人骨髓基质干细胞克隆对脐血造血干细胞体外扩增作用的研究

目的：探讨人骨髓基质干细胞的克隆化培养及其对体外造血干细胞扩增的影响。方法：取正常肋骨分离骨髓，制备单个核细胞贴壁培养，约5d后取集落样生长的梭形细胞扩增培养，传代、将分选的脐血造血干／祖细胞接种到克隆培养的人骨髓基质干细胞及其他培养条件液上，比较不同培养条件及不同代次骨髓基质干细胞对造血干／祖细胞扩增能力及集落形成能力的影响。结果：人骨髓基质干细胞能扩增达20代以上，经流式细胞仪检测证实基质干细胞，单纯细胞因子组和细胞因子加基质干细胞组能有效扩增造血细胞，而后者有维持长期造血的作用。结论：该克隆培养方法能有效扩增骨髓基质干细胞，培养的细胞有体外支持长期造血的作用。     

Nogo-c基因的克隆、测序及真核表达载体的构建

目的 克隆Nogo-c的cDNA序列，并构建其真核表达载体，为进一步研究其抑制神经生长机制奠定基础。方法 根据基因GenBah中Nogo-c基因的碱基序列，利用RT-PCR的方法从鼠脑组织中扩增编码Nogo-c基因，将目的片段与pMD18T载体连接，利用亚克隆的方法将Nogo-c的cDNA片段克隆到peDNA3．1载体中，并进行序列测定。结果 DNA测序证实该片段序列与文献报道完全一致。结论 成功构建出pcDNA3．1-Nogo-c真核表达载体。     

EBV-LMP1 cDNA的克隆测序与原核表达质粒构建

目的：克隆EBV－LMP1 cDNA，构建EBV－LMP1基因的原核表达重组质粒。方法：通过RT－PCR技术从B95－8细胞中扩增EBV－LMP1 cDNA，克隆至pGEM-T easy载体上并测序；利用引物上的BamH I与HindⅢ酶切位点将LMP1基因插入载体pET-32a，转化JM109菌。提取质粒，限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果：扩增的LMP1 cDNA长度为1158bp，测序结果与已知序列吻合，重组原核表达质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子。结论：成功克隆了EBV－LMP1 cDNA，并构建了pET-32a-LMP1原核表达载体，为研究LMP1在EBV致瘤中的作用及肿瘤疫苗奠定了基础。     

脐血造血干细胞移植的研究进展

脐血中含有较丰富的造血干（祖）细胞，利用这一特性可以替代骨髓进行干细胞移植，这在临床上已获成功。与异基因骨髓移植比较，脐血干细胞移植具有易于重建造血，移植物抗宿主反应（ＧＶＨＤ）发生率及严重程度较低，但移植后骨髓抑制期较长。目前的研究重点是无血源供体和成人脐血干细胞移植以及是否有抗白血病作用。     

IL-18基因的克隆及其在宫颈癌细胞中的表达研究

目的：研究白细胞介素18(Interleukin-18，IL18)基因能否在宫颈癌细胞(Hela细胞)中表达。方法：从人胎脑RNA中RT-PCR扩增IL-18基因，构建真核基因表达载体pcDNA3．1( )-IL18，并转染到宫颈癌细胞中，收集细胞转染后24-48h上清，Western-Blotting检测IL18基因在宫颈癌细胞中的短暂表达。G418筛选稳定表达IL18基因的单克隆宫颈癌细胞，利用RT-PCR、Western—Blotting检测IL18基因在宫颈癌细胞中的稳定表达。研究为三组：1．空白Hela细胞组；2．空载体pcDNA3．1( )转染Hela细胞组；3．pcDNA3．1( )-IL18传染Hela细胞组。结果：1．成功克隆IL18基因。2．成功构建真核基因表达载体pcDNA3．1( )-IL18。3．短暂表达结果：Western—Blotting检测pcDNA3．1( )-IL18组在14．4至20．1KDa之间有一特异性条带(18．3KDa)，空白Hela细胞组和空载体pcDNA3．1( )组均没有任何条带。4．稳定表达检测结果：(1)RT—PCR结果：pcDNA3．1( )-IL18组扩增到一特异性DNA条带，位于750至1000bp之间，空白Hela细胞组和空载体pcDNA3．1( )组均没有扩增到任何条带。(2)Western-Blotting结果：pcDNA3．1( )-IL18组在14．4至20．1KD之间有一特异性条带(18．3KDa)，空白Hela细胞组和空载体pcDNA3．1( )组均没有任何条带。结论：1．成功克隆ILl8基因并构建真核基因表达载体pcDNA3．1( )-IL18。2．IL18基因成功导入到宫颈癌细胞Hela细胞中，并且有表达。     

人外周血IL-12 P35 cDNA的巢式PCR扩增、克隆与测序

目的 克隆中国汉族人IL—12P35 cDNA序列，并进行序列测定。方法 利用反转录巢式PCR从健康人外周血总RNA中扩增IL—12P35 cDNA序列，插入T载体PMD—T中，重组质粒转化大肠杆菌JM109，所获克隆经PCR初筛后进行酶切鉴定，阳性克隆进行DNA测序。结果 从健康人外周血总DNA中扩增出约670bp条带，与预期大小相同，PCR与酶切鉴定证明得到PMD／P35阳性克隆，DNA测序证实了插入片段的正确性。结论 在体外成功的扩增、克隆了中国汉族人IL—12P35 cDNA序列。为继续开展IL—12的基础与应用研究奠定了基础。     

脐血造血干细胞移植的研究进展

脐血中含有较丰富的造血干(祖)细胞,利用这一特性可以替代骨髓进行干细胞移植,这在临床上已获成功。与异基因骨髓移植比较,脐血干细胞移植具有易于重建造血,移植物抗宿主反应(GVHD)发生率及严重程度较低,但移植后骨髓抑制期较长。目前的研究重点是无血源供体和成人脐血干细胞移植以及是否有抗白血病作用。     

小鼠造血干细胞因子基因克隆及在CHO细胞中的表达

克隆造血干细胞因子并在ＣＨＯ细胞中表达。方法：采用ＰＣＲ方法从ｐＲＣ／ＣＭＶ（含ＳＣＦｃＤＮＡ）中钓取ＳＣＦｃＤＮＡ膜外段活性区，克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３，转染入ＣＨＯ细胞；用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ｍＲＮＡ水平表达及通过协同刺激骨髓细胞集落形成来检测转染细胞上清的生物活性。     

人白细胞介素-24基因的克隆及序列测定

目的克隆人白细胞介素-24(hIL-24)基因，以供重组表达。方法利用自行设计合成的一对引物，采用RT-PCR技术从LPS活化的人外周血单个核细胞的总RNA中分离hIL-24cDNA并重组到pUCl9载体上，进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果PCR及酶切产物电泳结果均证明所克隆的基因为621bp。经序列测定证实所克隆的hIL-24与GenBank报道的结果完全一致。结论该基因系国内首次获得并经序列测定证实的hIL-24cDNA基因。这为进一步在真核或大肠杆菌中高效表达有活性的重组hIL-24，更深入地研究其作用机制以及临床应用奠定了坚实的基础。     

大鼠脑RC3基因的cDNA克隆及序列分析

目的：为研究脑特异性基因-RC3的功能，克隆该基因的cDNA。方法：以大鼠脑为材料提取总RNA并分离纯化poly(A)^ RNA，用作模板以嵌套式逆转录PCR方法克隆RC3cDNA，并将其重组入pUC18质粒，然后用双脱氧末端终止法进行碱基序列分析。结果：大鼠脑RC3cDNA序列有一个碱基差别，但不涉及氨基酸的改变。结论：为进一步研究RC3的功能提供了实验基础。     

人瘦素基因克隆与序列测定

【目的】构建人瘦素基因cDNA克隆 ,并进行序列分析。【方法】用逆转录聚合酶链反应扩增人瘦素基因cDNA ,获得片段 (6 40bp)连接至 pUC19载体 ,并转化大肠杆菌DH5α。以末端终止法进行序列测定。【结果】所克隆的人瘦素cDNA含全长的人瘦素基因编码区 ,仅 2 87位的腺苷酸被鸟苷酸代替 ,导致 96位编码谷氨酰胺的密码子CAA改变为编码精氨酸的CGA ,其意义尚待阐明。【结论】以逆转录聚合酶链反应方法成功地构建了人瘦素基因cDNA克隆。     

国人 ICA69 基因 cDNA 的克隆及序列分析

目的：克隆国人胰岛细胞自身抗原６９ｋＤ蛋白基因（ｈｉＩＣＡ６９）并经序列分析予以确证。方法：采用聚合酶链式反应技术,从中国人胰岛细胞瘤ｃＤＮＡ文库中扩增出ｈｉＩＣＡ６９编码序列ｃＤＮＡ,将基因片段插入ｐＳＰＯＲＴ１质粒,进一步亚克隆到ｐＵＣ１８载体中,经蓝白斑和限帛性酶谱分析得以初步筛选后,双脱氧末端终止法对其全部核苷酸序列予以确定。结果：证实了ｈｉＩＣＡ６９基因全长为１４４９ｂｐ、编码４８３个氨     

人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的克隆、测序及表达

目的：扩增、克隆人骨形成蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）成熟肽ｃＤＮＡ基因，利用大肠杆菌表达ｈＢＭＰ－３成熟肽．方法：ＰＣＲ方法扩增ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，双脱氧终止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＤＨ，受控于ＰＲＰＬ启动子，重组质粒ｐＤＨＢ－３ｍ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌在４２℃进行温度诱导．结果：扩增出ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，序列测定完全正确；含重组质粒ｐＤＨ－Ｂ３ｍ的工程菌诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带，分子质量为１４．５ｋｕ，与预期ｈＢＭＰ－３成熟肽分子量大小一致，约占菌体总蛋白的２８％．结论：成功扩增、克隆ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，并可在大肠杆菌中得到高效表达     

造血干细胞临床研究热点分析

基于论文、专利、药物研发及临床实验等多源数据,利用计量分析、文本挖掘与可视化等方法分析2009-2018年造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell,HSC）领域发展趋势、研究主题、重点药物及重大病症,总结临床研究与应用热点,以期为临床决策与科技管理提供参考。     

人类cyclophilin A基因cDNA的克隆和序列测定

目的:克隆人类环孢霉素A受体亚型cyclophilinA(CypA)基因,对该基因进行序列测定。方法:利用EST重叠序列拼排技术,设计特异性CypA引物,以人外周血白细胞总RNA为模板,进行RT-PCR扩增,纯化PCR产物,装pGEM-T载体,进行DNA序列测定。结果:成功克隆了人类Cyp A基因cDNA序列的开放阅读框,经DNA序列测定证实序列正确。结论:通过克隆人CypA基因,并克隆人pGEM-T载体,为下一步的基因表达和功能研究奠定了实验基础。     

人类白细胞介素2表达型基因重组子pRET—90的构建

应用基因重组技术,将人类白细胞介素2(IL-2)cDNA的440bp限制性内切酶片段(HgiAI-DraI)重组于T_7 promotor质粒pET 3d的Ncol克隆点,构建成表达型重组质粒pRET-90。     

人Gfil基因克隆及重组Gfil慢病毒表达载体的构建

目的 克隆人Gill基因的全长cDNA,构建用于真核细胞表达的含有Gfil基因ORF区的重组慢病毒表达载体pLOX-Gfil,为研究Gfil基因的功能打下基础.方法 应用RT-PCR从人K562细胞系中扩增出Gfil cDNA片段·经回收纯化与pGEM-T载体连接并转化感受态菌DH5a,通过蓝白筛选酶切鉴定出阳性菌落,质粒提取,BamH I限制性内切酶酶切获得目的 基因,插入慢病毒载体pLOX中并转化感受态细菌DH5a.质粒提取后进行酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行DNA序列分析.结果 RT-PCR扩增获得含有约1.2 kb的DNA片段,酶切及PCR鉴定证实pLOX-Gfil含有大小正确的正向Gfil cDNA,DNA序列分析的结果 与发表于GenBank上的序列(NM005263)完全一致.结论 成功克隆人Gfil基因并构建用于真核细胞表达的重组慢病毒载体pLOX-Gfil.     

人era基因的克隆测序及表达

目的 克隆人的ｅｒａ基因（简称Ｈｅｒａ）开利用大肠杆菌进行表达。方法 ＰＣＲ扩增Ｈｅｒｑ基因,正确后克隆入大肠直菌融合表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ３,受控于Ｐｔａｃ启动子,重组质粒ｐＧＥＸ－Ｈｅｒａ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌,用ＩＰＴＧ进行诱导表达。结果 克隆了Ｈｅｒａ基因,测序正确,含重组质９粒ｐＧＥＸ－Ｈｅｒａ的菌体诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带,相对 分子质量为６５ｋｕ,占菌体总蛋白