圣露丸的抗结核作用初步实验研究

目的 评价中药圣露丸的体外及小鼠结核病模型中的抗结核活性。方法 在7H9液体培养基、7H10固体培养基中分别测定圣露丸对结核分枝杆菌标准株H37Rv的最低抑菌浓度(MIC)。气溶胶感染方式采用结核分枝杆菌标准株H37Rv先后感染SPF级BALB/C小鼠46只和36只,分别建立小鼠急性结核病模型。均为感染第10天开始给予药物治疗,随机分组,每组10只。其中圣露丸组每只小鼠每次剂量为3g/kg;异烟肼(INH)组,每次剂量为25mg/kg,同时设无药空白对照组。各组均口服灌胃给药,每周给药5次,分别给予3周和6周药物治疗。治疗结束后次日处死各组小鼠,称重,无菌操作下解剖,做肺组织活菌计数。结果 圣露丸在7H9液体培养基中对H37Rv的MIC为2.5mg/ml,在7H10固体培养基中对H37Rv的MIC为<5mg/ml。小鼠感染及治疗过程中各组耐受性良好,无死亡。给予3周共计15次(每次给予“圣露丸”3g/kg)剂量治疗后,圣露丸组小鼠全肺的CFU为 (6.81±0.71)lg CFU,较空白对照组降低0.39lg CFU。应用圣露丸治疗6周后,圣露丸组的小鼠全肺的CFU为 (4.33±0.51)lg CFU,较空白对照组降低1.10lg CFU。结论 在本研究条件建立的小鼠结核病模型中,中药圣露丸显示出抗结核活性,值得进一步研究。     

吡法齐明抗耐药结核分枝杆菌作用机制的初步研究

目的 通过测定结核分枝杆菌活性氧含量及过氧化氢酶活性,初步探讨吡法齐明抗耐药结核分枝杆菌的作用机制。方法 以1、2、4、8倍于最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)的氯法齐明和吡法齐明处理H37Rv标准株24h,应用荧光探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)活性氧检测试剂盒测定不同浓度的氯法齐明和吡法齐明处理前后结核分枝杆菌菌体内的活性氧含量水平变化。以过氧化氢酶活性检测试剂盒测定5株对氯法齐明和吡法齐明均耐药、3株对氯法齐明耐药但对吡法齐明敏感、1株对氯法齐明和吡法齐明均敏感(编号13385)的结核分枝杆菌及H37Rv标准株的过氧化氢酶活性,比较氯法齐明和吡法齐明耐药菌株与敏感菌株的过氧化氢酶活性的差异。采用SPSS 19.0软件进行数据的统计学分析,并对吡法齐明药物处理浓度与所测得的荧光强度值进行Spearman相关性分析和线性回归分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果 活性氧含量水平测定结果显示,结核分枝杆菌在经不同浓度氯法齐明和吡法齐明处理24h后,各浓度药物处理样本的荧光强度值均值排序分别为1MIC(6668.5)>8MIC(2751.5)>2MIC(2572.0)>4MIC(2015.0),8MIC(2637.5)>4MIC(2297.0)>2MIC(2085.5)>1MIC(1896.0),菌体内积累的活性氧含量均高于无药物刺激的阴性对照样品(H37Rv标准株+DCFH-DA,878.5)至少2倍;且在各浓度吡法齐明处理的菌株中,菌株测定的荧光强度值与药物浓度间呈现明显的正相关(Spearman相关性分析,r=0.976,P<0.001),经线性回归方程检验结果显示回归模型有统计学意义(F=92.576,P=0.011)。菌株过氧化氢酶活性测定结果显示,氯法齐明耐药菌株的过氧化氢酶平均活性(0.87U/10 ⁴cell)是其敏感菌株(0.48U/10 ⁴cell)的近2倍;而吡法齐明耐药菌株的过氧化氢酶活性均值(0.88U/10 ⁴cell)略高于其敏感菌株(0.71U/10 ⁴cell),但与氯法齐明耐药菌株均值相近。 结论 氯法齐明和吡法齐明作用于结核分枝杆菌后均会引起菌体内活性氧含量的积累,两药可能有着相似的作用机制;过氧化氢酶活性增高可能与结核分枝杆菌对氯法齐明和吡法齐明耐药有关。     

PCR-SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

PCR－SSCP技术快速检测结核分枝杆菌 rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。     

Rv1508c调节和促进分枝杆菌对链霉素药物敏感性的研究北大核心CSCD

目的通过检测抗结核药物-利福平、异烟肼以及链霉素对结核分枝杆菌RD区(Region of Differences,RD)基因的IC50(half maximal inhibitory concentration,IC50)值,筛选对3种抗结核药物敏感或耐药的毒性结核分枝杆菌RD区基因。方法将结核分枝杆菌RD6、RD9和RD15区基因与穿梭质粒pMV261连接,连接产物电转化耻垢分枝杆菌中。分别将对数生长期的耻垢分枝杆菌以及重组耻垢分枝杆菌中加入浓度倍比稀释的异烟肼(0.031 25~4μg/ml)、利福平(0.031 25~4μg/ml)和链霉素(0.031 25~4μg/ml)100μl,37℃培养2d后,用酶标仪测A600值。用Graphpad Prism5计算IC50值并进行统计学分析。结果成功构建RD6、RD9和RD15区基因重组质粒,电转化入耻垢分枝杆菌后通过检测利福平、异烟肼以及链霉素对以上RD区基因的IC50值,成功筛选出对链霉素敏感的RD6区基因Rv1508c。同时对Rv1508c在分枝杆菌(毒性结核分枝杆菌H37Rv、减毒结核分枝杆菌H37Ra、BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌以及海洋分枝杆菌)中的分布做了鉴定,确定其只存在于H37Rv和H37Ra中。结论结核分枝杆菌RD6区基因Rv1508c能促进分枝杆菌对链霉素的敏感,使链霉素杀伤分枝杆菌作用增强,Rv1508c作为链霉素一个靶点,在今后研究中,Rv1508c可作为抗结核药物增敏剂的应用。     

Rv1508c调节和促进分枝杆菌对链霉素药物敏感性的研究

目的通过检测抗结核药物-利福平、异烟肼以及链霉素对结核分枝杆菌RD区(Region of Differences,RD)基因的IC50(half maximal inhibitory concentration,IC50)值,筛选对3种抗结核药物敏感或耐药的毒性结核分枝杆菌RD区基因。方法将结核分枝杆菌RD6、RD9和RD15区基因与穿梭质粒pMV261连接,连接产物电转化耻垢分枝杆菌中。分别将对数生长期的耻垢分枝杆菌以及重组耻垢分枝杆菌中加入浓度倍比稀释的异烟肼(0.031 25~4μg/ml)、利福平(0.031 25~4μg/ml)和链霉素(0.031 25~4μg/ml)100μl,37℃培养2d后,用酶标仪测A600值。用Graphpad Prism5计算IC50值并进行统计学分析。结果成功构建RD6、RD9和RD15区基因重组质粒,电转化入耻垢分枝杆菌后通过检测利福平、异烟肼以及链霉素对以上RD区基因的IC50值,成功筛选出对链霉素敏感的RD6区基因Rv1508c。同时对Rv1508c在分枝杆菌(毒性结核分枝杆菌H37Rv、减毒结核分枝杆菌H37Ra、BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌以及海洋分枝杆菌)中的分布做了鉴定,确定其只存在于H37Rv和H37Ra中。结论结核分枝杆菌RD6区基因Rv1508c能促进分枝杆菌对链霉素的敏感,使链霉素杀伤分枝杆菌作用增强,Rv1508c作为链霉素一个靶点,在今后研究中,Rv1508c可作为抗结核药物增敏剂的应用。     

23株非结核分枝杆菌药物敏感性试验分析

目的 对自贡市临床分离鉴定的23株非结核分枝杆菌分别进行26种抗生素的药物敏感试验,了解非结核分枝杆菌对不同抗生素的耐药性,为非结核分枝杆菌病临床治疗提供依据。方法 采用微孔板阿尔玛蓝测定法(microplate Alamarblue assay,MABA)测试每种药物对每株非结核分枝杆菌的最低抑菌浓度(MIC值),通过MIC值判断该菌对此种抗生素是否耐药。结果 非结核分枝杆菌对大部分抗结核药物耐药,并且对部分药物的耐药存在种间差异。其中脓肿分枝杆菌耐药率达84.6%,鸟分枝杆菌与胞内分枝杆菌分别达53.8%与52.3%,堪萨斯分枝杆菌耐药率最低为38%。结论 对临床非结核分枝杆菌肺病,快速菌株鉴定及药敏试验是治疗的关键。     

结核分枝杆菌耐喹诺酮临床分离株gyrA基因突变的研究

目的　了解结核分枝杆菌喹诺酮 (quinolones)耐药株耐药基因突变情况,评价其应用价值。方法 通过 16SrRNA聚合酶链反应-单链构象多态性 (PCR SSCP)技术分析 77株分枝杆菌临床分离株;通过PCR SSCP和直接测序技术分析结核分枝杆菌的gyrA基因突变的情况。 结果 75株为结核分枝杆菌复合群。 30株喹诺酮敏感株的 gyrA基因的SSCP图谱中,11株与H₃₇R_v相同,19株与卡介苗相同;与卡介苗 gyrA基因的SSCP图谱相同的敏感株 95位密码子为ACC,与H₃₇R_v该图谱相同的敏感株 95位密码子为AGC。 45株喹诺酮耐药株中,34株 (75.6%) gyrA基因SSCP图谱泳动异常,对 25株泳动异常、出现频率较高耐药株测序证实 15株 (44.1%)为 94位密码子GAC→GGC突变;10株 (29.4%)为 90位密码子GCG→GTG的突变。结论 结核分枝杆菌耐喹诺酮与 gyrA基因突变有关,PCR SSCP可能成为测定结核分枝杆菌耐喹诺酮类药基因型的快速、简便的方法。     

结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c蛋白融合表达与血清学评价

目的 原核表达结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c融合蛋白并进行纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法评价重组蛋白在结核病血清学诊断中的价值。方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,通过重叠PCR扩增得到Rv3425-Rv1168c全核酸序列克隆至表达载体pET-24b中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,通过ELISA检测100份确诊结核病人、20例非结核呼吸疾病患者、100份健康人血清,评价融合蛋白进行临床血清学诊断的可行性。结果 Rv3425-Rv1168c融合蛋白在原核系统内获得高表达,纯化的融合蛋白经ELISA方法测定,在血清学实验中敏感性为54%,特异性为95%。结论 Rv3425-Rv1168c融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫原性,在结核病血清学诊断方面具有很大的应用价值。     

硫异维甲类化合物A2对结核分枝杆菌抗菌效果的观察

目的 评价硫异维甲类化合物(SHetA2)在体内外对结核分枝杆菌(MTB)的抗菌效果。方法 (1)采用试管法,将SHetA2(2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/ml)分别加入苏通培养基内后,加入等量MTB标准菌株H37RV菌液[1mg/ml,每支接种0.1ml,含10 ⁶菌落形成单位(CFU)细菌],于37℃培养2周,测定SHetA2的最小抑菌浓度(MIC)。(2)将76只无特定病原体(SPF)级昆明小鼠采用雾化吸入感染装置构建肺结核感染模型,最终纳入60只建模成功的小鼠。采用数字表法随机将小鼠分为对照组、异烟肼组、SHetA2组,每组20只,分别采用生理盐水、异烟肼、SHetA2进行治疗。治疗45d后,观察各组小鼠体征及体质量变化、肺组织细菌载荷量计数及组织病理学变化。 结果 (1)体外实验结果显示,SHetA2对MTB标准菌株H37RV的MIC为10μg/ml。(2)体内抗结核实验显示,治疗45d后,对照组小鼠体质量为(27.21±2.85)g,明显低于异烟肼组[(37.98±3.09)g]和SHetA2组[(38.28±3.43)g],差异有统计学意义(F=4.05,P=0.023);异烟肼组与SHetA2组比较,小鼠体质量差异无统计学意义(q=0.10,P=0.998);对照组小鼠肺组织重度病变的构成比(80.0%,16/20)明显高于异烟肼组(15.0%,3/20)和SHetA2组(10.0%,2/20),差异有统计学意义(χ ²=32.18,P<0.01);对照组小鼠肺脏感染细菌数量[经对数转换(lg10CFU/ml)]为7.01±1.23,明显高于异烟肼组(2.59±0.87)和SHetA2组(2.25±0.94),差异有统计学意义(F=6.71,P=0.002);而异烟肼组与SHetA2组比较,差异无统计学意义(q=0.33,P=0.970)。 结论 SHetA2在体内外均对MTB有抗菌作用,或可成为新的抗结核化学药物的候选。     

氯法齐明抗结核分枝杆菌的体内外活性研究

目的 评价氯法齐明(clofazimine,CLF)在体外及体内抗结核分枝杆菌的活性,为临床应用提供依据.方法 应用微孔板指示剂法,测定氯法齐明对结核分枝杆菌标准株H37Rv及临床分离耐多药结核分枝杆菌(30株)的MIC;建立小鼠静脉感染H37Rv的结核病模型(105 CFU/只),根据氯法齐明的不同剂量,分为3个治疗组:20 mg/kg,每周给药5次(CLF-1组);10 mg/kg,每周给约5次(CLF-2组);20 mg/kg,每周给药2次(CLF-3组);治疗30 d后进行肺、脾组织活菌计数,应用单冈素方差分析,比较氯法齐明在小鼠体内的抗结核分枝杆菌活性.结果 氯法齐明对结核分枝杆菌H37Rv的MIC为0.12～0.24 μg/ml;对30株耐多药结核分枝杆菌临床分离株的MIC为0.12～1.92 μg/ml.在小鼠结核病治疗模型中,3个治疗组的小鼠肺活菌计数分别较空白对照组降低2.92、1.78和1.39 lg CFU,均具有统计学意义(F=74.09,P＜0.01).结论 氯法齐明具有较好的体外及体内抗结核分枝杆菌活性,值得进一步研究.     

14种抗结核药物在巨噬细胞内的抗结核活性评价

目的 测定14种抗结核药物在巨噬细胞内的抗结核活性,并评价体外巨噬细胞内抗结核活性测定对新药筛选的作用。方法 采用结核分枝杆菌标准株H37Rv 感染J774.1巨噬细胞,建立体外巨噬细胞感染模型。分别检测利福平、异烟肼、左氧氟沙星、吡嗪酰胺、贝达喹啉、氯苯吩嗪、利奈唑胺、硝基咪唑类药物PA-824、氯苯吩嗪的衍生物TBI-166、利奈唑胺的同类药物OTB-658,以及苯并噻嗪类药物PBTZ-169和BTZ-043、TZY-5-84、NTB-3119H作用后的巨噬细胞中的细菌载量,评价抗结核药物的胞内活性;并采用微孔培养显色法(MABA法)测定上述药物的体外最低抑菌浓度。从中选取利福平、异烟肼、左氧氟沙星、贝达喹啉、氯苯吩嗪、利奈唑胺、TBI-166、PBTZ-169分别作用J774.1巨噬细胞3h,利用高效液相色谱-质谱/质谱联用技术测定细胞内药物浓度。结果 细胞培养基中药物浓度为0.50μg/ml时,异烟肼、PBTZ-169、贝达喹啉、BTZ-043、NTB-3119H、TZY-5-84和PA-824降低巨噬细胞内结核分枝杆菌1.60、1.33、1.31、1.25、1.13、1.01和1.00lg(CFU/ml)(CFU:菌落形成单位),胞内活性最强的是异烟肼和PBTZ-169,其次是贝达喹啉;但吡嗪酰胺、利奈唑胺、TBI-166和OTB-658仅降低巨噬细胞内结核分枝杆菌0.65、0.55、0.33 和0.31lg(CFU/ml)。经体外90%最低抑菌浓度(MIC₉₀)和胞内活性比较,发现利奈唑胺和OTB-658虽然具有良好的体外抗菌活性(MIC₉₀分别为0.25和0.05μg/ml),但是二者在细胞培养基中浓度为5μg/ml时仅降低巨噬细胞内结核分枝杆菌0.77和0.50lg(CFU/ml)。在培养基中药物浓度为20μg/ml时,PBTZ-169、贝达喹啉、氯苯吩嗪、利福平、TBI-166、异烟肼、左氧氟沙星和利奈唑胺在巨噬细胞内的浓度为1.42、2.11、4.93、1.65、0.50、0.27、1.13和0.32μg/ml,胞内药物浓度是其MIC₉₀(分别为0.0005、0.03、0.12、0.05、0.04、0.05、0.25、0.25μg/ml)的2840.00、70.33、41.08、33.00、12.50、5.40、4.52和1.28倍。结论 各药物进入巨噬细胞的能力并不相同,巨噬细胞内抗菌活性的差异提示细胞内药物浓度及与MIC₉₀ 的关系是细胞内活性的决定因素。     

不同耐药类型结核分枝杆菌毒力变化的初步研究

目的 初步评价结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)临床耐药分离株和实验室诱导耐药株的毒力变化表征。方法 选取MTB标准株H37Rv和减毒株H37Ra各1株、4株临床耐药分离株(15833、16030、17080和30744,各1株)和8株实验室诱导耐药株[分别为单耐Pretomanid(PA-824)菌株(P1)、单耐利奈唑胺(Lzd)菌株(L1)、单耐PBTZ-169菌株(169-1、169-2、169-3,各1株),以及同时耐PA-824和Lzd的LPDR菌株(PL1、PL2、PL3,各1株)]。测定临床耐药分离株对一、二线抗结核药物和实验室诱导耐药株对Lzd、PA-824、PBTZ-169的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值。绘制各研究菌株的体外生长曲线及测量感染巨噬细胞2d后的胞内菌落形成单位(colony forming units,CFU),并测定感染2d后巨噬细胞释放乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量。动物实验选取BALB/c小鼠168只,6~7周龄,体质量16~18g/只,分为14组,每组12只。将各耐药菌株以尾静脉注射的方式感染BALB/c小鼠,记录小鼠半数生存期,进行生存分析。结果 体外实验表明,MTB临床耐药分离株30744生长曲线相比于其他耐药株的生长平台期提前,菌株体外适应性较低,其余各耐药菌株生长曲线趋势基本一致。临床耐药分离株(15833、16030、30744、17080)和对Lzd和PA-824同时耐药的实验室诱导耐药株(PL1、PL2、PL3)感染巨噬细胞2d后的胞内CFU计数[分别为(5.180±0.074)、(5.571±0.029)、(5.550±0.073)、(5.446±0.099)、(5.763±0.197)、(5.907±0.053)、(5.661±0.083)log₁₀CFU/ml]明显低于标准株H37Rv[(6.207±0.028)log₁₀CFU/ml],差异均有统计学意义(t=17.932、12.758、12.034、10.241、4.796、7.042、9.113,P值均<0.05)。另外,菌株15833、16030、30744、1708、P1、L1、PL1、PL2、PL3、169-1、169-2、169-3感染巨噬细胞2d后LDH释放量的吸光度A₄₉₀值比值(分别为0.252±0.039、0.412±0.078、0.247±0.022、0.358±0.054、0.329±0.015、0.483±0.017、0.328±0.046、0.455±0.075、0.283±0.041、0.258±0.044、0.374±0.080、0.311±0.097)均明显低于标准株H37Rv(0.958±0.025),差异均有统计学意义(t=27.269、16.788、38.244、24.238、44.005、32.698、27.713、15.171、31.798、31.472、16.515、15.570,P值均<0.01)。体内毒力实验显示:(1)所有菌株感染小鼠后,半数生存期(≥15d)均明显长于H37Rv标准株(12d)。(2)小鼠生存曲线显示:准广泛耐药菌株感染小鼠的存活时间长于耐多药菌株,即30744>17080>16030>15833;双重耐药菌株LPDR组小鼠存活时间>PBTZ-169耐药菌株组=单耐Lzd组>单耐PA-824耐药菌株组。结论 MTB耐药株的毒力均较野生型标准株下降,毒力的大小与该菌株耐药的数量可能呈负相关。     

改良单叠氮丙啶-荧光定量PCR法的建立及其检测抗结核药物活性的价值

目的 建立改良单叠氮丙啶(propidium monoazide xx, PMAxx)-荧光定量PCR(qPCR)鉴定MTB活菌和热灭活菌的方法,并探讨PMAxx-qPCR进行抗结核药物体外活性检测的价值。方法 通过活菌和热灭活菌优化 PMAxx针对MTB菌株H37Rv的预处理条件,包括曝光时间、暗孵育时间、PMAxx浓度,以及靶标DNA片段长度等。通过绘制量效曲线和建立循环阈值(Cq)与菌负荷的标准曲线,应用PMAxx-qPCR法计算测定异烟肼(INH)、利福平(RFP)的体外抗菌活性,评价检测敏感度,并分别与微孔板Alamar Blue(MABA)法和菌落形成单位(CFU)计数法进行比较,菌落计数采用独立样本t检验进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。 结果 当细菌负荷设定为10 ⁷CFU/ml时,在PMAxx浓度为10μmol/L、暗孵育10min后曝光15min可有效鉴别活菌、死菌(ΔCq_死-活=6.772±0.453),且使用>200bp靶标片段可更有效地反映活菌、死菌的差异。PMAxx-qPCR方法在药物作用后3d可获得与MABA法一致性良好的最低抑菌浓度(MIC)检测结果(INH:0.049~0.076μg/ml与0.032~0.064μg/ml,t=0.782,P=0.491;RFP:0.102~0.145μg/ml与0.051~0.079μg/ml,t=2.828,P=0.066)。定量标准曲线Cq与菌计数(lgCFU/ml)呈良好的线性关系(R ²=0.9863),最低检测限为10 ²CFU/ml,且PMAxx-qPCR方法和CFU计数方法测算16×MIC、8×MIC、4×MIC、2×MIC和1×MIC浓度的INH的抗菌计数分别为(4.376±0.344)和(4.325±0.318)、(4.232±0.106)和(3.936±0.194)、(4.122±0.277)和(3.874±0.105)、(3.950±0.113)和(3.675±0.250)、(3.770±0.228)和(3.618±0.257)CFU/ml,两种方法计数比较差异均无统计学意义(t值分别为0.165、1.894、1.186、1.419和0.626,P值分别为0.880、0.199、0.357、0.292和0.595),而16×MIC、8×MIC、4×MIC、2×MIC和1×MIC浓度的RFP的抗菌计数分别为(4.577±0.216)和(4.675±0.250)、(4.445±0.054)和(4.374±0.675)、(3.627±0.173)和(3.154±0.076)、(1.946±0.359)和(2.159±0.083)、(1.552±0.423)和(0.960±0.202)CFU/ml,两种方法计数比较差异均无统计学意义(t值分别为0.469、0.199、3.535、0.784、1.777,P值分别为0.671、0.855、 0.071、0.490、0.174)。结论 建立的PMAxx-qPCR方法稳定,可应用于一线抗结核药物INH和RFP的活性检测,敏感度高且快速准确。     

五种抗结核新药在小鼠体内的药代动力学/药效学初步研究

目的 在BALB/c小鼠结核病模型中,研究普托马尼(pretomanid,PA-824)、德拉马尼(delamanid,Dlm)、氯法齐明(clofazimine,Cfz)、贝达喹啉(bedaquiline,Bdq)、PBTZ-169共5种抗结核药物在不同给药剂量下的药代动力学/药效学(pharmacokinetic/pharmacodynamics,PK/PD)。方法 BALB/c小鼠经气溶胶感染结核分枝杆菌标准株H37Rv,5种药物分为高中低3个剂量组灌胃给药。在给药4周和8周时,解剖小鼠,取脾、肺脏进行菌落单位(colony forming unit,CFU)计数以评价药物疗效,同时在4倍测定最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的含药培养板上,挑取单菌落并测定MIC值。在各给药组给予最后一个剂量3h后,通过眼眶采血,用液相色谱-质谱法测定血浆药物浓度。结果 以各药物引起小鼠肺部CFU计数下降且与对照组差异有统计学意义为标准,得到最低有效剂量分别为PA-824 30mg/kg,Dlm 5mg/kg,Cfz 5mg/kg,Bdq 6.25mg/kg,PBTZ-169 20mg/kg。自最低有效剂量起,各药物均使得小鼠肺CFU计数下降,其中Bdq与PA-824高剂量组小鼠肺CFU计数分别下降2.99和2.66 log₁₀值。5种药物给药8周时,在最低有效剂量下的血药浓度(C_3h)分别为PA-824(7.60±1.28)μg/ml,Dlm(0.20±0.05)μg/ml,Cfz(0.26±0.02)μg/ml,Bdq(0.22±0.07)μg/ml,PBTZ-169(74.56±17.80)ng/ml。各药物高剂量时,C_max/MIC大于特定数值,即PA-824 100mg/kg时,C_max/MIC>147;Dlm 10mg/kg时,C_max/MIC>100;Cfz 20mg/kg时,C_max/MIC>2;Bdq 25mg/kg时,C_max/MIC>13.6;PBTZ-169 20mg/kg时,C_max/MIC>150,不易产生药物耐受性/表型抗性。结论 5种抗结核药物在有效剂量下,血药浓度随药物剂量增加而上升,CFU计数与给药剂量呈负相关,C_max/MIC是与疗效呈良好相关性的PK/PD参数,可为这些药物的临床使用提供指导。     

快速荧光生长指示管检测法对各种抗酸分支杆菌培养的研究

目的　探讨快速荧光生长指示管培养法对各种抗酸分支杆菌菌株培养的适应性。方法 应用本室研制的快速荧光生长指示管(以下简称RFGIT),定量接种各种抗酸分支杆菌标准菌株,并与改良罗氏培养管(LJ管)和BD公司MGIT快速培养管进行配对比较;用结核分支杆菌H37Rv株梯度稀释,分别接种RFGIT、MGIT和LJ管,记录出现阳性结果时间。结果 RFGIT对19种标准菌株培养阳性检出时间,平均为4.68±2.48d;MGIT管培养为5.39±2.89d。有8种菌株RFGIT检出时间显著早于MGIT管。接种不同浓度H₃₇Rv,在3种培养管配对比较,RFGIT阳性检出时间较MGIT管提前1～5d,平均提前3.2d;较改良罗氏法提前11～31d,平均提前19.1d。结论 RFGIT对各标准菌株及不同浓度H₃₇Rv培养阳性的检出时间均明显早于改良罗氏培养管;部分菌株明显早于MGIT培养管。结果表明RFGIT是一种有效、安全、经济和快速的培养法。     

Intracellular growth and drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis in macrophages

Intracellular growth of Mycobacterium tuberculosis in human and rabbit monocytes and in mouse and guinea pig macrophages was evaluated. Monocytes or macrophages were infected with M. tuberculosis H37Rv with the multiplicity of infection at 10 mycobacteria per monocyte. The average percentages of infected human and rabbit monocytes were 22% and 19%, while mouse and guinea pig macrophages were 46% and 58%, respectively. The average generation times of M. tuberculosis H37Rv inside human and rabbit monocytes and in mouse and guinea pig macrophages, after culturing the infected cells for 10 days, were 33.4, 50.3, 31.4, and 25.6 h, respectively. Using infected guinea pig macrophages for intracellular evaluation of drug susceptibility, the minimal inhibitory concentrations (MICs) of isoniazid to the intracellular and extracellular M. tuberculosis H37Rv were 0.1 and 0.4 microg/ml, while the MICs of rifampicin were 0.1 and 0.2 microg/ml, respectively. The minimal bactericidal concentrations (MBCs) of isoniazid to the intracellular and extracellular H37Rv were 0.2 and 0.4 microg/ml, while the MCSs of rifampicin were 0.1 and 0.2 microg/ml, respectively.     

高剂量异烟肼、利福喷丁在健康汉族人群中的药代动力学及安全性研究

目的 评价高剂量异烟肼、利福喷丁在健康汉族人群中的药代动力学表现以及安全性,为实施结核病预防性治疗提供临床证据。方法 2019年10—12月上海市公共卫生临床中心招募36名健康受试者,按1:1随机区组分为国产制剂组(T组)18名和参比制剂组(R组)18名, T组单次口服国产异烟肼、利福喷丁各900mg,R组单次口服异烟肼、利福喷丁参比制剂各900mg,每组随机一半受试者空腹服药(T1组9名,R1组9名),另一半受试者餐后服药(T2组9名,R2组9名)。服药后在规定时间点采集静脉血并分离血浆,采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS)测定血浆中的药物及代谢物浓度,采用Phoenix WinNonlin 8.1软件计算药代动力学参数,并记录72h观察期内所有不良事件。结果 T1组和R1组比较,利福喷丁的峰浓度C_max分别为(21.2±7.3)μg/ml和(15.2±2.8)μg/ml(t=3.256,P=0.003),AUC_0~t分别为(624.3±327.4)μg·h/ml和(479.4±141.8)μg·h/ml(t=1.724,P=0.094);异烟肼的C_max分别为(29.9±4.5)μg/ml和(25.2±6.8)μg/ml(t=2.445,P=0.020);AUC_0~t分别为(80.7±21.4)μg·h/ml和(80.4±12.7)μg·h/ml(t=0.051,P=0.960)。T2组和R2组比较,利福喷丁的C_max分别为 (25.4±6.8)μg/ml和(26.5±5.2)μg/ml(t=-0.545,P=0.589),AUC_0~t分别为 (756.4±253.2)μg·h/ml和(779.7±175.5)μg·h/ml(t=-0.321, P=0.750);异烟肼的C_max分别为(11.5±1.6)μg/ml和(10.9±1.5)μg/ml(t=1.161, P=0.253),AUC_0~t分别为(54.2±9.3)μg·h/ml和(55.8±8.9)μg·h/ml(t=-0.527,P=0.602)。T1组与R1组利福喷丁的C_max、AUC_0~t几何均数比值的90%CI分别为102.7%~158.9%和87.4%~169.0%,异烟肼的C_max、AUC_0~t几何均数比值的90%CI分别为100.0%~147.8%和80.9%~120.4%;T2组与R2组利福喷丁的C_max、AUC_0~t几何均数比值的90%CI分别为78.3%~113.6%和74.3%~119.5%,异烟肼的C_max、AUC_0~t几何均数比值的90%CI分别为91.8%~120.8%和82.1%~114.6%。未见严重不良事件报告。结论 根据两组药代动力学指标的几何均数的90%CI,国产异烟肼、利福喷丁与参比制剂的药代动力学表现接近,但不完全等效,单次服药安全性良好。