NF-κB p65亚基DNA结合域相互作用多肽的筛选及功能鉴定

目的以NF-κB p65亚基DNA结合域为诱饵蛋白,筛选能够与其发生相互作用的多肽,并鉴定这些多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应。方法首先利用PCR搭桥扩增方法获取NF-κB p65亚基DNA结合域的基因片段,后将其克隆到酵母双杂交pGBKT7DNA-BD载体上,与GAL4DNA-BD融合,形成GAL4DNA-BD/p65BD融合蛋白;再以GAL4DNA-BD/p65BD融合蛋白为诱饵蛋白行酵母双杂交实验,自16肽随机肽库中筛选与NF-κB p65亚基DNA结合域相互作用的多肽;最后选择性人工合成筛选获得的多肽,并进行EMSA实验检测相互作用多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应。结果扩增获得了NF-κB p65亚基DNA结合域的基因片段,并成功构建pGBKT7DNA-BD/p65BD载体。自1.28×107个酵母转化子中最终筛选获得5个阳性克隆,测序结果和同源氨基酸序列比对表明5个阳性多肽为p65BD新型相互作用多肽,其中4条多肽拥有一个共同的基序。EMSA实验结果表明合成的两条多肽对NF-κB的DNA结合活性均具有一定的抑制效应。结论经初筛、复选和假阳性鉴定,自16肽库中获得5个能与NF-κB p65亚基发生相互作用的新型多肽,并已证实其中两条多肽对NF-κB的DNA结合活性具有抑制效应。     

核因子-κB p50亚基同源结构域的克隆鉴定及自主报告基因活性的检测

目的：获得NF-κB p50亚基同源结构域(RHD)cDNA及构建酵母双杂交系统的“饵”载体,并检测靶基因的酵母细胞毒性及自主报告基因的活性。方法：提取人外周血单个核细胞(PBMC)的总RNA,以RT—PCR扩增NF—κB p50亚基RHD基因片段,重组入酵母双杂交载体pGBKT7中。应用乙酸锂法,将重组质粒转化酵母细胞AH109,在SD／-Trp选择培养基上培养,观察转化株的生长情况;用滤膜影印法验证靶基因有无自主报告基因的活性。结果：经酶切及PCR鉴定,重组质粒中插入片段的大小与预期的结果相符。测序结果表明,其基因序列正确,无读码框移位,命名为pGBKT7-p50。转化酵母细胞后,对酵母细胞无毒性也无自主报告基因的活性：结论：pGBKT7-p50可作为酵母双杂交系统中的“饵”载体,用于后续的肽库筛选,捕捉与靶基因相互作用的多肽。     

NF-κB与危重病治疗

核因子 κB (NF κB)为一种参与多种炎症介质基因表达的转录因子。NF κB过度及长时间激活与许多炎性疾病 ,包括脓毒性休克、急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)、缺血及再灌注损伤等有关。为减轻组织和器官损伤 ,NF κB在调控炎症中的重要作用使之成为一个治疗目标。通过基因治疗策略或药物抑制导致NF κB活化中的关键步骤 ,能调控NF κB信号转导。     

NF-κB在急性胰腺炎中的研究进展

NF-κB(转录因子核因子-κB)是一类主要参与机体炎性分子表达调控的转录分子，在急性胰腺炎中，其表达也受到很大的影响，苓主要对近几年NF-κB在急性胰腺炎中的研究作一综述。     

rhGH对Jurkat细胞中NF-κB活性的影响

目的:探讨重组人生长激素(rhGH)对Jurkat细胞核因子-κB(NF-κB)信号通路活化的影响.方法:(1)将含荧光素酶报告基因的质粒pNF-κB-luc转染入T淋巴细胞系-Jurkat E6-1细胞中,在培养液中加入梯度浓度rhGH.(2)用梯度浓度rhGH直接刺激Jurkat细胞,然后用RT-PCR方法检测IκBα、IKK1 mRNA表达情况.结果:各浓度rhGH对转染pNF-κB-luc的Jurkat细胞中荧光素酶表达有促进作用,而对IκBα、IKK1 mRNA表达无显著影响.结论:rhGH对PHA活化的T细胞NF-κB的活化有促进作用,而对与NF-κB活化相关的IκBα和IKK1的mRNA表达无显著影响.     

NF-κB在某些心血管疾病中的作用

核因子-κB(NF-κB)作为一种重要的转录因子在通常情况下对心肌细胞起保护作用,但在不同的刺激下,NF-κB表现出的作用不尽相同。NF-κB参与心血管疾病病理过程的多个环节,包括细胞生存、增殖和分化,调节细胞对各种刺激的反应,如低氧、压力和缺血等。NF-κB在众多心血管疾病如动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、缺血预处理、心肌肥大和心力衰竭等的发生和发展中发挥重要作用。     

核因子κB p65和p50在正常豚鼠耳蜗中的定位表达

目的:研究核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的亚单位p65和p50在正常豚鼠耳蜗中的定位与表达。方法:应用免疫组织化学SP法。结果:NF-κB p65免疫反应活性细胞位于螺旋韧带Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型纤维细胞和根细胞,而螺旋神经节、血管纹和螺旋器均未见染色;NF-κB p50免疫反应活性细胞位于耳蜗螺旋器的内、外毛细胞和支持细胞,此外,螺旋神经节、螺旋韧带和血管纹中也有p50表达,在耳蜗的上述部位中,NF-κB p50免疫染色多位于胞质内,胞核极少。结论:NF-κB p65和p50在正常豚鼠耳蜗的多种细胞中都有表达。     

NF-κB在大鼠CsA肾毒性中的作用

目的探讨NF-κB在环孢素A(CsA)肾毒性中的作用及与TGFβ-1、caspase-3和细胞凋亡的关系。方法Wist-ar雄性大鼠64只随机分成4组:溶剂对照组,二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)组,CsA组,CsA PDTC组。动物每日皮下注射CsA15mg/kg,或溶剂、PDTC各100mg/kg。4周后取肾脏,检测血BUN、Cr、尿NAG酶和尿常规。HE、TUNEL、免疫组化观察。结果光镜下观察到明显的CsA慢性肾损伤。CsA组较其他组血BUN、Cr,尿NAG酶显著增高,尿常规有蛋白尿,尿比重降低;而CsA PDTC组与对照组比较无差异。TUNEL检测到CsA组细胞凋亡及免疫组化检测有NF-κB、TGF-β1和caspase-3的表达。PDTC阻断NF-κB后,TGF-β1和caspase-3表达显著减弱。CsA PDTC组与对照组比较无明显变化。结论CsA可致肾细胞凋亡。阻断NF-κB后凋亡明显减少,肾损伤减轻。提示CsA肾毒性与NF-κB的激活有关。     

NF-κB与炎症相关性肝癌

核因子κB (nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一类重要的转录调节因子，在体内外多种因素的刺激与激活后，可转移到核内参与调节多种基因的转录表达，参与广泛的生物学效应。NF-κB是炎症相关性肝癌的重要调节基因，是促进慢性肝炎向肝癌发展的必要因素之一，因此可作为预防慢性肝炎向肝细胞恶性转化的潜在靶标。     

DST诱导外周耐受小鼠不同组织细胞内NF-κB p65的活性变化

目的:探讨NF-κB在外周耐受发生中的活性改变及其意义。方法:以BALB/c小鼠为供者,输注1×108个供者脾细胞3d和7d的C3H小鼠为受者,建立皮肤移植模型。每天观察移植物的生长情况并于术后第7天取移植皮片和脾脏,通过对移植物的存活时间、组织病理学检查和抗原特异性淋巴细胞增殖试验来了解免疫功能的改变;以免疫组化染色法检测小鼠脾脏和皮肤移植物中NF-κBp65活性的变化。结果:供者特异性脾细胞输注后第7天进行手术,可使皮肤移植物的存活时间延长、抗原特异性淋巴细胞增殖反应明显受抑制;皮肤移植物中NF-κBp65的活性增加,脾脏NF-κBp65的活性降低。结论:输注供者特异性脾细胞诱导的外周耐受,可能与不同部位的免疫细胞内NF-κBp65活性改变有关。     

NF-κB与COX-2的正相互作用诱导子宫颈癌细胞生长及抗凋亡

目的探讨NF—κB和COX-2通路之间的相互作用对人子宫颈癌细胞株（Hela细胞）的生长及细胞凋亡的影响。方法应用细胞计数盒（CCK-8）检测细胞存活率;Hoechst33258核染色检测凋亡细胞的形态及数量的改变：Westernblot法检测Caspase-3、NF-κB和COX-2蛋白的表达。结果应用NF．KB抑制剂（PDTC）或COX-2抑制剂（NS-398）处理Hela细胞36h能明显地抑制细胞存活率,PDTC或NS-398处理Hela细胞24h能明显地促进Caspase-3表达,并增加凋亡细胞数量。PDTC处理Hela细胞能显著地抑制COX-2表达,另方面,NS-398处理Hela细胞能抑制NF-κB的表达。结论NF-κB和COX-2通路之间的正相互作用诱导Hela细胞生长及抑制细胞凋亡。     

NF-κB及其在肿瘤发生发展中的作用

核因子KB（NF-κB）是一组广泛存在于哺乳动物细胞中的转录因子，由Sen等于1986年首先在B细胞中发现。NF-κB除主要参与炎症和自身免疫反应相关的基因调控外，还参与骨的重建以及皮肤附属器官的发生。近些年来，很多研究发现，NF-κB对肿瘤的起源、发展、血管新生和转移及肿瘤细胞凋亡具有重要作用，并与肿瘤细胞耐药性的产生关系密切。因此，NF-κB在癌症发病过程中的作用越来越受到重视。本文对NF-κB的组成、调控、激活等方面及其在肿瘤发生发展过程中的作用作一综述。     

黄芪多糖通过NF-κB诱导巨噬细胞产生NO和TNF-α

Objective To explore the molecular and cell signal transduction mechanism of Astragalus mongholicus polysaccharides (ASP) on macrophage. Methods After stimulating RAW264.7, the change in value of NF-κB was determined by Western blot. The induction of NO and secretion of TNF-α by ASP in macrophage was observed with or without inhibitor of NF-κB using Griess method. Moreover, protein levels of TNF-α secreted by macrophage were investigated with ELISA in respond to ASP. Results 4 h after stimulation by 100 μg/ml ASP, the concentration of NF-κB in nucleus increased significantly, peaked at 6 h. 16 h after stimulation by 100 μg/ml ASP, the activity of iNOS[(23.54±2.41) U/mg protein; P<0.01], producton of NO [(18.9±1.5)μmol/L, P<0.01] and level of TNF-α[(81.2±16.7)pg/ml, P<0.0l] in macrophage were improved markedly. Blocking NF-κB with inhibitor results in decreased levels of NO and TNF-α. Conclusion The results suggest that NF-κB play an important role in induction of NO and TNF-α by ASP in macrophage.     

NF-κB信号通路基本元件调节机制的研究进展

核因子-kappaB（NF-κB）信号通路广泛参与调节免疫反应、炎症反应、细胞分化与凋亡、肿瘤形成等多种生物学功能。在非激活细胞中,NF-κB转录因子通常与其抑制物结合形成复合物,并在胞浆与胞核间达到平衡,但这种复合物主要存在于胞浆中。当受到胞外信号刺激后,复合物可以在NF—κB信号通路的多个信号转导途径中发生降解,使得抑制物从复合物中解离,释放出的大量活性NF—κB迅速转移入核,从而调控相应靶基因的表达。目前发现的和NF—κB的调节紊乱有关的疾病谱在不断扩大,这也使得对于NF—κB信号通路功能和调节的研究得到了深入发展,对通路中一些基本元件的调节也有了较为充分的了解。     

淋巴细胞中NF-κB p65活性水平在Fx1A诱导的口服耐受大鼠中的变化

目的：探讨核因子-κB(NF-κB)p65在口服耐受发生中的活性改变及其意义。方法：雌性Wistar大鼠30只随机分成两组：①口服耐受组，用小剂量(每次8mg／2mL PBS)的Fx1A抗原灌胃。②对照组，用PBS2mL／次灌胃。观察大鼠迟发型超敏反应(DTH)，进行脾淋巴细胞增殖试验，了解大鼠免疫功能的改变。以免疫组化和ELISA法，检测大鼠淋巴组织中NF-κB p65的活性及TGF-β1的表达。结果：与对照组相比较，口服耐受组大鼠DTH和抗原特异性淋巴细胞增殖反应明显受抑制；肠黏膜Peyer’s淋巴结(PP结)中NF-κB p6S的活性及TGF-β1的表达明显增加。脾淋巴组织中NF-κB p65的活性降低，但TGF-B1的表达明显增加。结论：低剂量Fx1A抗原诱导的口服耐受的发生，可能与不同部位免疫细胞内NF-κB p65的活性改变有关。     

NF-κB/IκB信号通路在乙型肝炎病毒相关性肾炎肾组织中的表达

目的探讨核转录因子-κB(NF-κB)/IκB在乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBVGN)肾组织中的表达及其在HBVGN发病机制中的可能作用。方法采用免疫组化染色法,检测42例HBVGN、20例原发性膜性肾病及5例正常肾组织中NF-κBp65、IκB-α蛋白的表达。结果NF-κBp65蛋白在HB-VGN组织中的表达,明显高于在原发性膜性肾病(P<0.01)及正常肾组织(P<0.05)中的表达,且细胞核和细胞质中都可检测到NF-κBp65的表达;相反IκB-α在HBVGN组织中的表达低于原发性膜性肾病肾组织(P<0.05)。结论HBVGN肾组织可能有IκB-α蛋白降解及NF-κB核转移。NF-κB/IκB可能参与了肾组织的病理损害过程。     

GST Pull-down实验鉴定NF-κB相互作用多肽

目的 体外鉴定NF-κB相互作用多肽与p50和p65间的相互作用。方法 首先构建GST-作用多肽融合蛋白的原核表达载体pET-42a/polypeptide及NF-κB p50和p65亚基保守结构域的原核表达载体pET22b／p50和pET22b／p65，并在大肠杆菌E．coli BL-21中诱导表达，后进行GST pull-down实验验证多肽与NF-κB p50和p65的结合效应。结果 经诱导表达获得了可溶性的GST-多肽融合蛋白和具有DNA结合活性的p50、p65蛋白，GST pull-down实验证实3条多肽与p50发生特异地相互作用。结论 证实3条多肽在体外能与p50发生物理性的相互作用，这为获得靶向NF-κB的功能拮抗多肽工作奠定了基础。     

黄芪多糖通过NF-κB诱导巨噬细胞产生NO和TNF-α

Objective To explore the molecular and cell signal transduction mechanism of Astragalus mongholicus polysaccharides (ASP) on macrophage. Methods After stimulating RAW264.7, the change in value of NF-κB was determined by Western blot. The induction of NO and secretion of TNF-α by ASP in macrophage was observed with or without inhibitor of NF-κB using Griess method. Moreover, protein levels of TNF-α secreted by macrophage were investigated with ELISA in respond to ASP. Results 4 h after stimulation by 100 μg/ml ASP, the concentration of NF-κB in nucleus increased significantly, peaked at 6 h. 16 h after stimulation by 100 μg/ml ASP, the activity of iNOS[(23.54±2.41) U/mg protein; P<0.01], producton of NO [(18.9±1.5)μmol/L, P<0.01] and level of TNF-α[(81.2±16.7)pg/ml, P<0.0l] in macrophage were improved markedly. Blocking NF-κB with inhibitor results in decreased levels of NO and TNF-α. Conclusion The results suggest that NF-κB play an important role in induction of NO and TNF-α by ASP in macrophage.     

大鼠硅肺纤维化中NF-κB和MMP-9的表达

目的 研究核转录因子-κB(NF-κB)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达在硅肺纤维化发生发展中的作用。方法 应用免疫组化SP法观察NF-κB和MMP-9在大鼠硅肺组织中的表达。结果 对照组支气管上皮细胞、肺巨噬细胞和肺间质细胞均可表达NF-κB和MMP-9，肺泡上皮细胞和血管内皮细胞未见表达。实验组的支气管上皮细胞、肺巨噬细胞、间质细胞和肺泡上皮细胞NF-κB、MMP-9表达均明显增加。在实验的每一个时间点，肺巨噬细胞、肺间质细胞中NF-κB和MMP-9的半定量表达基本同步，呈明显正相关。支气管上皮细胞NF-κB在1～28d均呈持续高水平表达，但MMP-9在14d后开始减少；肺泡上皮细胞NF-κB在114d呈较高水平表达，以后下降，而MMP-9仅于第3～7天时有阳性表达。结论 矽尘作用下肺内多种细胞NF-κB和MMP-9表达增加，并可能通过NF-κB介导调控MMP-9表达而影响硅肺的发生发展。