蜜环菌与天麻共生分子机制的转录组分析

目的以蜜环菌和昭通乌天麻营养繁殖茎为实验材料,通过转录组测序比较分析,初步揭示蜜环菌天麻共生的分子机制。方法采用Trizol Reagent(Invitrogen)提取营养繁殖茎样品中的RNA,建立测序文库并进行测序。结果蜜环菌与天麻共生时有38 838条序列得到注释,在FDR(False Discovery Rate)0.05和log2|FC|1筛选条件下,共有23 333条基因发生显著差异表达,其中1 595条基因呈上调表达,21 738条呈下调表达。基于转录组数据分析结果,与胞外酶纤维素酶、木聚糖酶、漆酶以及多聚半乳糖醛酸酶相关的Unigene分别有21、6、39和6个,集中差异表达基因分别有9、3、23和4个,除1个纤维素酶基因上调表达外,其他均呈下调表达;与抗氧化酶超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶有关的Unigene基因分别有13、7和17个,其中差异表达的基因分别有6、7和7个,都呈下调表达。此外,q RT-PCR分析验证了这些基因呈下调表达。结论蜜环菌侵染天麻与其共生的过程中,蜜环菌的生命活动减弱,同时未受到天麻胁迫作用。这为进一步研究天麻蜜环菌共生分子机制提供了大量有价值的基因资源。     

药用植物冬凌草高通量转录组测序与分析

目的:得到冬凌草高通量转录组数据,为挖掘冬凌草二萜类生物合成途径关键基因,研究冬凌草ESTSSR分子标记提供数据来源。方法:利用Illumina Hi Seq 4000高通量测序技术,采用Trinity的方法从头组装、序列拼接和去冗余处理;基于BLAST完成Unigene编码蛋白NR功能注释、GO分类、KEGG代谢通路注释和分类、功能基因挖掘,SSR分子标记挖掘。结果:获得冬凌草叶与茎两种不同组织共12 GB转录组数据,得到3 7961个Unigene基因,平均长度1063 bp;得到冬凌草叶和茎转录组有60条unigenes参与萜类化合物骨架合成、6条unigene参与各种萜类化合物合成,有26条unigene参与二萜化合物合成途径,叶与茎两种组织中有差异表达的基因4565个,其中在茎中表达较高的为1668个,在叶中表达较高的有2697个,与二萜类化合物合成相关的差异表达基因有15个。结论:本研究为冬凌草二萜化合物生物合成途径中关键基因的挖掘和分子育种提供了数据信息,为深入研究冬凌草中冬凌草甲素等有效成分的生物合成途径及其调控机制提供基础。     

基于转录组学分析贵州天麻治疗高血压的分子机制

目的：基于转录组学分析贵州天麻治疗高血压的分子机制。方法：32只SD大鼠腹腔注射N－硝基－L－精氨酸（L－NNA）复制高血压模型,造模成功后随机分为模型组、阳性药组和天麻高、低剂量组,另选8只正常血压SD大鼠作为正常对照组。正常对照组和模型组灌胃蒸馏水,阳性药组灌胃15 mg/kg卡托普利,天麻高、低剂量组灌胃10、2.5 g/kg贵州天麻,连续灌胃4周。采用尾压法（tail－cuff法）测定每组大鼠的收缩压和舒张压（7 d/次）;4周后取肝脏、肾脏组织进行病理组织学检测;转录组测序分析肝脏组织差异基因,对差异基因进行基因本体论、信号通路、蛋白相互作用分析。结果：与空白对照组比较,模型组大鼠的收缩压和舒张压明显升高（P < 0.05）,与模型组比较,阳性药组和天麻高剂量组大鼠的收缩压、舒张压均明显下降（P < 0.05）。HE染色显示,模型组肝、肾组织破坏明显,天麻高剂量组和阳性药组均得到了不同程度的改善。转录组分析发现,天麻治疗高血压的靶点78个,其中上调40个差异基因,下调38个差异基因;78个差异基因参与多条信号通路,其中PPAR 信号通路（PPAR signaling pathway）最显著,前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2,PTGS2）,内皮一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3,NOS3）为核心靶点。结论：贵州天麻可以改善高血压,其机制可能涉及到基因PTGS2和NOS3,以及PPAR信号通路。     

蜜环菌抑制天麻种子发芽的研究

继1978年初步研究观察到蜜环菌有降低天麻种子发芽率的现象后,又研究证实蜜环菌主要对种子萌发初期起抑制作用。将具有蜜环菌代谢产物的无菌滤液加入培养基播种证明,蜜环菌的代谢产物对天麻种子发芽有抑制作用。     

基于转录组测序的山茱萸次生代谢生物合成相关基因的挖掘

为探讨山茱萸中环烯醚萜等次生代谢产物合成的遗传基础,采用新一代高通量测序技术对其果实进行转录组测序,共获得得96 032条unigenes,平均长度590.53 bp;其中共有35 478条unigene能被NR,Swissprot,COG,GO,KOG,Pfam和KEGG等7个公共数据库注释。通过对注释所得的unigene进行KEGG代谢通路的分析发现,共有84个unigene与环烯醚萜类成分的生物合成有关;487条unigene参与山茱萸其他次生代谢相关物质代谢调控。研究发现,共有153条unigene参与山茱萸次生代谢产物的氧化/羟基化;72条unigene参与次生代谢产物的糖基化。该研究首次对山茱萸转录组进行了分析,并获得了山茱萸环烯醚萜类等次生代谢生物合成相关的候选基因,为山茱萸的分子生物学研究提供了丰富的数据资源,也为后续探讨候选基因的功能奠定了基础。     

基于转录组测序揭示适度干旱胁迫对甘草根基因表达的调控

适度干旱胁迫可促进甘草有效成分的积累,提高药材质量。该研究以栽培6个月的甘草根为材料,设置适度干旱胁迫组(土壤相对含水量40%~45%)和对照组(土壤相对含水量70%~75%),分别应用Illumina HiSeq 2000进行转录组双末端测序,分析甘草根响应适度干旱胁迫的差异表达基因。在适度干旱胁迫组和对照组中分别得到80 490 490,82 588 278个Clean reads,经序列拼接和去冗余处理分别得到94 828,305 100个Unigene序列,序列长度的中位数分别为1 007,1 125 nt。差异表达基因分析表明,适度干旱胁迫抑制细胞壁中β-木糖苷酶、天冬酰胺酰内肽酶、GDP-L-岩藻糖合酶等酶的基因表达,可能抑制根细胞的初生壁降解与程序性细胞死亡;促进萜类、黄酮类化合物生物合成的关键酶基因的表达,进而促进甘草有效成分的积累;促进生长素、乙烯、细胞分裂素的生物合成和信号转导,进而促进根的发生和细胞增殖;促进脱落酸、茉莉酸的生物合成和信号转导,进而提高甘草对干旱胁迫的适应能力;抑制赤霉素、油菜素内酯等激素的生物合成和信号转导,进而抑制地上茎的伸长。     

天麻退化机制及其防治技术体系的研究思路与方法

天麻是我国传统名贵中药材,近年来,由于过度采挖,野生天麻濒临灭绝,而人工栽培天麻退化严重,品质低劣,产量下降。综述了天麻与蜜环菌的共生关系及其退化机制,从天麻种质、繁殖技术、播种方式,尤其是蜜环菌的优选等方面提出了解决天麻退化的防治技术体系,为天麻的优质高产栽培提供有效可行的研究思路与方法。     

基于代谢组学技术的天麻降血压作用研究

目的利用代谢组学技术分析自发性高血压大鼠天麻干预前后血清内源性代谢物的变化,探讨其作用机制。方法14只自发性高血压大鼠随机分为模型组(生理盐水)和天麻组(2 mL/200g天麻提取液),每组7只,另取7只Wistar大鼠设为正常组(生理盐水),均治疗4周。治疗前及治疗2、4周测量大鼠尾动脉收缩压,利用液质联用技术分离、分析各组大鼠血清中内源性代谢物。结果与模型组比较,天麻组大鼠的宏观体征改善,治疗2、4周收缩压下降(P<0.01)。正常组、模型组、天麻组的代谢谱明显分开,模型稳定性良好。与模型组比较,天麻组整体代谢模式和个体代谢物发生改变,鉴定出潜在生物标志物27个,主要涉及亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、苯丙氨酸代谢、胆汁酸生物合成、类固醇激素生物合成等代谢途径。结论天麻可降低自发性高血压大鼠血压,其机制可能与抑制血管炎症物质的释放有关。     

天麻种质资源及其与双菌共生分子机制研究

天麻为真菌异养型草本植物,其干燥块茎为药用与保健价值兼备的中药材,生长发育过程先后需与2类真菌——萌发菌与蜜环菌共生。天麻-萌发菌共生体系通过分子调控在共生萌发前期促进种子萌发,并在共生萌发后期随着蜜环菌的侵染利用防御反应打破共生体系动态平衡,为天麻-蜜环菌共生体系的建立创造条件。天麻-蜜环菌共生时期,宿主通过调控代谢相关基因贮存营养及能量物质以保障箭麻的形成。天麻与双菌共生时期均通过建立信号转导与物质运输途径提高天麻-真菌共生效率并维持共生体系动态平衡。本文综述了天麻野生种质的分布、种类与新品种培育现状,并从全局性角度梳理了近年来利用转录组学、蛋白组学等技术对天麻-双菌共生的分子机制研究。对天麻种质资源及遗传信息进行整合,在系统利用现有遗传资源的基础上深入探究菌-麻共生体系的调控机制并有效指导品种选育与遗传改良,助力天麻产业的持续完善和发展,充分发挥其药用价值和经济价值。     

基于转录组测序揭示光质对刺五加实生苗基因表达的调控作用

目的 对刺五加Acanthopanax senticosus实生苗进行转录组测序,分析其响应不同光质调控的分子机制。方法 以生长60 d的刺五加实生苗为材料,设置不同光质处理组（LED-1、LED-2）和对照组[高压钠灯（high pressure sodium,HPS）],应用Illumina HiSeq^TM对其叶片进行转录组测序,对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）筛选和共表达网络分析。结果 转录组测序共获得126 252条Unigene。其中92 681条被注释,3个处理组中筛选出DEGs 7664个。基因本体（gene ontology,GO）富集结果表明,DEGs在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）途径富集分析表明,DEGs显著富集在植物激素传导、糖代谢、苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成。适度光质胁迫可以促进刺五加实生苗中苯丙素类化合物生物合成途径关键酶基因的表达,是促进刺五加有效成分累积的基础。结论 通过高通量转录组测序,揭示了不同光质对刺五加实生苗基因表达的调控特征,可为深入研究刺五加药效成分的生物合成机制及栽培中的光环境设置提供科学依据。     

天麻饮片等级研究

探讨天麻饮片等级分类方法。在文献研究及产地调研的基础上,结合传统评价和现代评价方法综合评价天麻饮片,并对其进行等级分类。根据调研,天麻药材已有等级分类,饮片大都以统货形式销售;所调查的中药饮片生产企业、医院及药房销售的天麻饮片并未分级;对已分级的饮片一般只有一级和统货2个等级,而只有冬麻加工的饮片有分级。天麻饮片等级的综合评价有助于提高饮片质量,实现"优质优价",该研究可为其他中药饮片的等级划分提供思路和借鉴。     

RP-HPLC同时测定天麻中4种成分的含量

目的：建立RP-HPLC同时测定天麻药材中天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛的含量。方法：采用Kromasil C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇-0.1%醋酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL·min^-1,检测波长270 nm,柱温35 ℃。结果：天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛分别在19.1～383 μg·mL^-1(r=0.999 9),0.620～12.4 μg·mL^-1(r=0.999 9),2.45～49.0 μg·mL^-1(r=0.999 9),0.280～5.63 μg·mL^-1(r=0.999 6)与峰面积线性关系良好;平均加样回收率(n=9)均在96.7%～97.7%,RSD均小于1.6%。结论：本法准确可靠,分离度好,适用于天麻药材中天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛的含量测定。     

RP-HPLC同时测定天麻中4种成分的含量

目的:建立RP-HPLC同时测定天麻药材中天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛的含量.方法:采用Kromasil C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以甲醇-0.1%醋酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL·min~(-1),检测波长270 nm,柱温35℃.结果:天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛分别在19.1～383(r=0.999 9),0.620～12.4(r=0.999 9),2.45～49.0(r=0.999 9),0.280～5.63 mg·L~(-1)(r=0.999 6)与峰面积线性关系良好;平均加样回收率(n=9)均在96.7%～97.7%,RSD均小于1.6%.结论:本法准确可靠,分离度好,适用于天麻药材中天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛的含量测定.     

基于主成分分析的天麻矿质元素含量研究

目的:研究不同来源天麻矿质元素含量,分析天麻特征元素及评价药材质量。方法:采用ICP法对不同来源的天麻药材必需的磷(P),钾(K),钙(Ca),镁(Mg),铁(Fe),锌(Zn),硼(B),锰(Mn),铜(Cu)等10种矿质元素含量进行测定,用主成分分析法分析天麻特征元素并对药材质量进行评价。结果:天麻药材中K元素含量最高,平均为15.31 g·kg-1;其次是N元素,平均含量为8.99 g·kg-12元素变异系数小;Mn元素含量的变异系数最大,为51.39%;N,P,K元素间达极显著正相关;主成分分析选择3个主成分对药材质量进行评价,发现天麻药材特征元素为P,B,N,K,Cu,Mn,Fe,Mg等8种元素。结论:天麻K和N元素含量高,且相对稳定;Mn元素含量差异大;其中P,B,N,K,Cu,Mn,Fe,Mg等8种元素是天麻特征元素;从矿质元素角度分析30份天麻资源中贵州、云南天麻药材质量较好。     

天麻种植对土壤微生物群落结构的影响分析

目的:分析不同生境种植天麻前后土壤微生物的群落结构变化,探讨土壤微生物对种植天麻的响应程度。方法:对贵州大方和安徽金寨未种植天麻土壤(CK1和CK2),采收前天麻块茎周围土壤(GE1和GE2)和蜜环菌菌索周围土壤(AGE1和AGE2)进行ITS和16S rDNA测序分析。结果:PCA主成分分析说明与对照土壤相比,种植天麻后土壤微生物发生较大改变。测序结果分析发现种植天麻使得土壤中真菌和细菌OTUs数目均有一定的增加。与对照土壤相比,贵州大方种植天麻后的土壤真菌和细菌群落的多样性及丰度均呈增加的趋势;安徽金寨种植天麻后的土壤真菌的多样性及丰度变化不大,土壤细菌群落丰度增加。二者土壤中土赤壳属Ilyonectria,硝化螺菌属Nitrospira的相对丰度显著升高,红菇属Russula的相对丰度显著降低;贵州大方土壤中镰刀菌属Fusarium,被孢霉属Mortierella的相对丰度显著增加。结论:种植天麻后土壤微生物平衡被打破,并且土赤壳属Ilyonectria,镰刀菌属Fusarium等病原微生物丰度增加,推测与天麻病虫害有一定的相关性。     

基于空间分析的昭通天麻生态适宜性区划研究

利用最大信息熵模型(Maxent)与地理信息系统(Arc GIS),综合气候、地形、土壤、植被等相关生态因子,对昭通天麻的潜在分布区域进行了生态适宜性等级划分。结果表明,昭通天麻的最适生区(适宜系数0.6)主要集中分布在云南昭通(镇雄、彝良和大关,总面积2 872 km2)和贵州毕节(赫章、毕节和威宁,总面积1 251 km2)境内。影响昭通天麻分布的主要环境因素为海拔、11月平均降雨量、10月份降雨量、植被类型、3月平均降雨量、4月平均降雨量、土壤类型、等温性、6月平均降雨量等。昭通天麻最适区环境参数为海拔1 450~2 200 m,年平均气温为11~13.0℃,最冷月(1月)平均气温2.8~4.0℃,最热月(7月)平均气温18.0~20.4℃,年均降雨量在900 mm左右,土壤为黄壤、黄棕壤,酸性或微酸性的砂壤土。研究结果可为昭通天麻的生产区划和仿野生栽培的选址工作提供科学依据。     

天麻中糖基转移酶基因GeGT1的克隆及原核表达分析

目的 克隆天麻糖基转移酶基因(glycosyltransferase,GeGT1)的全长cDNA序列,进行序列分析和原核表达分析,并探究该基因在天麻不同器官中的表达规律.方法 在天麻转录组数据库中通过注释和比对,用Primer Premier 5.0软件设计基因特异性引物.通过反转录聚合酶链式扩增(reverse tr...     

天麻褐腐病与土壤微生物菌群结构的关联分析

目的:研究褐腐天麻与土壤微生物菌群的组成及变化,阐述天麻种植过程中天麻褐腐病与土壤微生物菌群之间的关系,为揭示天麻褐腐病的原因提供理论基础。方法:采用内转录间隔区(ITS)和16S rDNA高通量测序技术,分别对健康、褐腐天麻及其周际土壤中真菌和细菌的微生物多样性、群落组成结构、群落结构相似性进行分析。结果:与健康组相比,褐腐天麻及其土壤中真菌和细菌分类单元(OTUs)数目均有增加,且土壤中真菌、细菌丰富度和多样性显著增高,褐腐天麻真菌多样性显著降低,细菌多样性显著增高。在属分类水平上,健康天麻及其周际土壤中的优势真菌属为被孢霉属Mortierella,该属在褐腐天麻及其土壤中分别减少7.62%和15.75%,优势细菌属为慢生根瘤菌属Bradyrhizobium和Burkholderia-Paraburkholderia;褐腐天麻及其周际土壤中的优势真菌属为土赤壳属Ilyonectria,优势细菌属分别为沙雷氏菌属Serratia和慢生根瘤菌属Bradyrhizobium。结论:褐腐天麻与其周际土壤中真菌菌群具有极高相似度,说明土壤微生物真菌群落变化在一定程度上造成天麻褐腐病的发生,其中褐腐天麻真菌群落组成中致病真菌土赤壳属Ilyonectria成为优势菌属,推测该菌属可能含有天麻褐腐病的致病菌。     

基于SRAP分子标记的天麻遗传多样性研究

目的 利用SRAP分子标记技术对天麻种质资源进行遗传多样性研究,为天麻不同亲缘物种间的分类及其优良种质资源的筛选提供依据。方法 采集7个不同生态区域的天麻种质资源,包括红杆G.elata f.elata、乌杆G.elata f.glauca和绿杆G.elata f.viridis 3种变型和红乌杂交天麻,共24份样品。运用SRAP分子标记方法构建天麻种质的DNA指纹图谱,从分子水平检测其遗传多样性。结果 33对引物扩增出637条多态性条带,多态性百分率达73.16%。24份天麻种质样品间相似度分布于0.404 0~0.908 0,整个群体之间的相似程度差异较大。其中红天麻样品间的相似度在0.906 6~0.996 4,遗传差异较小;乌天麻、杂交天麻和绿天麻样品间的相似度分别在0.410 4~0.999 6、0.541 0~0.950 4和0.578 2,遗传差异较大。AMOVA分析结果显示,天麻变型内变异大于变型间变异,天麻各变型间有很大的遗传分化(FST=0.33,P<0.05)。另外,人工栽培对遗传分化有影响,但不显著。结论 SRAP分子标记方法得到的24份天麻样品多态性丰富,能有效地反映出天麻的遗传多样性。红杆天麻的遗传性状较为稳定,与其他变型间缺乏基因交流,遗传多样性匮乏;其他2个变型具有较高的遗传多样性。