星形胶质细胞水通道蛋白-4在高渗液中的表达变化

目的研究高渗培养液对体外培养星形胶质细胞表达水通道蛋白-4(Aquaporin-4,AQP4)的影响及AQP4在高渗性脱水中的作用.方法取生后2 d的Wistar大鼠的大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养,分别予不同程度的高渗培养液作用于星形胶质细胞,建立星形胶质细胞对高渗液反应的实验模型.通过形态学观察、PT-PCR、免疫细胞化学、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及图像分析等方法,研究体外星形胶质细胞对高渗液的反应及AQP4 mRNA和蛋白的表达变化.结果高渗组各时相点吸光度A值均低于对照组(P＜0.05),星形胶质细胞表现出特征性的细胞脱水形态学变化,AQP4mRNA和蛋白的表达均显著高于对照组(P＜0.01),尤以作用12 h后最明显,而且AQP4 mRNA和蛋白的表达呈显著正相关(rs＞0.8485,Ps＜0.01).结论在高渗状态下,AQP4 mRNA和蛋白的表达增强,AQP4表达上调在高渗性脱水的早期(＜12 h)可能起到重要的代偿作用.     

星形胶质细胞AQP9在高渗液中的表达变化

目的 研究星形胶质细胞水通道蛋白-9(aquaporin-9,AQP9)在高渗培养液中的表达变化及AQP9在高渗性脱水中的作用.方法 取生后2 d的新生Wistar大鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养,分别予不同程度的高渗堵养液作用于细胞,建立星形胶质细胞对高渗液反应的实验模型.通过免疫细胞化学和PT-PCR方法研究星形胶质细胞对高渗液的反应及AQP9mRNA和蛋白的表达变化.结果 星形胶质细胞经渗透压为320、333 mmol/L的培养液作用3、6、12、24 h后,AQP9 mRNA和蛋白的表达均显著高于对照组(P<0.05),尤以作用6 h后较明显,而且AQP9 mRNA和蛋白的表达呈显著正相关(r>0.7971,P<0.01).结论 高渗引起AQP9基因表达上调,AQP9在高渗性脱水的早期可能起到重要的代偿作用.     

细胞松弛素D对大鼠脊髓星形胶质细胞水通道蛋白和内向整流性钾通道4.1 基因表达的影响

目的探讨不同浓度细胞松弛素D(CytD)对大鼠脊髓星形胶质细胞骨架重构,水通道蛋白(AQP)1、AQP4 及内向整流性钾通道4.1(Kir4.1)基因表达的影响。方法原代培养大鼠脊髓星形胶质细胞,加CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml、0.40μg/ml、0.80 μg/ml 和1.00 μg/ml 共培养2 h、12 h 和24 h。MTT法检测细胞增殖情况;鬼笔环肽联合Hoechst 33342 套染后激光共聚焦显微镜下观察共培养2 h 后细胞骨架重构情况;RT-PCR法检测共培养2 h 时AQP1、AQP4 和Kir4.1 mRNA表达水平。结果细胞生存率随CytD 浓度升高和作用时间延长而减少。CytD 使大鼠脊髓星形胶质细胞微丝发生解聚、弯曲,但极性未失。CytD 0.05μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml 和0.40 μg/ml 上调AQP1、AQP4 和Kir4.1 mRNA表达。结论适当浓度CytD可以重建星形胶质细胞骨架,上调大鼠脊髓星形胶质细胞AQP1、AQP4和Kir4.1基因表达。     

低渗液对星形胶质细胞水通道蛋白-9表达的影响

目的探讨体外培养星形胶质细胞在低渗状态下水通道蛋白-9(aquaporin-9,AQP9)表达的变化特点及其所起的作用。方法取生后2d的Wistar大鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养,随机分为对照组和低渗组(又分268、254、240mmol/L三个组),每组分为3、6、12、24h共4个时间点,每个时间点细胞孔数为6。对照组予正常培养液常规培养,低渗组分别予不同渗透压的低渗液作用于细胞,建立星形胶质细胞对低渗液反应的实验模型。通过采用原位杂交检测AQP9mRNA的表达,乳酸脱氢酶活性的测定及图像分析等方法研究星形胶质细胞对低渗液的反应及AQP9的表达变化。结果对照组在正常渗透压培养液中培养3、6、12、24h后,AQP9表达差异无统计学意义(P>0.05)。在相同的作用时间条件下,各低渗组细胞AQP9mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.05)。尤以作用12h后明显,而且与作用时间和低渗液的程度密切相关;同时细胞存活能力明显下降,其严重程度与低渗液的作用时间和渗透压有关。结论低渗液可导致细胞的生存能力下降、AQP9mRNA表达增强,提示星形胶质细胞AQP9的表达与渗透压可能直接相关,AQP9可能参与脑水肿的形成。     

低渗液对AQP4蛋白在体外培养星形胶质细胞中的表达变化

目的　研究低渗培养液对星形胶质细胞AQP4蛋白的表达变化 ,并探讨其在脑水肿中的作用机制。方法　取出生后 2d的Wistar大鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养 ,分别予不同程度的低渗培养液作用于星形胶质细胞 ,建立星形胶质细胞对低渗压反应的实验模型。应用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法测定细胞活性 ,采用免疫细胞化学法检测AQP4蛋白的表达 ,通过光镜观察低渗液对星形胶质细胞形态学影响。结果　体外培养的星形胶质细胞在不同程度的低渗培养液作用 3、6、12、2 4h后 ,各时相点的AQP4蛋白表达水平均明显高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,而且与作用时间和低渗压的程度密切相关 ;在光镜下 ,星形胶质细胞出现典型的细胞水肿形态学改变 ,其活性明显下降。结论　低渗液可导致星形胶质细胞水肿 ,AQP4蛋白表达增强 ,而且AQP4表达上调与低渗压的程度和作用时间有关 ,抑制AQP4的表达可能为脑水肿的治疗提供新的理论依据。     

体外培养大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4的表达

目的研究水通道蛋白4(AQP4)在体外培养大鼠星形胶质细胞中的表达规律。方法取新生1 d Wistar大鼠大脑皮层行星形胶质细胞原代培养,分别于原代培养3 d、5 d、7 d、9 d及传代培养9 d行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色;实时荧光定量聚合酶链反应及AQP4免疫荧光染色检测AQP4 m RNA及蛋白的表达。结果原代及传代培养不同时间点95%以上细胞GFAP免疫荧光染色阳性,且GFAP表达量逐渐增加。原代培养3 d有AQP4 m RNA表达,3 d和5 d AQP4 m RNA表达水平无显著性差异(P0.05),7 d AQP4 m RNA表达升高(P0.05),9 d持续升高(P0.05);传代培养9 d与原代培养9 d AQP4 m RNA表达无显著性差异(P0.05)。AQP4蛋白表达与AQP4 m RNA表达一致。结论大鼠星形胶质细胞原代培养3 d即有AQP4表达,之后逐渐增加,9 d左右表达渐趋稳定。     

高渗液对体外培养星形胶质细胞中水通道蛋白4 mRNA表达的影响

目的　研究体外培养星形胶质细胞高渗状态下水通道蛋白 4 (AQP4 ) m RNA表达的变化特点及其所起的作用。方法　取生后 2 d的新生 Wistar大鼠大脑皮质进行星形胶质细胞纯培养 ,分别用不同渗透压的高渗培养液作用于星形胶质细胞 ,建立星形胶质细胞对高渗反应的实验模型 ;采用原位杂交、乳酸脱氢酶(L DH)活性测定及图像分析等方法 ,研究体外培养星形胶质细胞对高渗液的反应和 AQP4 m RNA的表达规律。结果　 32 0、333和 345 m mol/ L的高渗培养液作用于星形胶质细胞 3、6、12和 2 4 h后 ,L DH活性测定的吸光度 A值在各时间点均显著高于对照组 (P均 <0 .0 5 ) ;原位杂交分析表明 ,AQP4 m RNA表达明显增高 ,与正常组相比有显著意义 ,尤以高渗液作用 12 h时最明显 ,而且与作用时间及渗透压相关。结论　在高渗状态下 ,细胞活性明显下降 ,AQP4 m RNA表达增强。 AQP4可能在高渗性脱水的早期起重要的调节作用。     

有丝分裂原活化蛋白激酶信号通路介导大鼠星形胶质细胞氧糖剥夺后水通道蛋白4的表达

目的探讨有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是否介导缺血后大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)的表达。方法分离培养新生Sprague-Dawley大鼠脑星形胶质细胞。第2代细胞分成对照组、氧糖剥夺(OGD)组和阻断组。后两组复制OGD 5 h后复氧模型,12 h后阻断组分别换入含U0126(1μmol/L和10μmol/L,U1组和U10组)、SP600125(1μmol/L和10μmol/L,SP1组和SP10组)和SB203580(1μmol/L和10μmol/L,SB1组和SB10组)的培养液。复氧后0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、8 h和12 h检测OGD组细胞体积,复氧后0.5 h、1 h、1.5 h、8 h和12 h Western blotting法检测OGD组AQP4表达;复氧后24 h,检测各组乳酸脱氢酶(LDH)活性,Western blotting法检测各组AQP4,磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)、c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)和p38MAPK(p-p38 MAPK)表达。结果复氧后1.5 h、2 h、3 h和4 h时,OGD组细胞体积较对照组显著增大(P0.001),OGD组AQP4水平较对照组显著升高(P0.001),并在复氧后1.5 h达到峰值。OGD组p-ERK、p-JNK和p-p38 MAPK、AQP4水平较对照组显著增加(P0.001),阻断组p-ERK、p-JNK和p-p38 MAPK较OGD组显著下降(P0.001),SB10组AQP4较OGD组显著下降(P0.001)。除SP1组、SB1组外,各干预组LDH活性较OGD组显著下降(P0.01),SB10组最低(P0.001)。结论 MAPK信号通路,特别是p38MAPK可介导大鼠星形胶质细胞AQP4蛋白表达,加重细胞坏死。     

培养星形胶质细胞缺氧/复氧时水通道蛋白4表达的变化

目的:探讨缺氧/复氧对体外培养星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)表达的影响.方法:培养的大鼠脑皮层星形胶质细胞分成两组:正常对照组和缺氧/复氧组.缺氧8 h后复氧.根据复氧时间不同,又分为复氧0、4、6、8、12、24 h 6个亚组.于各时间点以检测细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率,Western blot法检测AQP4的表达.结果:缺氧8 h后随着复氧时间的延长,细胞存活率逐渐降低,至复氧12 h时,达最低,仅有对照组的81.3%,至复氧24 h,又有轻度增加;LDH的漏出率逐渐增多,至复氧24 h达最高峰.AQP4表达随着复氧时间延长而逐步增多,至复氧12 h时达最高峰,为正常对照组的(2.52±0.35)倍,24 h时略有下降.结论:缺氧/复氧过程能对体外培养的星形胶质细胞产生损伤作用的同时,发生了AQP4的表达时程变化.     

大鼠脑外伤诱导反应性星形胶质细胞表达水通道蛋白1和水通道蛋白9

目的 研究水通道蛋白1(AQP1)和水通道蛋白9(AQP9)在大鼠自由落体脑损伤后的表达变化以及与脑水肿的关系.方法 复制大鼠自由落体脑损伤模型,在外伤后1 h、6 h、24 h、48 h和168 h用干重-湿重法测定损伤侧脑组织水含量,利用免疫组化染色和Western印迹法检测AQP1和AQP9表达的变化.结果 脑外伤后损伤侧脑组织水含量增加,24 h达高峰,168 h接近恢复.脑外伤后6 h损伤周围出现AQP1和AQP9免疫染色阳性的星形胶质细胞,外伤后24 h免疫染色阳性细胞数最多,且损伤周围处血管内皮细胞AQP1表达异常增加.结论 脑外伤诱导AQP1和AQP9的表达,共同参与脑水肿的发展过程.     

水通道蛋白4示踪系统的构建及评价

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）标识的水通道蛋白4（AQP4）示踪系统,建立表达AQP4的大鼠星形胶质细胞水通透性的评价系统。方法利用基因重组技术,构建pEGFP-C1AQP4-M23表达质粒,并转染CTX-TNA2星形胶质细胞,利用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）成像技术分析GFP标记的AQP4-M23在细胞上的分布,动态观察钙黄绿素荧光强度随时间的变化,评价AQP4．M23对细胞膜水通透性的影响。结果正确获取AQP4-M23全长序列,利用基因重组技术连接pEGFP-C1质粒和AQP4．M23序列,酶切证实成功构建pEGFP—C1-AQP4-M23质粒。LSCM扫描显示GFP标记的AQP4-M23融合蛋白在细胞膜上均匀分布表达,胞浆内仅痕量表达;表达AQP4．M23的CTX-TNA2细胞对水的通透性明显增加（P〈0．01）。结论成功构建了GFP标识的AQP4示踪系统,建立了表达AQP4的大鼠星形胶质细胞水通透性的评价系统,AQP4可使星形胶质细胞对水的通透性明显增加。     

大麻素对星形胶质细胞谷氨酸释放的影响及机制研究

目的:观察人工合成大麻素HU210对体外培养中脑腹侧被盖(VTA)区星形胶质细胞谷氨酸释放的影响,并探讨抑制星形胶质细胞谷氨酸释放的药物治疗途径。方法:体外培养大鼠VTA脑区星形胶质细胞,RT-PCR及免疫荧光染色检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及大麻素受体1(CB1R)的表达。将培养的星形胶质细胞分为4组:对照组(培养基中只加入0.2%DMSO),HU210组(培养基中加入3μM HU210),HU210+AM281组(培养基同时加入3μM HU210及3μM AM281)和HU210+Riluzole组(培养基同时加入3μM HU210及3μM Riluzole),各组4孔。干预30 min后,采用谷氨酸检测试剂盒观察各组星形胶质细胞培养基中谷氨酸浓度。再培养VTA脑区星形胶质细胞,分为对照组(培养基中只加入0.2%DMSO)和Riluzole组(培养基中加入3μM Riluzole),干预30 min后,利用Western Blot印迹分析Riluzole干预后谷氨酸转运体-1(GLT-1)表达水平的变化。结果:RT-PCR及免疫荧光染色显示,星形胶质细胞内有广泛CB1R的表达。与对照组比较,HU210组星形胶质细胞谷氨酸的释放显著增加(P<0.01),HU210+AM281组及HU210+Riluzol组星形胶质细胞谷氨酸的释放较HU210组均显著降低(P<0.01);且HU210+Riluzol组星形胶质细胞的GLT-1表达较对照组升高(P<0.05)。结论:HU210可能通过激活星形胶质细胞的CB1R促进星形胶质细胞释放谷氨酸。Riluzole可能通过升高星形胶质细胞的GLT-1的表达,逆转HU210所致的谷氨酸释放。     

Hypertonic saline reduces lipopolysaccharide-induced mouse brain edema through inhibiting aquaporin 4 expression

Introduction

Three percent sodium chloride (NaCl) treatment has been shown to reduce brain edema and inhibited brain aquaporin 4 (AQP4) expression in bacterial meningitis induced by Escherichia coli. Lipopolysaccharide (LPS) is the main pathogenic component of E. coli. We aimed to explore the effect of 3% NaCl in mouse brain edema induced by LPS, as well as to elucidate the potential mechanisms of action.

Methods

Three percent NaCl was used to treat cerebral edema induced by LPS in mice in vivo. Brain water content, IL-1β, TNFα, immunoglobulin G (IgG), AQP4 mRNA and protein were measured in brain tissues. IL-1β, 3% NaCl and calphostin C (a specific inhibitor of protein kinase C) were used to treat the primary astrocytes in vitro. AQP4 mRNA and protein were measured in astrocytes. Differences in various groups were determined by one-way analysis of variance.

Results

Three percent NaCl attenuated the increase of brain water content, IL-1β, TNFα, IgG, AQP4 mRNA and protein in brain tissues induced by LPS. Three percent NaCl inhibited the increase of AQP4 mRNA and protein in astrocytes induced by IL-1β in vitro. Calphostin C blocked the decrease of AQP4 mRNA and protein in astrocytes induced by 3% NaCl in vitro.

Conclusions

Osmotherapy with 3% NaCl ameliorated LPS-induced cerebral edema in vivo. In addition to its osmotic force, 3% NaCl exerted anti-edema effects possibly through down-regulating the expression of proinflammatory cytokines (IL-1β and TNFα) and inhibiting the expression of AQP4 induced by proinflammatory cytokines. Three percent NaCl attenuated the expression of AQP4 through activation of protein kinase C in astrocytes.     

水通道蛋白 4 在大鼠脑缺血再灌注后脑水肿中的变化及意义

目的基于大鼠局灶性脑损伤缺血再灌注模型,观察水通道蛋白 4（AQP4）、蛋白激酶 C（PKC）的表达水平变化与脑水肿的关系。 方法线栓法复制大脑中动脉缺血再灌注模型,大鼠随机分为正常对照组、假手术组和缺血再灌注（CIR）组。通过绿色荧光蛋白 G FP 标识的 AQP4 示踪系统评价大鼠星形胶质细胞的水通透性,同时检测脑组织含水量和进行神经功能缺损评分。 AQP4 和 PKC 的表达使用免疫组织化学方法检测。 结果CIR 后 6 h 大鼠开始出现神经功能缺损,脑组织含水量在 CIR 12 h 明显升高,24 h~3 d 时达到高峰;AQP4 表达在早期水平降低,从 12 h 逐渐升高,至 CIR 24 h 明显升高,3 d 达高峰;PKC 在 CIR 6 h 后缓慢增加,连续 5 d 维持较高水平。 结论脑水肿可能和 PKC、AQP4 的升高相关,PKC 可能在 CIR 早期通过磷酸化 AQP4 以降低 AQP4 的表达以延缓脑水肿进程。