actinmRNA表达的影响

[目的]探讨丹参单体丹酚酸B(SalB)在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的情况及Desmin和α-actin mRNA的表达,确定大鼠MSCs体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。[方法]选用成年近交系Wistar大鼠,利用percoll分离液进行密度梯度离心法和直接贴壁法进行分离、提纯MSCs,并进行培养扩增。免疫组化方法对第9代MSCs表面抗原进行鉴定。分别应用10μmol/L5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)及250μg/LSalB联合5-aza(5-aza+SalB)对第9代的MSCs进行联合诱导24h,于诱导后第4周,用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Desmin、α-actin mRNA的表达。[结果]1)第9代MSCs免疫组化染色CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达。2)诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。5-aza组、5-aza+SalB组均出现明确的心肌早期分化基因与5-aza组相比,5-aza+SalB组的Desmin和α-actin mRNA表达明显增强。[结论]SalB具有促进5-aza诱导的MSCs向心肌样细胞分化的作用。     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化观察

目的：探讨5-氮胞苷（5-aza）对纯化培养的骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的影响.方法：取雄性Wistar大鼠下肢长骨骨髓进行体外培养和连续传代,取第3代MSCs以10 μmol/L 5-aza诱导作用24 h后,用含体积分数为5%胎牛血清的完全培养基继续培养,观察细胞形态学变化,并在4周后行免疫细胞化学染色鉴定α-Actin,Desmin及心肌特异性肌钙蛋白T（cTnT）的表达.结果：5-aza作用MSCs 7d后细胞形态及排列发生变化,14～21 d左右细胞数量较诱导前明显减少,28 d后细胞稀落,周围伸出多个长的突起,细胞体积大小不等.经抗α-Actin抗体、抗Desmin抗体、抗cTnT抗体鉴定部分细胞出现阳性染色,阳性细胞率分别为20%,19%和10%.结论：骨髓间充质干细胞在体外特定的诱导条件下可以向心肌样细胞分化,有望成为缺血性心脏病细胞移植治疗的细胞材料.     

丹酚酸B诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的:体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并研究中药单体丹酚酸B诱导MSCs向心肌样细胞分化.方法:用贴壁培养法分离、培养、纯化MSCs,免疫荧光法检测细胞抗原CD44和CD34.分别用含5 μmol/L的5-氮胞苷(5-aza)和30 mg/L丹酚酸B的低糖DMEM培养液培养MSCs 24 h后,RT-PCR法检测培养1,7,14和21 d心肌特异性转录因子NKX2.5,GATA-4和心肌特异性蛋白α-actin mRNA的表达,用免疫荧光法检测诱导后α-actin的表达情况.结果:获得纯化的MSCs,免疫荧光检测细胞表面标记CD44呈阳性,CD34呈阴性.诱导后细胞形态逐渐发生变化.RT-PCR显示NKX2.5和GATA-4 mRNA在MSCs有基础性的表达,而分别以5-aza和丹酚酸B处理24 h后,NKX2.5和GATA-4mRNA表达增强,7 d时表达达高峰,以后维持在高水平,与空白对照组相比,有统计学差异(P＜0.01).未诱导的MSCs α-actin mRNA表达呈阴性,丹酚酸B诱导后的第14日,出现α-actin mRNA的表达.结论:用贴壁培养法可获得纯化的MSCs,丹酚酸B可诱导MSCs向心肌样细胞分化.     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:比较5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)于不同浓度、不同孵育时间对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)向心肌样细胞分化的影响;观察诱导后不同时间点心肌标志物的表达情况.方法:体外分离培养Wistar大鼠MSC,传代纯化后进行诱导实验.浓度分组(C1-C4):分别以3、5、10、20μmol/L5-aza处理24h,之后更换新鲜培养基继续培养.时间分组(T1-T5):以10μmol/L分别孵育6h、12h、24h、48h、72h,之后更换新鲜培养基继续培养.各组均于首次加药4周后行免疫细胞化学染色检测.RT-PCR检测10μmol/L5-aza处理后2、4、8周细胞GATA4mRNA、cTnTmRNA的表达情况.结果:经5-aza诱导处理后4周,C1-C4组Desmin及α-Sarcomeric Actin染色阳性率各组比较均无统计学差异(P＞0.05);而T1-T5各组其阳性率比较存在统计学差异(P＜0.01).RT-PCR显示,诱导后2周,GATA4mRNA开始表达,持续至8周;cTnTmRNA在诱导后2周无表达、4周时弱表达,8周时更为显著.结论:成年人鼠MSC在适当浓度5-aza处理后可以向心肌样细胞分化,在3μmol/L～20μmol/L范围内,5-aza浓度的变化对MSC的分化率影响较小;在48h内,适当延长5-aza的孵育时间可能增加MSC向心肌样细胞的转化率.     

5-氮胞苷诱导骨髓问充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:比较5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)于不同浓度、不同孵育时间对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)向心肌样细胞分化的影响;观察诱导后不同时间点心肌标志物的表达情况.方法:体外分离培养Wistar大鼠MSC,传代纯化后进行诱导实验.浓度分组(C1-C4):分别以3、5、10、20μmol/L5-aza处理24h,之后更换新鲜培养基继续培养.时间分组(T1-T5):以10μmol/L分别孵育6h、12h、24h、48h、72h,之后更换新鲜培养基继续培养.各组均于首次加药4周后行免疫细胞化学染色检测.RT-PCR检测10μmol/L5-aza处理后2、4、8周细胞GATA4mRNA、cTnTmRNA的表达情况.结果:经5-aza诱导处理后4周,C1-C4组Desmin及α-Sarcomeric Actin染色阳性率各组比较均无统计学差异(P＞0.05);而T1-T5各组其阳性率比较存在统计学差异(P＜0.01).RT-PCR显示,诱导后2周,GATA4mRNA开始表达,持续至8周;cTnTmRNA在诱导后2周无表达、4周时弱表达,8周时更为显著.结论:成年人鼠MSC在适当浓度5-aza处理后可以向心肌样细胞分化,在3μmol/L～20μmol/L范围内,5-aza浓度的变化对MSC的分化率影响较小;在48h内,适当延长5-aza的孵育时间可能增加MSC向心肌样细胞的转化率.     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞内向钠电流的研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)诱导分化为心肌样细胞内向钠电流的状态.方法取健康SD大鼠骨髓,经密度梯度离心和贴壁培养获得MSCs,传至第两代,以10 μmol/L的5-氮杂胞嘧啶(5-aza)孵育诱导24h.培养4周,用免疫细胞化学染色方法鉴定心肌样细胞(cardiomyocyte-like cells);用全细胞膜片钳技术,检测胞膜内向钠电流,并与未经诱导的MSCs和急性分离的心肌细胞进行比较.结果MSCs经5-aza诱导后部分表达心肌特异性肌钙蛋白T,在诱导后4周记录到快速激活和失活的膜内向钠电流.与急性分离的心肌细胞比较,相同刺激脉冲下心肌样细胞所产生的电流幅值较小,Ⅰ-Ⅴ曲线向右偏移.结论经5-aza诱导后,MSCs可分化成具有兴奋性内向钠电流的心肌样细胞.     

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:研究体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cells,MSCs) 经5-氮胞苷(5-aza) 诱导定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征?方法:SD大鼠股骨骨髓经密度梯度离心及贴壁分离培养传代MSCs,体外用5-aza定向诱导向心肌样细胞分化?相差显微镜观察心肌样细胞形态学变化?免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达?结果:密度梯度离心及贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖快?5-aza诱导后,部分细胞形态发生变化,有肌管样结构形成?随诱导后培养时间延长MSCs中cTnT?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达逐渐增强?结论:密度梯度离心及贴壁分离培养可获得大量纯度较高的骨髓间充质干细胞?经5-aza诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞?     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

[目的] 探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞 ( MSCs )向心肌样细胞分化的潜能.[方法] 取大鼠下肢骨骨髓,分离培养 MSCs,用 5-氮胞苷 ( 5-aza )定向诱导 24 h,相差显微镜下观察其形态变化,免疫组化法检测肌钙蛋白 ( cTnT )和心肌细胞结蛋白 ( desmin )表达,并通过 RT-PCR对肌球蛋白重链 ( MHC )在细胞中的表达进行鉴定.[结果] MSCs经 5-aza诱导后,部分细胞呈梭形,并可见肌管样结构.免疫组化检测示诱导后 MSCs的 cTnT阳性细胞数为 15%, Desmin表达强阳性, RT-PCR示诱导后 MSCs有 MHC表达.[结论] MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞,是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源.     

小分子水凝胶对大鼠骨髓间充质干细胞心肌分化过程中早期分化基因表达的影响

目的：探讨小分子水凝胶对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）心肌分化过程中早期分化基因Desmin和α-actin的表达影响。方法：流式细胞仪检测鉴定P9MSCs细胞表面标记物,分别应用10μmol／L5-aza（5．aza组）、小分子水凝胶＋5-aza（水凝胶组）对第9代MSCs进行联合诱导24h,诱导4周后,QRT-PCR和Western—blotting法检测Desmin、α—actinmRNA及蛋白的表达。结果：第9代MSCsCD44阳性表达、CD34阴性表达;诱导4周后,5-aza组细胞难以形成球状细胞团,细胞容易脱落,凋亡及死亡细胞较多;水凝胶组细胞死亡少,数量较诱导前增多。细胞之间的分支连接紧密,有聚集生长的趋势,形成球状细胞团块,个别细胞内形成类肌管状结构。5-aza组和水凝胶组心肌早期分化基因Desmin、α-actin均有阳性表达．水凝胶组mRNA及蛋白表达水平均较5-aza组明显增强（P〈0．05）。结论：小分子水凝胶可作为细胞的三维培养支架．有利于MSCs生长,具有促进5-aza诱导的MSCs向心肌样细胞分化的作用。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

肝脏NK/NKT细胞及其生物学意义

对天然杀伤细胞（NK cell）的研究近年受到高度关注。研究发现，肝脏NK/NKT细胞含量在机体天然免疫反应时可增加10倍，可能是机体最大的专职天然免疫的器官，对抵御病理、寄生菌、恶性转化细胞等的侵害具有十分重要的意义。本文就肝脏NK/NKT细胞的功能特点和生物学特性、当前的研究进展及热点问题以及进一步研究的思路和切入点作一述评。     

Periodontal ligament stem cells improve peripheral blood mononuclear cells differentiation into osteoclast-like cells

目的 研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制.方法 有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞.建立直接共培养和Transwell间接共培养体系.实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1 ×10-8 mol/L)和前列腺素E2(1×10-6 mol/L).采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞( osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能.结果 各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P＜0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P＜0-01).结论 牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显.     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986