不同浓度淫羊藿苷对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响

目的：观察不同浓度淫羊藿苷对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化及功能的影响。方法：利用酶消化法从新生小鼠颅盖骨中分离和培养成骨细胞;用组织化学染色和矿化结节法进行细胞鉴定;用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测不同淫羊藿苷浓度对大鼠成骨细胞的增殖、分化作用;同时通过检测成骨细胞碱性磷酸酶的活性,以观察淫羊藿苷对成骨细胞功能的影响。结果：与各浓度组比较,10μg/L淫羊藿苷对成骨细胞的生长增殖、分化均有促进作用,且作用最强,最为持久。结论：浓度为10μg/L的淫羊藿苷能显著促进成骨细胞增殖,并增强其成骨活性。     

川续断总皂苷对大鼠成骨细胞增殖、分化及OPG/RANKL mRNA表达的影响

目的研究川续断总皂苷对大鼠成骨细胞增殖、分化及护骨素/核因子κB受体活化因子配体(OPG/RANKL)mRNA表达的影响。方法不同浓度的川续断总皂苷作用于体外培养的大鼠成骨细胞不同时间,采用MTT法检测成骨细胞增殖功能,PNPP法检测成骨细胞中ALP活性,半定量RT-PCR法检测成骨细胞中OPG/RANKL mRNA。结果 20、50μg/mL川续断总皂苷可显著促进成骨细胞的增殖(P0.05或P0.01);20、50μg/mL川续断总皂苷可显著促进成骨细胞的分化(P0.05或P0.01);10、20、50μg/mL川续断总皂苷可显著上调成骨细胞中OPG/RANKL mRNA的比值,抑制破骨细胞的分化(P0.01)。结论川续断总皂苷对体外培养的大鼠成骨细胞的增殖、分化及破骨细胞的分化有显著影响。     

淫羊藿提取液与雌二醇联合用药对大鼠成骨细胞的作用

目的 观察淫羊藿提取液（Epimedium Extract, EE）和雌二醇（17β- Estradiol, E2）联合使用对体外培养大鼠成骨细胞增殖和分化的影响。方法 用酶消化法分离新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞。用基础培养基培养3d后获得未分化成骨细胞（undifferenciation osteoblast,udOB）,继续用条件培养基培养3d定向诱导分化为成骨细胞（differenciation osteoblast, dOB）,分别以低剂量（1mg/L）、中剂量5mg/L）及高剂量（10mg/L）EE与10μM E2联合干预48h,检测细胞增殖率、碱性磷酸酶（Alkline phosphatase,AKP）比活性及骨连接素（osteonectin,ON）基因mRNA水平。结果 对udOB,高剂量联用组的增殖率及各联用组的AKP活性显著高于其它组,但ON的mRNA水平没有显著性差异;对dOB,高剂量联用组的增殖率也明显高于其它组,但各联用组的AKP活性较对照组降低,而ON的mRNA水平上调。结论 EE和E2联合使用,较低剂量EE即有协同促进成骨细胞增殖作用,但高剂量EE的协同促增殖效应更强,而协同促分化作用主要表现在成骨细胞的分化早期,对分化成熟的成骨细胞有促成骨作用。     

丹参对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响

目的：了解丹参对SD大鼠成骨细胞增殖和分化的影响。方法：取新生的SD大鼠头盖骨，胶原酶法培养成骨细胞，用MTT法来测定不同浓度丹参对体外培养成骨细胞在24、48、72h不同时段的促细胞增殖作用；采用碱性磷酸（ALP）活性观察上述药物的促细胞分化作用。结果：0．05％、0．10％、0．15％的丹参可促进成骨细胞增殖率提高（P〈0．05）；不同浓度丹参可使碱性磷酸酶（ALP）活性增强（P〈0．05）。结论：丹参具有促进成骨细胞增殖及分化的作用。     

醛固酮对成骨细胞增殖分化及成骨相关基因表达的影响

目的 探讨外源性醛固酮对大鼠原代培养的成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性及成骨相关基因表达的影响及其机制.方法采用酶消化法体外培养大鼠成骨细胞,CCK-8试剂盒和AKP试剂盒分别检测成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶活性情况,半定量RT-PCR和Western blotting检测成骨细胞骨形成活性相关标志物和上皮钠离子通道(α-ENaC)基因的mRNA和蛋白表达.结果与对照组相比,醛固酮浓度为1×10-2~1μmol/L范围内可以促进成骨细胞增殖,浓度为1×10-3μmol/L和10μmol/L时对成骨细胞增殖无显著影响;但醛固酮在1×10-3~10μmol/L浓度范围内对成骨细胞碱性磷酸酶活性均无明显影响.与对照组相比,醛固酮浓度为1×10-2~1μmol/L时均能上调成骨细胞中成骨细胞骨形成活性相关标志物I型胶原蛋白(Coll-Ia)、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)和α-ENaC基因的mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05).结论醛固酮(1×10-2~1μmol/L)能明显促进成骨细胞增殖并上调成骨细胞骨形成活性相关标志物的表达,且同时上调ENaC基因的表达,提示ENaC可能是醛固酮调节成骨细胞功能的作用靶点之一.     

续断苷对人成骨细胞增殖和分化作用研究

目的:观察续断苷对体外培养人成骨细胞的增殖和分化的影响。方法:取人髂骨松质骨分离培养成骨细胞,传代后用含续断苷的培养液培养,用MTT方测定成骨细胞的增殖,并测定碱性磷酸酶(ALP)的活性。结果:浓度为1,10,100μg/ml的续断苷培养液促进成骨细胞的增殖;浓度为10,100μg/ml的续断苷培养液促进成骨细胞碱性磷酸酶分泌。结论:续断苷在一定浓度范围内促进人成骨细胞的分化与增殖。     

实时荧光定量PCR法研究葛根素对成骨细胞TGF-β1及Smad2/3mRNA表达的影响

目的：检测葛根素对成骨细胞TGF-β1及Smad 2/3mRNA表达的影响,从分子生物学层面探讨葛根素治疗骨质疏松症的机理。方法：取小鼠胎鼠成骨细胞进行体外培养,以三种浓度1、0.1、0.01μg/mL的葛根素液进行干预,同时设置空白对照组,分别采用碱性磷酸酶（ALP）法检测成骨细胞活性,实时荧光定量PCR法检测葛根素干预液对成骨细胞TGF-β1及Smad 2/3mRNA表达变化的影响。结果：不同浓度葛根素干预液均能够增加成骨细胞内碱性磷酸酶的活性,并且呈浓度依赖性,实时荧光定量PCR结果显示成骨细胞内TGF-β1及Smad 2/3mRNA的表达明显高于阴性对照组（具有统计学差异P〈0.05）。结论：表明葛根素可刺激成骨细胞信号转导蛋白Smad2/3mRNA的表达和刺激TGF-β1的分泌和合成,从而促进骨形成,抑制骨吸收。可能是其有效防治骨质疏松症的疗效机理。     

MAPK-ERK1/2信号通路调控成骨性基因表达和细胞增殖

目的观察在不同浓度大鼠血清作用下,激活或抑制MAPK-ERK1/2信号通路对大鼠成骨细胞的成骨性基因表达和增殖
的影响。方法原代培养大鼠成骨细胞,进行形态和碱性磷酸酶初步鉴定后,分别用1%和5%的大鼠血清进行培养24 h,WB检
测MAPK-ERK1/2信号通路蛋白p-ERK1/2和ERK1/2表达,同时检测成骨性基因（Runx2、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶）和增殖蛋白
PCNA的表达;MAPK-ERK1/2信号通路阻断剂PD0325901抑制P-ERK1/2的表达后观察对Runx2、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶和增
殖蛋白PCNA的表达。结果5%大鼠血清激活p-ERK1/2水平明显高于1%大鼠血清（P<0.05）,在MAPK-ERK1/2高水平激活状
态下,成骨性基因如Runx2、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶的表达水平出现显著的增加及促进PCNA的表达;当抑制MAPK-ERK1/2
信号通路时,成骨性基因Runx2、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶的表达水平也随之下调,且PCNA 表达也受到抑制。结论激活
MAPK-ERK1/2通路促进成骨基因表达和成骨细胞增殖,抑制此通路将抑制成骨性基因表达和细胞增殖,此通路可能作为治疗
骨质疏松症的药物靶点。
     

利福平抑制地塞米松诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的机制研究

目的 明确利福平对糖皮质激素诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stroma cell, BMSC)成脂分化的作用。方法 体外培养Sprague-Dawley大鼠BMSC并随机分为4组: 5μg/ml利福平+10-6mol/L地塞米松(A),PBS+10-6mol/L地塞米松(B),5μg/ml利福平(C)和PBS(D)。分别应用罗丹明123结合流式细胞仪方法和酶联免疫吸附法检测5μg/ml利福平对BMSC的P糖蛋白活性和胞内地塞米松蓄积浓度影响。各组孵育14d后,分别进行油红O染色和碱性磷酸酶染色,定量检测三酰甘油含量、碱性磷酸酶活力、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ) mRNA和Runt相关转录因子2(Runx2)mRNA表达。结果 利福平减少BMSC胞内罗丹明123强度和胞内地塞米松蓄积量(P＜0.01)。B组诱导BMSC成脂分化、PPARγ mRNA表达增加和三酰甘油含量升高。A组、C组和D组BMSC未发生成脂分化,PPARγ mRNA表达增加和三酰甘油含量无统计学差异。A组BMSC碱性磷酸酶活性和Runx2 mRNA表达最强(P＜0.01),B组碱性磷酸酶活性和Runx2 mRNA表达下降(P＜0.01)。结论 利福平上调BMSC的P糖蛋白活性,抑制糖皮质激素诱导的成脂分化。     

蜂胶黄酮对大鼠颅骨成骨细胞增殖分化及BMP2表达的影响

目的 探讨蜂胶黄酮对体外培养大鼠颅骨成骨细胞增殖分化以及骨形态发生蛋白2(BMP2)表达的影响.方法 提取新生大鼠颅骨成骨细胞制作体外培养模型,用不同浓度的蜂胶黄酮刺激分离培养的大鼠成骨细胞,然后用噻唑蓝(MTT)法测定蜂胶黄酮对体外培养成骨细胞的增殖作用,用氨基安替吡啉测酚法测成骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性,并通过免疫组织化学方法 观察成骨细胞BMP2的表达.结果 添加蜂胶黄酮体外培养24 h后,100μg/L剂量组较对照组有明显的提高;48 h后,5、10和100μg/L剂量组与对照组比,增殖率均显著提高;添加蜂胶黄酮的中剂量组和高剂量组的BMP2表达在24 h和48 h都显著高于零剂量组.培养72 h后,10、50和100μg/L剂量组与对照组比,增殖率均有明显的提高;50μg/L和100μg/L剂量组与对照组相比ALP活性均显著性提高.结论 蜂胶黄酮可以增加成骨细胞的增殖和分化,促进骨组织的形成,可用来预防骨质疏松症.     

葡萄糖、胰岛素对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的 观察不同浓度葡萄糖及胰岛素(INs)对骨髓间充质干细胞(BMSC)向成骨细胞(OB)分化能力的影响,探讨葡萄糖及INs对骨代谢的作用机制.方法 采用体外细胞培养技术自大鼠股骨和胫骨中分离BMSC进行纯化,培养,然后在成骨培养基中诱导BMSC分化为OB,并用不同浓度的葡萄糖(5.6、25、50 mmol/L)及加或不加INs(0.6 μg/ml)干预诱导过程,光镜下观察茜素红染色分化后的OB钙结节的细胞比例.Realtime PCR测定OB的标记物碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)及转录因子Runx2 mRNA表达.结果 随着糖浓度升高,茜素红染色红色钙结节数目明显减少,PCR结果显示ALP,BGP及Runx2 mRNA表达也明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).提示随着糖浓度增加成骨分化逐渐减少,在同等糖浓度下,加入INs干预组,茜素红染色阳性细胞计数明显增加,PCR结果ALP,BGP及Runx2 mRNA表达明显升高(P<0.01),提示INs可提高OB分化.结论 葡萄糖呈量效性地抑制BMSC向OB分化,这可能为糖尿病性骨质疏松形成的重要机制之一.INs可促进BMSC向OB分化,并可改善高糖对BMSC向OB分化的抑制作用.     

微囊化成骨细胞诱导骨髓间充质干细胞体外成骨分化的量效研究

目的探讨微囊化成骨细胞体系细胞添加量对诱导骨髓间充质干细胞体外成骨分化的影响。方法制备含有成骨细胞的海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊,与间充质干细胞的共培养,在1,7,14 d通过细胞增殖量、碱性磷酸酶活性、实时定量PCR等检测,统计结果并分析。结果各时段细胞增量无统计学意义;碱性磷酸酶活性随细胞浓度增加表现出递增趋势,且骨钙蛋白mRNA的表达结果基本一致。结论微囊化成骨细胞在低浓度下已能促进骨髓间充质干细胞成骨分化,浓度升高时促分化能力越强,但达到一定浓度后继续提高时,对成骨分化的作用则不再增强。     

淫羊藿苷对大鼠成骨细胞核结合因子α1、骨形成蛋白-2、骨形成蛋白-4 mRNA表达的影响

目的:研究淫羊藿苷对成骨细胞增殖、分化以及对核心结合因子α1(Cbfαl)、骨形成蛋白-2(BMP2)、骨形成蛋白-4(BMP4)mRNA表达的影响.方法:以酶序列消化法从新生大鼠颅骨分离、培养成骨细胞,采用碱性磷酸酶染色和钙结节茜素红染色法鉴定细胞.取第3-5代细胞,用CCK-8法检测经0 mol/L、10~(-8)mol/L、10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L、10~(-5)mol/L、10~(-4)mol/L的淫羊藿苷处理24、48、72 h后成骨细胞的增殖情况.分别用流式细胞技术和对硝基苯酚法检测上述各浓度的淫羊藿苷处理48 h后成骨细胞的增殖指数和碱性磷酸酶(ALP)活性.用real-timePCR法检测10～(-6)mol/L淫羊藿苷处理48 h后成骨细胞Cbfα1、BMP2和BMP4 mRNA表达的改变.结果:10~(-8)～10~(-4)moL/L的淫羊藿苷对成骨细胞均无增殖促进作用,但可促进成骨细胞的ALP活性;10~(-6)mol/L淫羊藿苷可以上调成骨细胞Cbfα1、BMP2和BMP4 mRNA的表达.结论:淫羊藿苷可能是通过上调Cbfα1、BMP2和BMP4 mRNA的表达而促进成骨细胞的分化.     

葡萄糖对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的体外观察葡萄糖对间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞（OB）分化的影响,探讨其对骨代谢的作用机制。方法从大鼠长骨骨髓分离获取间充质干细胞,在不同糖浓度（5.6mmol/l、25mmol/l、50mmol/l）干预下向成骨细胞诱导分化培养21d;茜素红染色、光镜计数矿化率;realtime PCR测定OB的标记物碱性磷酸酶（ALP）,骨钙素（BGP）及转录因子Runx2 mRNA表达,进行不同糖浓度组干预后的变化比较。结果显示随着糖浓度升高,矿化率显著降低,差异有统计学意义（P〈0.05）。与5.6mmol/l组比较,50mmol/l组的ALP,BGP及Runx2 mRNA表达减少,分别为73%（P〈0.05）、69%（P〈0.05）及70%（P〈0.05）,25mmol/l组的ALP、BGP及Runx2 mRNA表达下降也具有显著性（P〈0.05）。结论高糖抑制BMSCs向OB分化,可能为糖尿病性骨质疏松形成的重要机制之一。     

冲击波对体外培养的鼠成骨细胞增殖分化的影响

目的：探讨冲击波对体外培养的鼠成骨细胞的增殖及分化能力的影响。方法：将原代培养的成骨细胞随机分成冲击波组和对照组,用不同能量（5、10、15、20 kV）冲击波处理后接种于96孔培养板,根据细胞存活率和增殖情况确定最佳的冲击波能量值。将传4代成骨细胞用冲击波处理后,用CCK-8法、细胞分泌碱性磷酸酶试剂盒、茜素红染色对两组细胞增殖及分化进行测定。结果：冲击波处理体外原代培养成骨细胞的最佳能量值为10 kV（500次）,CCK-8法检测显示,冲击波组细胞增殖速度快于对照组（P〈0.001）,细胞分泌碱性磷酸酶高于对照组（P〈0.001）,茜素红染色显示,冲击波组矿化结节面积明显大于对照组（P〈0.001）。结论：最佳能量冲击波可促进成骨细胞的增殖与分化。     

新型多级孔生物玻璃对人成骨细胞增殖和分化的促进作用

目的：探讨一种新型的以地中海海绵为模板合成的多级孔生物玻璃（MBG）对人源性成骨样细胞系MG63增殖和分化的影响,阐明该生物活性玻璃的成骨分化作用。方法：扫描电镜观察MBG材料孔架结构;取对数生长期MG63细胞分别给予MBG浸提液（MBG组）、普通生物玻璃（NBG组）和空白培养基（空白对照组）,共培养1、3和5 d。MTT法检测各组MG63细胞的增殖率,酶联免疫法检测MG63细胞中碱性磷酸酶（ALP）的活性,实时定量PCR法检测培养24h时各组MG63细胞中成骨相关基因Sp7mRNA及Runx2mRNA的相对表达水平。结果：扫描电镜下观察,MBG为多孔支培养架结构;培养1、3和5d时MBG组MG63细胞增殖率高于空白对照组和NBG组（P<0.01）;1、3和5d时,MBG组MG63细胞中ALP活性高于空白对照组和NBG组（P<0.01）;培养24h后MBG组MG63细胞中Sp7 mRNA相对表达水平高于（P<0.01）,但Runx2 mRNA相对表达水平与空白对照组和NBG组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：与NBG比较,该新型MBG具有细胞毒性小和可促进成骨细胞分化的优势。     

不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 研究不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞（orofacial bonemesenchymal stem cells, OFMSCs）增殖和成骨分化的影响。方法 体外分离、培养OFMSCs,成骨、成脂、成软骨分化诱导及鉴定,并使用不同含糖量培养基（5.5、11、16.5、25、44 mmol/L）培养OFMSCs,以5.5 mmol/L基准糖浓度为对照组,其余组为实验组。采用CCK-8及流式细胞仪检测各组OFMSCs的增殖活性及增殖指数,OFMSCs成骨诱导后4、7 d检测碱性磷酸酶（ALP）活性,21 d进行茜素红染色及矿化定量分析,同时用RT-PCR检测3、7、14及21 d相关成骨基因Runx2、Osterix的表达。结果 培养的OFMSCs成骨诱导21 d后茜素红染色可见钙结节,成脂诱导14 d 后油红O染色可见红色脂滴,成软骨诱导14 d 后阿利新蓝染色可见蓝色胞浆;糖浓度在5.5～25 mmol/L促进OFMSCs的增殖,但随着糖浓度的继续增加（25～44 mmol/L）,OFMSCs的增殖活性受抑制;成骨诱导时,随着培养液糖浓度升高,ALP活性呈剂量依赖性降低（P Runx2、Osterix mRNA 表达量高于实验组（P Runx2、Osterix mRNA 表达量均出现先上调再下调的趋势。结论 在一定范围的糖浓度内,糖浓度升高可促进OFMSCs的增殖;而糖浓度升高对成骨分化呈抑制效应。