实验室药品无菌检查能力的验证及结果分析

目的：通过无菌检查能力验证考查实验室无菌检查水平,提升实验室药品无菌检查能力和实验室管理能力。方法：对3次能力验证共计12个样品,分别采用直接接种法和薄膜过滤法进行无菌检查;采用16S核糖体DNA(r DNA)序列分析法和全自动生化鉴定仪对其中4个阳性结果的16株分离菌株、日常监测发现的29株环境微生物进行鉴定。结果：16株分离菌株分别为金黄色葡萄球菌和白色念珠菌,与29株环境菌不同,结合实验过程的回顾性判断,确认无菌检测结果有菌生长的样品为样品中有微生物污染。12个样品的检验结果为4个有菌生长,8个无菌生长,均为满意结果。结论：实验室可以使用16S rDNA序列分析法和全自动生化鉴定仪对检验发现的污染菌进行鉴定。本研究中无菌检查能力验证的结果分析和能力验证的实施过程的回顾,有利于提高实验室检测结果的准确性和有效性。     

注射剂微生物污染的全基因组测序溯源分析研究

目的:对某制药企业注射剂无菌检查阳性污染菌A1(葡萄球菌)进行溯源.方法:采用Illumina平台高通量测序对A1和采集自生产和检验环节的16株葡萄球菌进行全基因组测序,使用Unicycler软件对序列进行拼接,用Prokka软件进行菌株基因预测,通过计算基因组序列与模式菌株之间的OrthoANI值和AF值进行菌株鉴定...     

1株甲基杆菌的鉴定

目的：鉴定1株在生物制品生产车间采集的菌株 wh01的种属。方法观察该菌株的形态,并用细菌鉴定仪进行检定。采用 PCR 法扩增菌株的16S rDNA 和甲醇脱氢酶大亚基的 mxaF 基因,用生物信息学软件进行分析。结果该菌株经细菌鉴定仪检定为沙门菌属,但其形态与沙门菌有很大差别,其16S rDNA 和 mxaF基因序列与甲基杆菌属序列的相似性高达99％。结论该菌株属于甲基杆菌属。     

14株伯克霍尔德菌的鉴定分析

目的 对从菌种保藏中心获得以及样品分离的14株伯克霍尔德菌进行鉴定分析，为该菌的鉴定和溯源分析提供参考。方法 分别用生理生化(API20NE和Biolog碳源分析系统)、基因型(自动化核糖体分型、16S rDNA和recA序列分析)的方法对11株标准菌株和3株未知菌进行了鉴定，并对结果进行了分析比较。结果 生理生化的方法能够鉴定到属的水平，Biolog能够区分BCC与非BCC类群微生物；16S rDNA序列分析能够鉴定到属水平，对于非BCC的部分菌可以鉴定到种水平，并且能够将BCC正确分类；recA序列分析能够将包含BCC的部分菌正确鉴定到种水平；Riboprinter技术能够鉴定到属水平，但是该技术能够对菌进行溯源分析。结论 在进行该菌的鉴定时，可以参考中国药典2015年版四部9204微生物鉴定技术指导原则的要求，根据自身的需求、技术能力以及能够承担的成本，选择适宜的鉴定方法和技术，依据多相鉴定原则进行鉴定分析，第一步判断是否属于伯克霍尔德菌属，第二判断是否属于BCC，第三尽可能准确鉴定到种水平，有必要的情况下进行溯源分析以确认污染来源。     

环境微生物数据库的建立及在溯源分析中的应用

目的 建立无菌药品生产企业环境微生物数据库,为企业污染事件的溯源分析提供支撑。方法 通过16srRNA序列建立企业环境微生物数据库,利用数据库及核糖体分型等技术将污染微生物溯源至菌株水平,为生产出现的污染事件进行溯源分析。结果 通过环境微生物数据库和核糖体分型技术成功找到了污染源。结论 无菌药品生产企业环境微生物数据库的建立及核糖体分型技术为污染调查溯源分析起到了重要技术支撑。     

药品无菌检查中微生物污染的鉴定和污染溯源分析

目的:本研究结合无菌药品受微生物污染的案例,通过多种技术手段分析药品微生物污染情况,保证药品无菌检验结果判断的准确性,对药品微生物污染追踪溯源提供技术支持。方法:对从无菌检查阳性样品和实验环境中分离得到14株革兰氏阳性球菌进行鉴定和分型,采用VITEK2 Compact、16S rRNA基因测序技术、RiboPrinter系统以及DiversiLab系统等手段对微生物进行同源性分析。结果:无菌阳性样品中分离出的微生物经鉴定为3株溶血葡萄球菌、4株沃氏葡萄球菌和5株表皮葡萄球菌,从环境中得到2株表皮葡萄球菌。由同源性分析可知,来源于不同产地的样品中分离出来的同种微生物亲缘关系较远,来源不同,与环境中收集到的微生物不相关。若仅考虑现有收集到的环境监控菌,污染源是样品在加工或运输过程中引入的,与无菌检查环境无关。结论:通过对14株葡萄球菌的鉴定和溯源分析,综合评价多种技术手段的分型效果,以完善药品无菌检查过程控制,为药品微生物污染的溯源调查提供解决方案。     

无菌检查中污染微生物多样性分析及数据偏差调查

目的 对无菌检查中污染微生物进行多样性分析及数据偏差调查。方法 以曲安奈德注射液为例,按2020年版《中国药典》方法进行无菌检查,对污染微生物分离纯化后进行生化鉴定及基于16S rRNA的微生物多样性分析,与实验环境中的环境菌库进行比较并溯源,同时进行微生物数据检查偏差数据调查（MDD）。结果 样品中检出表皮葡萄球菌、克式柠檬酸杆菌、唾液链球菌,且均在试验环境菌库39株环境菌中。MDD结果表明,样品中污染的微生物是由操作人员未完全按无菌隔离器使用的标准操作规程进行规范操作而导致的。即样品中污染的微生物来源于环境,而非样品本身,试验结果无效,应重试。结论 对无菌检查中污染微生物进行溯源及数据偏差调查,可确认其阳性结果的准确性。     

小链霉菌HCCB10043产脂肽类抗生素的鉴定及其生物合成基因簇研究

使用高效液相色谱法分离纯化了小链霉菌HCCB10043的重要代谢产物,获得3个精制品;经高分辨质谱、二级质谱与氨基酸分析鉴定其分别为A21978C1、C2和C3。菌株16S rDNA与已知的A21978C产生菌玫瑰孢链霉菌NRRL11379的同源性为99.2%,系统发育分析显示两者的亲缘关系很近;经基因钓取与沉默验证,结果显示该菌株的A21978C生物合成基因簇与玫瑰孢链霉菌报道完全相同。     

药品微生物检测实验室环境菌库的建立

目的 建立药品微生物检测实验室环境菌库。方法 从药品微生物检测实验室环境中不同部位、设备材料及活动人员进行连续7个月采样收集获得248株细菌和6株霉菌,对收集的细菌采用全自动微生物生化鉴定仪(Vitek2 Compact)进行鉴定,对生化鉴定无确切结果的90株细菌及6株霉菌均采用3500 MicroSeq基因测序分析系统进行细菌16S rDNA和霉菌LSU rDNA测序鉴定,同时也对某次采样收集的6株金黄色葡萄球菌采用Diversilab系统进行同源性分析。结果 通过整理和分析收集获得的254株菌的鉴定结果,初步建立了药品微生物检测实验室环境菌库。结论 为今后开展污染水平的风险评估和不良事件调查提供技术平台,同时也为制药企业开展建立环境微生物信息库和微生物污染溯源提供技术指导。     

放线菌P-127菌株抗菌活性物质的初步考察

目的初步确定放线菌P-127菌株的类别及其抗菌活性物质的结构。方法采用琼脂扩散法研究放线菌P-127菌株代谢产物的抑菌活性,采用16S rDNA序列分析法初步对菌株进行分类,采用大孔树脂柱色谱和制备型高效液相色谱对活性成分进行分离纯化,通过紫外、红外、质谱初步确定活性物质的结构。结果放线菌P-127菌株产生的活性物质对啤酒酵母菌、白色念珠菌以及小麦赤霉病菌等6种真菌具有显著的抑菌活性,16S rDNA序列分析表明菌株的序列与Streptomyces padanus的序列完全相同(相似性100%),质谱显示活性物质的相对分子质量为670,紫外吸收波谱显示活性物质具有多烯大环内酯类抗生素的特征吸收峰。结论经16S rDNA序列比对分析,初步确定放线菌P-127菌株为Streptomyces padanus,其产生的抗真菌活性谢物质为fungichrom in。     

1株抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的土壤放线菌的分离与鉴定

目的:从土壤中分离与鉴定抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的放线菌。方法:在改良的高氏Ⅱ号培养基上划线分离土壤放线菌,以MRSA作为受试菌株,测试抗菌活性,对具有抗菌活性的菌株进行16SrDNA种属鉴定。结果:获得拮抗放线菌1株(命名为Hu001),具有较强的抗MRSA的活性;并将16SrDNA序列提交GenBank数据库,(登录号为JQ689078),与同源细菌进行比对,得到其系统进化树;经鉴定16SrDNA序列与山丘链霉菌(Streptomycescollinus)NBRC12547株具有99%的同源性。结论:放线菌Hu001具有抗MRSA的活性,并根据16SrDNA序列测序将其初步归属于山丘链霉菌。     

疫苗分装区环境监测与质量控制分析

目的  建立洁净区环境监测微生物数据库,统计分析悬浮粒子动态监测变化情况,确认疫苗分装区的洁净度符合疫苗生产要求。方法  对疫苗分装区进行空气调节系统性能再验证环境监测,对该区域的培养基灌装试验进行在线环境监测,对以上所有环境监测获得菌进行菌型分析,建立环境监测微生物数据库。结果  在分装前准备、分装中产品入柜和排除故障、分装后清场期间,悬浮粒子浓度变化明显,出现峰值（≥0.5 μm悬浮粒子浓度最大值1 624 粒/m3）,但整体水平仍较低。监测到的微生物主要菌型包括里拉/藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌、人葡萄球菌、科氏葡萄球菌科氏亚种、沃氏葡萄球菌等。结论  疫苗分装区洁净度符合无菌药品生产要求,环境监测微生物数据库的建立和悬浮粒子监测结果的统计分析,为制定有效的无菌药品生产质量控制措施提供了必要且针对性较强的依据。     

1株人源抑制致病菌的粪肠球菌性能评价

摘要：目的 对分离自健康成人粪便中的一株粪肠球菌QT01进行生物学性质和抑制致病菌能力评价。方法 采用PCR方法扩增16S rDNA基因并测序确定分离菌株的种属;采用药敏试验和耐酸耐胆盐试验评价QT01对抗生素敏感性及耐受胃肠道能力;采用抑制试验评价QT01拮抗致病菌和益生菌的能力。结果 经16S rDNA 序列同源性分析,鉴定该菌株为粪肠球菌(Enterococcus faecalis);它不耐酸,但具有较强的耐胆盐能力;对常见抗生素如阿莫西林、青霉素、氯霉素和环丙沙星等敏感;能抑制粪肠球菌致病株V583和产气肠杆菌,但不能抑制植物乳杆菌和嗜热链球菌。结论 粪肠球菌QT01不耐酸耐胆盐,对抗生素敏感,能够抑制致病菌V583,在微生态制剂产品开发方面具有应用潜力。     

MALDI-TOF MS在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌同源性分析的应用研究

摘要：目的 探究基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)分析耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP)同源性在临 床中的应用价值。方法 收取某院2018年9月-2020年10月临床分离的肺炎克雷伯菌非重复菌株295株,经耐药表型筛选出 CRKP;利用MALDI-TOF MS采集CRKP的质谱图,分别运用SARAMIS软件中的相似性分型和identical masses分型进行同源性 分析;以脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)为参考标准,将CRKP分为高度、中度、低度同源性3组,评价 MALDI-TOF MS在分析CRKP同源性分析中的应用价值。结果 经耐药表型筛选出55株CRKP;3组同源性分析显示：高度同 源组中,应用SARAMIS软件自带的identical mass分型和相似性分型分析,大多identical mass集中分布(60%~80%),相似性＞ 80%,与PFGE结果较为一致;中度同源组中,identical mass＞70%,相似性＞85%,显示菌株间高度集中,跟PFGE结果存在较 大的差异;低度同源组中,identical mass＜70%,相似性＜80%,与PFGE结果类似,能较好体现菌株间的差别。结论 MALDITOF MS自带的SARAMIS软件目前仅在高度同源和低度同源菌株中,可作为分析同源性的初筛方式。     

洁净室环境中一株细菌bd5的分离鉴定及系统发育分析

对一株从药品检验洁净室中分离得到的环境菌bd5进行系统分类鉴定。该菌株的16S rDNA序列测序及系统发育分析结果显示,bd5属于罗氏菌属(Rothia),与该属的7个种系统发育关系最密切,因基因序列相似性皆大于95.8%而聚为一簇。虽然bd5与污泥罗氏菌(Rothia amarae)单独相聚,形成一个独立亚分支,但序列差异性达1.8%。生理生化试验结果进一步表明该菌不仅有罗氏菌"属"级的生化特征,还具有与其他种相区别的生化反应。综合形态学特征、生化特性、16S rDNA序列相似性及系统发育关系分析显示,菌株bd5可能为罗氏菌属的一个潜在新种。     

一株新的星孢菌素产生菌的鉴定及其诱变选育

摘要：目的 对自主分离得到的星孢菌素产生菌HY1进行分类鉴定和诱变选育。方法 通过16S rDNA基因序列同源性 比对分析，结合其形态特征、培养特征、生理生化特性对菌株HY1进行分类研究；以HY1为出发菌株，通过紫外-氯化锂(UVLiCl) 、常压室温等离子体(ARTP)及亚硝基胍(NTG)诱变，结合含色氨酸、甲硫氨酸的抗性平板进行筛选。结果 菌株HY1为链 霉菌属的菌株，通过多次诱变得到突变高产菌株HY6-S36，且遗传性能稳定，发酵效价达360mg/L，比原始菌株提高了80%。结 论 获得一株高产稳定的星孢菌素生产菌株，为星孢菌素产业化提供优良的菌种。