优化的套式核酸体外扩增方法用于甲型流感病毒快速诊断的研究

目的临床上对流感的有效控制与治疗在于实验室快速与准确的诊断,这对于指导用药和避免滥用抗生素具有重要意义。RT_PCR在流感病毒检测中特异性和灵敏度较强,nestedmultiplexRT_PCR法可以在此基础上提高灵敏度。实验的目的是应用分子生物学方法对流感病毒进行快速诊断。方法我们结合流感病毒M基因、NS基因、HA基因的结构和进化特性设计多元引物达到流感病毒的型和亚型准确与快速的鉴定。结果甲型流感病毒以M基因保守区域设计引物,PCR后电泳带为413bp;甲型流感病毒以HA基因分亚型,H1N1亚型PCR后电泳带为348bp,H3N2亚型PCR后电泳带为291bp,H5N1亚型PCR后电泳带为326bp。结论应用优化的套式核酸体外扩增方法进行流感病毒的型与亚型的诊断是比较快速的,且所需要的病毒量少(0.01～0.1TCID50),灵敏度较高。     

甲型H1N1流感病毒抗原HA基因进化分析

目的 分析甲型H1N1流感病毒抗原HA基因的突变和分子进化树.方法 由河南省各市(地)疾病预防控制中心和流感监测哨点医院采集流感患者咽拭样本,从咽拭样本中分离甲型H1N1流感病毒毒株,选择20株提取病毒RNA,设计引物运用逆转录-聚合酶键反应(RT-PCR)技术扩增编码HA蛋白的基因序列,测序分析核酸和编码的蛋白序列突变位.结果 分离到51株新型H1N1流感病毒;扩增20株HA编码基因,18株成功扩增到HA编码基因,2部分基因片段分别为1 024 bp和654 bp,与预期大小相符;BLAST分析结果显示,在中国多个地区分布有甲型H1N1流感病毒HA基因433 T/C(N端145 S/P)突变株,进化树分析结果显示,这一位点的突变有可能是来自于猪-人之间相互感染.结论 甲型H1N1流感病毒抗原HA基因在中国内地传播期间个别氨基酸位点发生了突变,但是抗原性未改变.     

新型甲型H1N1流感病毒的实验室检测

目的利用RT-PCR技术,建立并优化快速、敏感、特异的检测新型甲型H1N1流感病毒的方法,并进行初步应用。方法设计高度特异性引物,优化常规RT-PCR和Real-time Fluores-cent Quantitative PCR反应体系,并对2009年惠州市流感样病例咽拭子标本进行甲型H1N1流感病毒RNA的检测。结果荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR方法均有较高的特异性,与季节性H1N1、H3N2和B型流感病毒等无交叉反应,两种PCR检测结果的一致率达到99.5%以上,均能快速准确检测出患者咽拭子标本的甲型H1N1流感病毒,且荧光定量RT-PCR最低模板检测限在0.5pg以下。结论常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR不仅特异性高,而且比病毒分离法更敏感、简便和快速,适合甲型H1N1流感病毒的快速检测,为早期诊断、定量分析甲型H1N1流感病毒感染程度奠定基础。     

2005年-2009年大连市季节性甲型H1N1流感病毒HA基因序列分析

目的:分析大连市2005年-2009年流感病毒H1N1亚型血凝素抗原性及其基因变异情况,为流感防治提供技术支持。方法:采集流感样病例的鼻咽拭子标本,用MDCK细胞进行流感病毒的病原分离,采用红细胞凝集实验测定病毒的滴度,用血凝抑制试验和RT-PCR进行流感病毒型别鉴定,通过RT-PCR扩增血凝素HA片段的基因,电泳、纯化后进行基因序列测定,利用生物信息学进行序列分析。结果:2005年-2009年共分离到季节性甲型H1N1流感病毒39株,其中28株进行了测序。与当年的疫苗株相比,2005年、2006年、2007年和2008年分离株的HA1区分别发生了11个、9个、15、15个突变。结论:在近几个年度的流行季节中,该地区有H1N1亚型流感的存在。该地H1N1流感病毒分离株有多处氨基酸发生替换,氨基酸的替换导致毒株的抗原性发生了漂移。     

甲型H1N1流感病毒real-time RT-PCR检测方法的研究与应用

[目的]建立一种特异、灵敏、快速的Real-Time RT-PCR方法用于检测甲型H1N1流感病毒核酸.[方法]采用WHO所推荐的引物与探针序列,对Real-Time RT-PCR反应体系和反应条件进行调整优化,检测该方法的特异性和灵敏度.并对疑似甲型H1N1流感病例咽拭子标本进行检测.[结果]该方法对甲型H1N1流感病毒的检测的灵敏度达10-7(HA滴度为1:128),可从疑似甲流感患者咽拭子中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右.[结论]建立的TagMan探针法Real-Time RT-PCR是一种检测甲型H1N1流感病毒的快速、特异、敏感的新方法,适合于基层疾控机构及医院开展甲型H1N1流感的应急检测.     

新甲型H1N1流感与中国甲型H1流感HA基因进化比较研究

目的比较新甲型H1N1流感与中国甲型H1亚型流感病毒HA基因的进化。方法用非度量多维尺度法分析下载自GenBank的中国人和猪甲型H1亚型流感HA序列及WHO北半球流感疫苗推荐株HA序列和新甲型H1N1流感HA序列,构建HA基因进化图谱。结果新甲型H1N1流感病毒HA基因与猪甲型H1亚型流感病毒的亲缘关系较近,而和中国人甲型H1亚型流感病毒及WHO近年推荐的疫苗株亲缘关系很远,并且新甲型H1N1流感病毒HA序列在进化上与中国猪甲型H1亚型流感病毒仍然存在一定距离。结论从基因层面上提示我国人群既往免疫和疫苗对新甲型H1N1流感可能不能提供有效保护,病毒有可能会在人群中流行。同时分析结果提示了尚无证据表明这次始于北美的新甲型H1N1流感来自中国。     

2017年云南省流感病毒监测及甲型H1N1流感病毒血凝素基因特征分析

目的 了解2017年云南省流感病毒的流行情况和甲型H1N1流感病毒的血凝素（HA）基因分子特征。方法 对2017年云南省流感监测哨点医院采集的21 672份标本使用real - time RT - PCR方法检测流感病毒,核酸阳性标本使用MDCK细胞进行病毒分离,采用血凝素凝集试验及抑制试验进行病毒抗原性分析。选取12株抗原性变异较大的甲型H1N1流感毒株进行基因测序,使用MEGA软件分析其HA基因特征。结果 2017年共检出流感核酸阳性标本2 372份,分离出流感毒株1 180株,全年共有2个流行高峰,H3亚型和甲型H1N1亚型交替成为优势株,BY亚型和BV亚型共同流行。毒株分离高峰与ILI%高峰基本一致。甲型H1N1流感病毒ＨＡ基因无明显变异,疫苗株仍具有保护作用。结论 继续加强监测力度,提高监测敏感性并做到及时预警,控制流感流行风险。     

甲型流感病毒的分离及HA基因的序列分析

目的 分离临床流感患者的甲型流感病毒及对其HA基因进行序列测定,分析HA基因是否存在变异.方法 采用流感病毒的增殖、血液凝集实验、RT-PCR、蓝自筛选、酶切、DNA序列测定方法,获得甲型流感病毒HA基因的序列,进行序列分析.结果 甲型流感病毒HA基因RT-PCR的电泳条带为1700bp;酶切后电泳条带为1700bp和3000bp;并获得甲型流感病毒HA基因的序列.结论 从临床流感患者分离的流感病毒H1N1/H3N2其HA序列与以往的流感病毒序列无明显差异.     

亳州市2013年甲型H1N1流感病毒基因分析

目的分析亳州市2013年一所学校流感暴发疫情甲型H1N1流感病毒基因及抗原变异情况。方法从132名具有流感症状的学生当中随机采集10份标本,用Realtime RT-PCR方法鉴定甲型H1N1流感病毒,对阳性标本接种MDCK细胞,分离流感病毒,并对甲型H1N1流感病毒株进行血凝素（HA）作基因测序,分析基因及氨基酸位点变异情况。结果 10份标本中Realtime RT-PCR鉴定有8份为甲型H1N1流感病毒核酸阳性,病毒分离培养6份阳性,并对其进行基因测序,HA基因与疫苗株同源性为98.4%,HA基因氨基酸变异分析显示,有多个位点发生变异。结论此次暴发的甲型H1N1流感病毒的基因组HA序列与我国及其他国家的甲型H1N1流感病毒具有较高的同源性,HA基因氨基酸序列发生变异情况,需密切关注甲型H1N1的流行状况。     

焦磷酸测序技术在检测甲型H1N1血凝素基因裂解位点突变中的应用

目的基于焦磷酸测序技术建立甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因裂解位点突变的快速检测方法,探讨其临床应用价值。方法采用RT-PCR扩增甲型H1N1病毒血凝素基因中的HA片段,在生物信息学分析的基础上,针对甲型H1N1病毒血凝素基因含有裂解位点序列片段,分别设计一套生物素标记的PCR引物和测序引物,运用焦磷酸测序技术对含甲型H1N1病毒裂解位点基因片段进行序列测定,同时分析青岛地区甲型H1N1流感病毒流行株的裂解位点基因特征。结果建立了基于焦磷酸测序技术检测甲型H1N1流感病毒裂解位点突变方法,实现甲型H1N1流感病毒HA基因裂解位点的高通量检测,青岛地区甲型H1N1流感病毒裂解位点344氨基酸序列没有发生变异。结论本研究所建立的方法具有自动化程度高和结果准确等特点,适用于甲型H1N1流感病毒裂解位点进行快速高通量检测。     

荧光定量RT-PCR快速检测N_2亚型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立快速检测甲型流感病毒N2亚型的方法。方法根据N2亚型流感病毒HA基因的相对保守序列,分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立、优化反应体系后,采用十倍稀释法检验建立体系的灵敏度并建立相对定量标准曲线;采用N1亚型毒株核酸进行方法特异性检验并对临床疑似流感样病例样本进行检测。结果N2亚型流感病毒的检测灵敏度为2.56×10-6,扩增效率为99.9%,标准曲线r=0.997,特异性为100%。临床ILI样本检测结果与HAI鉴定结果相符。结论本研究建立的荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确的检测N2亚型流感病毒。     

2009年-2011年铁岭市流感样病例病原学监测结果分析

目的:通过流感样病例监测,及时准确对流感病毒进行核酸检测及分型鉴定,快速筛查出甲型H1N1流感病毒,为临床治疗和预防控制提供依据。方法:采集2009年-2011年哨点医院的流感样病例咽拭子标本,采用RT-PCR方法检测流感病毒核酸并进行分型鉴定,再对甲型阳性标本采用Real-time RT-PCR方法筛查出甲型H1N1流感病毒。结果:2009年9月-2011年3月共采集流感样病例标本1292份,核酸阳性标本有110例,经RT-PCR分型鉴定甲型流感病毒71例,占64.55%(H1N1亚型2例占1.82%;H3N2亚型43例占39.09%;SWH1N1亚型26例,占23.64%),乙型流感病毒39例,占35.45%。结论:铁岭市2009年9月-2011年3月流感流行期主要以甲型H3N2亚型为主,并在流感样病例监测中检测出引起世界大流行的新型毒株甲型H1N1型,因此应加大对流感样病例监测检测力度,防止疫情的扩散。     

四川省甲型H1N1流感病毒血凝素基因特性和抗原性分析

目的 了解四川省甲型H1N1流感病毒的抗原性和血凝素(HA)基因的变异情况.方法 对四川省2009-2011年分离的流感病毒采用单项血凝抑制试验鉴定毒株型别,在此基础上选取分离自中国内地首发甲型H1N1流感病例、首起甲型H1N1流感疫情、甲型H1N1流感死亡病例以及哨点医院流感样病例标本的甲型H1N1流感病毒株共计11株,进行HA基因核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后进行基因特征分析.结果 与中国代表株A/四川/SWL1/2009(H1N1)相比,2009-2011年四川省甲型H1N1流感毒株单项血凝抑制效价均无4倍以上差异,与疫苗株A/California/7/2009(H1N1)相比,HA氨基酸具有高度同源性(96.6％ ～99.4％).结论 四川省甲型H1N1流感病毒的HA基因特性和抗原性没有发生明显变异.     

含甲型H1N1流感病毒HA基因序列病毒样颗粒的制备

[目的]构建耐RNase酶的内含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒。[方法]构建中间载体pET32a-MS2,将甲型H1N1流感病毒的HA基因片段连接中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒,对病毒样颗粒进行荧光定量RT-PCR检测和稳定性实验。[结果]表达载体经PCR、酶切鉴定分析后证实构建成功,荧光定量RT-PCR实验表明该病毒颗粒含有HA基因片段并且颗粒稳定性良好。[结论]成功构建了含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒且稳定性良好,有望作为甲型H1N1流感病毒RNA检测的标准品和质控品。     

泉州市2009年甲型H1N1流感基因特性分析

目的 了解福建省泉州市2009年甲型H1N1流感病毒的HA和NA基因特征,探讨该病毒的遗传变异及分子特性.方法 采集泉州市甲型H1N1流感患者咽拭子,采用实时荧光聚合酶链反应方法检测病毒核酸及MDCK细胞培养进行病毒分离、鉴定,提取其中2株代表性毒株病毒核糖核酸(RNA),采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒HA和NA基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,用DNAstar megalign软件进行序列分析.结果 1 020份咽拭子检出甲型H1N1流感病毒核酸阳性200份;季节性流感病毒核酸阳性70份,其中H3N2亚型53份,H1N1亚型14份,B型3份,并分离到29株甲型H1N1流感病毒株;HA基因核苷酸序列测定显示,该毒株与北美流行株高度同源,由HA基因核苷酸序列推导的氨基酸系列与疫苗株A/Brisbane/59/2007比较,有22个位于抗原决定簇的氨基酸位点发生变异,但受体结合特异性仍为人样受体,NA基因耐药性位点分析显示,对达菲药物依然敏感.结论 2009年泉州市甲型H1N1流感流行毒株与北美流行株高度同源,相对于疫苗代表株出现了HA蛋白抗原性漂移.     

2008-2012年江西省甲型H3N2流感病毒HA1基因特征及与疫苗株差异分析

目的掌握2008-2012年江西省甲型H3N2亚型流感病毒HA1基因特征,在分子水平了解WHO甲3型疫苗推荐株对江西省甲3亚型流感病毒预防效果。方法采集监测医院和疑似流感疫情的流感样病例鼻咽拭子标本进行流感病毒分离,对分离到的甲3型流感病毒毒株进行核酸的提取,扩增病毒HA1基因后进行核苷酸序列测定并对HA1基因特性进行分析。结果 2008-2012年共分离到甲3型流感病毒553株,对其中23株毒株进行HA1基因序列测定,各年份的毒株HA1序列分别与当年WHO对北半球推荐的疫苗株进行比对,结果为2008-2012年氨基酸同源性分别为98.4%~99.1%、96.6%~98.4%、97.2%~98.4%、96.2%~97.2%和96.6%~98.1%;抗原决定簇区氨基酸平均变异数分别为1.3个、3.2个、1.4个、3个和2.5个;其中2009年有3株在2个抗原决定簇区发生了4~5个的氨基酸替换。结论2008-2012年甲型H3N2亚型流感病毒分离株HA1基因在不断发生变异,疫苗对我省2008年度、2010年度和2012年度的甲型H3N2亚型流感保护效果良好,在2011年度保护效果存在滞后现象,对2009年甲型H3N2亚型流感保护效果较差。     

贵州省2009～2011年度新型H1N1流感病毒HA1基因序列分析

目的 建立并完善贵州省新型甲型H1N1流感病毒基因分析检测技术平台,了解2009～2010年度贵州省新型H1N1流感病毒HA1片段与WHO公布的流行株是否有发生变异.方法 收集10株新型H1N1流感病毒毒株,提取病毒核酸RNA,通过RT-PCR扩增HA1片断,用电泳观察PCR产物目的条带的大小,经过纯化、测序,用Biodeit、MEGA4相关软件进行序列比对,同源性及差异性分析,构建系统发育树.结果 与古典猪流感病毒株相比,贵州省2009年、2010年、2011年流感病毒株同源性分别为72.0％～74.6％、72.0％、67.8％～68.3％.与其他4株亚洲株H1N1流感病毒代表株相比,贵州省2009年、2010年、2011年流感病毒株同源性分别为92.3％～95.8％、91.5％～92.4％、89.8％～90.8％.2009年度组内同源性为93.2％～100％; 2010年组内高度同源,为100％; 2011年组内同源性为98.3％.贵州省流感毒株与中俄代表株A/Habarovak/01/2009 (H1N1)的HA1基因同属一个谱系,在同一个分支上,同时,与墨西哥第一株甲型H1N1流感A/Mexio City/001/2009 (H1N1)亲缘关系也较近,在同一个大分支上.结论 贵州省新型H1N1流感病毒代表株HA1基因与WHO公布的流行株在核苷酸水平有一定持续水平的变异.     

安徽省早期甲型H1N1流感病毒的血凝素基因序列分析

目的检测、分析安徽省甲型H1N1流感早期病例的病毒血凝素（HA）基因的序列特征。方法RT-PCR方法扩增我省早期流感样病例的病毒核酸并对其HA基因序列进行分析比对。结果我省早期甲型H1N1流感病例的病毒HA基因与2009年全球流行的甲型H1N1流感病毒高度同源,与古典型猪流感亲缘性较近,与欧洲和亚洲分离的A/H1N1猪流感和A/H1N1禽流感亲缘关系较远。结论我省早期流行的甲型H1N1流感毒株HA基因可能由古典型猪流感进化而来,与WHO选定的甲型H1N1疫苗候选株同源性较高,对于人季节性流感A/H1N1疫苗可能并不敏感。     

2013年崇左市流行性感冒实验室检测结果分析

目的对崇左市2013年流行性感冒(流感)实验室控检测结果进行分析,了解2013年崇左市流感病原学特征,为实验室诊断流感提供参考。方法采集2013年崇左市人民医院及各地送检的流感样病例咽拭子标本912份,应用实时反转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)技术检测样本中的AM、BNS、H1HA、H3HA、SWH1 HA、H5HA、H9HA、H7HA、N9NA基因。结果 912份标本中,检测到乙型流感病毒核酸阳性19份,季节性流感病毒H1亚型核酸阳性0份,季节性流感病毒H3亚型阳性4份,甲型H1N1病毒特异性基因片段阳性58份,季性性H3和甲型H1N1流感病毒核酸同时阳性1份,均未检测到人感染高致病性禽流感中的H5HA、H9HA、H7HA、N9NA基因。甲型H1N1的检出率较高为6.36%(58/912),阳性构成比为70.73%。乙型流感病毒核酸阳性率为2.08%(19/912),季节性H1流感病毒阳性率为0.00%(0/912),季节性H3流感病毒阳性率为0.44%(4/912),季性性H3和甲型H1N1流感病毒核酸同时阳性率为0.11%(1/912)。均未检测出人感染H5,H9,H7N9禽流感病毒。结论甲型H1N1仍是2013年崇左市流感的主要毒株类型,流行趋势以散发为主,较2009年大暴发流行有所下降。     

一起外轮群体性甲型H1N1流感病例的实验室检测及分析

目的分析、溯源一起外籍船员群体性流感的原因。方法结合流行病学调查结果,采集所有船员的鼻咽拭子,处理后利用实时荧光PCR法对样本进行甲型流感、乙型流感、禽流感、甲型H3N2流感及新型甲型H1N1流感的检测;同时对所选样本进行RT-PCR确证检测及HA基因测序分析并构建分子进化树。结果实时荧光PCR检测结果显示,6例患者的甲型流感病毒及新型甲型H1N1流感病毒检测均为阳性,但均未检出乙型流感、禽流感及甲型H3N2流感病毒;RT-PCR确证实验以及HA基因测序结果也表明为新型甲型H1N1流感病毒阳性。结论引起本次群体性流感事件的原因为新型甲型H1N1流感病毒感染。分子进化分析表明,引起本次流感事件的病毒株与从香港分离得到的病毒株属同一分支。