Notch1基因在食管鳞癌细胞株EC9706中的表达及其对细胞凋亡的影响

背景与目的:早期的研究显示,Notch1信号途径与肿瘤的发生密切相关,在细胞的生长、增殖、分化和凋亡中起着十分重要的作用.本研究旨在研究Notch1基因在食管鳞癌EC9706细胞中的表达及其对EC9706细胞凋亡的影响.方法:通过免疫细胞化学方法检测Notch1基因在EC9706细胞中的表达.采用RT-PCR技术扩增Notch1基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-Notch1(命名为pcNICD),转染EC9706细胞,利用RT-PCR及Western blot检测稳定转染pcNICD 载体、转染pcDNA3.1空载体及未处理的EC9706细胞中Notch1的表达,另通过流式细胞仪检测未处理、转染pcDNA3.1和转染pcNICD的EC9706细胞的凋亡.结果:EC9706细胞中发现Notch1基因的表达.与未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比,转染pcNICD的EC9706细胞中Notch1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显增加,大约增加3倍(P＜0.05);但未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞中Notch1的表达差异无统计学意义(P＞0.05).流式细胞检测结果显示,在未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞中,细胞凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05);但与与未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比.转染pcNICD的EC9706细胞转染后24 h、48 h和72 h时细胞凋亡率明显增加(P＜0.01).结论:Notch信号途径的激活引起食管鳞癌EC9706 细胞的凋亡.提示Notch1基因有可能成为治疗食管鳞癌的新靶点.     

Notch1信号途径在食管鳞癌细胞株EC9706的作用研究

目的：研究Notch1基因在食管癌细胞株中的表达及其对食管鳞癌细胞EC9706凋亡的影响.方法：通过免疫细胞化学检测Notch1基因在EC9706细胞中的表达.通过RT-PCR扩增Notch1基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-Notch1,转染EC9706细胞,利用Western blotting检测转染pcDNA3.1-Notch1载体12h,24h,48h,72h的食管癌细胞株与转染空载体食管癌细胞株中Notch1的表达,并观察每一时期食管癌细胞株的凋亡情况.结果：在食管癌细胞株中Notch1基因低表达,此外,转染Notch1后的细胞株Notch1表达量与转染空载体相比有明显差异（F=80.442,P＜0.05）.经组间两两比较,实验组食管癌细胞株的Notch1的表达量在12h时比对照组食管癌细胞株的表达量显著增高（P＜0.01）,前者约为后者的4.6倍.但48h至72h时Notch1表达量实验纽与对照组食管癌细胞株无显著性差异（P＞0.05）.进一步通过倒置显微镜发现48h至72h细胞出现大量凋亡的现象.上述结果说明12h Notch1表达量的增加,使食管癌细胞EC9706中的Notch1信号途径得以激活,该途径激活后导致48h到72h时的细胞大量凋亡.结论：Notch1在食管癌细胞中的激活引起细胞大量凋亡,提示Notch1基因有可能成为治疗食管癌的新靶点.     

siRNA阻断NF-κB信号通路联合5-Fu对食管鳞癌细胞周期的影响

目的利用RNAi技术特异性的抑制NF-κB亚单位p65的表达,探讨在食管鳞癌细胞中将NF-κB作为基因治疗靶点的价值。方法将荧光素标记的对照siRNA转染到食管鳞癌细胞中观察转染效率,p65siRNA转染到EC9706和Eca109细胞中,使用Western blot的方法检测p65和Cyclin D1蛋白的表达,使用EMSA法检测转染前后p65与DNA结合活性的变化;流式细胞仪检测p65siRNA与5-Fu(327μg/ml)单独或联合应用,对食管鳞癌细胞周期的影响。结果荧光素标记的siRNA转染食管鳞癌细胞的效率可达90%以上。在转染后的EC9706和Eca109细胞中,p65和Cyclin D1蛋白的表达水平下调;NF-κB与DNA的结合活性明显下降;G0/G1期的细胞开始增加,同时S期的细胞逐渐减少;当转染p65siRNA细胞联合使用5-Fu时,G0/G1期的细胞明显增加,同时S期的细胞明显减少。结论p65siRNA可以特异性的阻断NF-κB信号通路,下调NF-κB下游基因中细胞周期蛋白Cyclin D1的表达,表明活化的NF-κB信号通路可以成为食管鳞癌基因治疗中一个重要的分子靶点。     

PTEN 表达载体的构建及转染食管鳞癌细胞系EC9706

 目的 筛选稳定表达野生型PTEN基因的食管鳞癌细胞株EC9706。方法 提取胎盘总RNA，设计引物，PCR扩增人野生型PTEN基因，经测序鉴定后，连接于pcDNA3．1（＋）真核表达载体，构建pcDNA3．1-PTEN，用脂质体介导的方法将其转染EC9706。而后加抗生素G418筛选稳定表达株，用RT-PCR方法检测稳定表达株PTEN基因的mRNA水平，通过绘制生长曲线观察细胞生长情况。结果 PCR产物的电泳结果显示，在1500bp左右有一明显亮带，测序结果与GenBank上PTEN序列完全一致；稳定表达PTEN基因的细胞株RT-PCR结果显示，PTEN的mRNA水平比对照细胞株相比明显升高；生长曲线结果显示，转染后的细胞生长速度明显减慢。结论 所扩基因为野生型PTEN基因，所构建的载体为野生型PTEN基因真核表达载体，并筛选出PTEN基因稳定表达的食管鳞癌细胞株。     

沉默p65基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞周期的影响

目的研究miRNA(microRNA)沉默p65基因后对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞周期分布的影响。方法用pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体构建p65 miRNA表达质粒,转染MDA-MB-231细胞,用RT-PCR检测转染前后各组细胞中p65 mRNA表达变化;凝胶电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)实验研究转染前后细胞中NF-κB结合活性的变化;流式细胞术(Flow cytometry, FCM)观察转染前后细胞周期分布的变化;Westernblot法检测转染前后细胞周期相关因子cyclinD1、CDK4、p21蛋白表达的变化。结果p65 miRNA质粒明显下调MDA-MB-231细胞中p65 mRNA的表达水平,并显著抑制细胞中NF-κB的结合活性(P<0.05)。FCM结果显示,转染组细胞G₀/G₁期细胞比例显著增加,S、G₂/M期细胞比例明显下降(P<0.05);Western blot分析结果显示,沉默p65基因后细胞中cyclinD1蛋白表达下调,p21蛋白表达增加。结论p65 miRNA可以显著降低p65 mRNA的表达,诱导乳腺癌细胞发生G₀/G₁期阻滞,可能是通过降低cyclinD1蛋白,上调p21蛋白表达而实现的。     

siRNA抑制食管癌EC9706细胞CXCR4基因表达的实验

目的运用RNAi技术沉默食管癌EC9706细胞CXCR4（chemokine receptor4）基因表达,观察其对肿瘤细胞的生长和转移影响。方法设计CXCR4 基因为靶向的siRNA ,构建siRNA表达载体,通过脂质体将siRNA表达载体转入EC9706细胞。荧光定量PCR法检测细胞CXCR4 mRNA表达水平;流式细胞术检测细胞周期; MTT法检测细胞侵袭和增殖的情况。结果构建出CXCR4 基因为靶向的siRNA表达载体pRNAT-U6.2/Lenti-siCX1和pRNAT-U6.2/Lenti -siCX2;荧光定量PCR结果显示,转染pRNAT-U6.2/Lenti-siCX1的EC9706细胞和转染pRNAT-U6.2/Lenti-siCX2的EC9706细胞与对照组相比CXCR4 mRNA的表达水平明显降低（P＜0.01）;细胞生长速度较对照组明显减慢（P＜0.01）;流式细胞仪检测结果显示：转染pRNAT-U6.2/Lenti-siCX1的EC9706S期细胞比例低于对照组(P＜0.05)。结论沉默CXCR4基因表达对食管癌EC9706细胞的生长和侵袭、转移有明显的抑制作用。     

C端带His标签重组MT1G真核表达载体构建及其在EC9706中的表达

目的:构建含MT1G cDNA的重组真核表达载体,并观察在人食管癌细胞EC9706中表达情况.方法:用PCR法从含MT1G基因cDNA质粒pACT2-MT1G中扩增获得目的基因片段,正向克隆入C端带Myc和6×His标签的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(-)中.经酶切及测序鉴定后,以脂质体法转染EC9706细胞,经G418加压筛选获得阳性单克隆细胞,用RT-PCR和蛋白质印迹法技术检测MT1G mRNA和蛋白的表达.结果:成功构建了真核表达载体pcDNA3 1/Myc-His(-)-MT1G,转染pcDNA3.1/Myc-His(-)-MT1G的EC9706细胞内有带His标签MT1G融合蛋白表达.结论:获得了人MT1G重组载体和稳定表达带His标签MT1G融合蛋白的EC9706细胞株,为进一步研究MT1G的功能奠定了基础.     

RACK1对食管鳞癌细胞侵袭转移能力的抑制作用

目的:探讨RACK1表达水平与食管鳞状细胞癌不同转移潜能细胞侵袭转移能力的关系.方法:Transwell实验检测食管鳞癌EC9706-H、EC9706-L和EC109-H、EC109-L细胞的转移潜能;利用RT-PCR和Western blot方法,检测食管鳞癌高低转移细胞系EC9706-H、EC9706-L和EC109-H、EC109-L中RACK1的mRNA和蛋白表达水平.利用慢病毒转染技术上调RACK1低表达细胞中RACK1的表达后,采用Transwell实验检测其侵袭和迁移能力的变化.结果:EC9706-H细胞和EC109-H细胞的体外侵袭和迁移能力显著高于EC9706-L和EC109-L细胞系.RT-PCR和Western blot实验结果显示,RACK1在EC9706-H细胞和EC109-H细胞中呈低表达;而在EC9706-L细胞和EC109-L细胞中呈高表达.通过慢病毒转染技术上调EC9706-H和EC109-H细胞系中RACK1的表达,二者的侵袭转移能力明显降低.结论:RACK1表达水平与食管鳞癌细胞的侵袭转移能力负相关,过表达RACK1能够抑制食管鳞癌细胞的侵袭转移能力.这提示,RACK1在食管鳞癌的侵袭转移中发挥重要作用,有可能成为其诊断、治疗及预后评估的新靶点.     

异甘草素抗食管癌细胞活性及其机制研究

目的:探讨中药单体异甘草素（isoliquiritigenin,ISL）对人食管鳞癌细胞系EC9706和KYSE450的影响及其作用机制。方法:利用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测ISL对上述2株人食管鳞癌细胞系的细胞毒性;流式细胞术分析ISL对细胞周期及凋亡的影响;Western-blotting技术分析IGF1/IGF-1R信号通路相关蛋白表达以了解ISL的可能作用机制。结果:MTT实验结果表明,ISL以剂量依赖性的方式抑制食管鳞癌细胞EC9706和KYSE450的增殖,IC50值分别为 25.56 μmol/L和27.78 μmol/L。此外,ISL可将2株细胞周期阻滞在G2/M期及以剂量依赖性的方式诱导细胞发生凋亡,并且显著下调IGF-1R表达及抑制其下游PI3K/AKT和RAS/MAPK信号通路的激活。结论:ISL具有很强的抗食管癌活性,其作用机制与其调节细胞周期和促使细胞凋亡有关。本研究首次证明中药单体ISL具有抗食管癌活性,为临床运用中药治疗食管癌提供了新思路。     

HDAC6表达下调对食管鳞癌细胞周期影响的研究

目的:研究HDAC6siRNA对食管鳞癌EC9706细胞中HDAC6的干扰效果,以及HDAC6表达下调对食管鳞癌细胞增殖能力、细胞周期的影响。方法:将食管鳞癌EC9706细胞分为未处理组、对照siRNA组和HDAC6siRNA组3组,后2组分别转染对照siRNA和HDAC6siRNA。采用半定量反转录-聚合酶链反应、蛋白质印迹及免疫细胞化学检测各组食管鳞癌EC9706细胞中HDAC6siRNA对HDAC6的干扰效果;采用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖能力的变化;运用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期的变化。结果:HDAC6siRNA组的HDAC6mRNA表达的相对水平为0.044,HDAC6蛋白表达相对水平为0.114,与未处理组(0.951、0.924)和对照组(0.947、0.905)相比,HDAC6mR-NA和蛋白的表达均显著下调,t值分别为2.24和2.52,P<0.05;细胞增殖明显受抑制,且G0/G1期的比率为(68.55±2.01)%,显著高于未处理组(45.64±1.26)%和对照siRNA组(46.23±1.39)%,S期的比率(25.93±0.73)%显著低于未处理组(33.13±1.02)%和对照siRNA组(32.98±0.91)%,差异均有统计学意义,P<0.05。结论:HDAC6siRNA能有效下调食管鳞癌EC9706细胞中HDAC6mRNA和蛋白的表达;HDAC6表达下调能明显抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖并能诱导细胞周期静止在G0/G1期。     

An activated Notch1 signaling pathway inhibits cell proliferation and induces apoptosis in human esophageal squamous cell carcinoma cell line EC9706

Previous studies have demonstrated that Notch1 signaling pathway plays a major role in maintaining the balance of cell proliferation, differentiation and apoptosis, and is closely associated with tumorigenesis. However, roles of Notch1 signaling pathway in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), which is a common cause of mortality in China, remain poorly understood. Therefore, a novel strategy for seeking a rational molecular therapeutic target for ESCC is urgently needed. The purpose of this study is to examine the effect of the active Notch1 signaling pathway on the proliferation and apoptosis of ESCC cells and to investigate the underlying molecular mechanisms in carcinogenesis of the esophagus. The results revealed that a constitutively activated Notch1 signaling pathway was observed in ESCC cell line EC9706, through a pcNICD vector mediated expression system. Clearly, the activated Notch1 signaling pathway gave rise to proliferation suppression of the cells, accompanied with a cell cycle inhibition at the G0/G1 phase and apoptosis. In contrast to the expression of CDK2, cyclin D1 and cyclin E observed in EC9706 cells untreated and transfected with pcDNA3.1, there was a markedly decrease in the cells stably expressing Notch1 NICD. Up- and down-regulations of GSK3 beta and beta-catenin, respectively, indicated that Notch1 inhibited proliferation and induced apoptosis of EC9706 cells through Wnt-mediated signaling pathway. These findings suggest that Notch1 signaling pathway may participate in carcinogenesis of the esophagus.     

Notch1通路活化抑制EC109细胞的增殖及机制探讨

背景与目的：Notch1的活化可以通过下调人类乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）早期蛋白E6和E7基因的表达抑制HPV阳性HeLa细胞系的增殖。人食管鳞状细胞癌细胞系EC109细胞为HPV18阳性细胞。本研究将Notch1胞内段（intracellular domain of Notch,ICN）转入EC109细胞,导致EC109细胞中Notch通路的组成性活化,从而探讨Notch通路活化与EC109细胞增殖的关系及机制。方法：用脂质体转染法将ICN转入体外培养的EC109细胞,用MTT法检测细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞周期;用RT—PCR检测HPV18E6／E7基因的表达;用Western印迹法检测周期蛋白激酶抑制因子p53的表达。结果：ICN转染入EC109细胞后,EC109细胞增殖受抑;细胞周期阻滞在G2／M期,转目的基因组G2／M期细胞所占比例[（42．57&#177;1．57）％]与未转染组[（1．88&#177;0．66）％]及转空质粒组[（1．99&#177;1．02）％]相比差异均有显著性（P〈0．01）。E6／E7基因表达降低;p53表达升高,转ICN组（2．15&#177;0．23）与未转染组（0．45&#177;0．07）及转空质粒组（0．46&#177;0．02）相比差异均有显著性（P〈0．01）。结论：Notch1通路活化可以NNHPV18 E6／E7基因的表达,导致p53通路的活化,使HPV18阳性EC109细胞增殖周期阻滞于G2／M期,抑制EC109细胞的生长。     

IL-1受体拮抗物基因克隆对 人食管癌细胞株生长的影响

目的：构建白细胞介素1受体拮抗物（interleukin 1- reptor antagonist,IL-1RA)基因的真核表达载体,并转 染人食管癌细胞株,以探讨IL－1RA与食管癌发生的关系。方法：利用PCR方法从正常食管组织cDNA中扩增IL－1RA,将IL－1RA重组到真核表达载体pcDNA3.1中,构建IL－1RA的真核表达载体pcDNA3.1-IL-1RA。然后将重组子导入人食管癌细胞株EC9706中,用RT－PCR及 Southern杂交的方法,筛选鉴定转染细胞,获得阳性克隆。并采用细胞计数法和流式细胞术（FCM）分析IL－1RA对EC9706细胞生长的影响。结果：RT－PCR及Southern杂交结果显示转染后的细胞克隆均呈现IL－1RA 细胞由于IL－1RA的表达,细胞增殖速度有不同程度的下降;FCM结果显示IL-1RA炒能诱导EC9706细胞的凋亡,对细胞生开的影响亦呈现不一致性。结论： 提示IL－1RA对食管癌的发生可能只起辅助作用。     

食管癌突变型DNA 聚合酶β对EC9706细胞影响的初步研究*

目的:建立过量表达食管癌突变型（点突变型和缺失突变型）DNA聚合酶β（DNAPolymeraseβ,polβ ）的EC9706细胞系,并观察其生物学特性的变化。方法:根据GenBankDNApolβ的cDNA 序列设计引物,运用PCR 方法,从质粒pcDNA 3.1-polβ中扩增出点突变和缺失突变型的DNApolβ基因,作为目的片段,定向克隆至pEGFP-N3 真核绿色荧光蛋白表达载体,获得点突变和缺失突变型的重组真核表达载体pEGFP-N3-polβ。采用脂质体转染的方法,将两种突变型的pEGFP-N3-polβ转染EC9706细胞系,荧光倒置显微镜观察其细胞定位,绘制生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期。结果:成功构建了点突变型和缺失突变型pEGFP-N3-polβ重组真核表达载体,荧光倒置显微镜结果显示缺失突变型的DNApolβ表达以细胞胞浆为主,点突变型以细胞胞核为主,而且缺失突变型的细胞生长较对照组明显减慢（P<0.05）,点突变型与对照组相比则无明显差异（P>0.05）;缺失突变型的DNApolβ还可使EC9706细胞的S期细胞明显减少（P<0.05）,而点突变型轻度减少（P<0.05）。 结论:成功建立了稳定高表达人点突变型和缺失突变型DNApolβ的EC9706细胞系,外源点突变型和缺失突变型DNApolβ在食管癌EC9706细胞表达后可以改变其生物学特性,对研究食管癌的发病机制具有重要意义。      

雷帕霉素对食管鳞癌细胞系EC9706的mTOR/p70S6K信号通路的影响

目的：观察雷帕霉素（rapamycin，rapa）对食管鳞癌细胞系EC9706的mTOR／p70S6K信号通路的影响。方法：采用免疫细胞化学证实mTOR／p70S6K信号通路的存在，然后通过DNALadder、RT—PCR、Westernblot及流式细胞术分别从DNA、RNA、蛋白及细胞水平研究rapa对细胞凋亡和信号通路的影响。结果：免疫细胞化学结果显示，在细胞核及细胞质中mTOR均呈阳性；rapa处理后有明显DNALadder产生，且mTOR的mRNA水平及蛋白水平下调。但是，mTOR下游的直接靶点p70S6K的mRNA水平及蛋白水平则升高，二者的变化程度均与rapa剂量的相关；流式细胞术检测结果表明，rapa可使细胞停滞于G1期。结论：食管鳞癌细胞系EC9706中存在mTOR／p70S6K信号通路并且处于激活状态，rapa能明显促进细胞凋亡并抑制该通路激活，从而间接抑制翻译的进行。     

STAT1基因对胶质瘤细胞系U251细胞周期的影响及其机制

 目的 探讨信号转导与转录激活因子1（STAT1）对胶质瘤细胞系U251细胞周期的影响及其机制。方法 利用LipofectamineTM2000转染试剂体外瞬时将pcDNA3.1-STAT1转染入胶质瘤细胞系U251，将细胞分为Mock组（无转染）、空载组（转染pcDNA3.1）和STAT1组（转染pcDNA3.1-STAT1），采用Western blot法检测胶质瘤U251细胞中STAT1表达水平，MTT法检测转染STAT1的U251细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞周期指标，划痕实验检测细胞迁移指标，通过Western blot法检测转染细胞中P53、P21、bcl-2、Caspase-8的表达水平及变化趋势。结果 与Mock和空载组相比，STAT1组中STAT1蛋白表达量明显增高（P<0.05），细胞增殖明显减慢（P<0.05），G₀/G₁期细胞比例明显升高，细胞的迁移能力明显下降； P53、P21、Caspase-8表达明显增强（P<0.05），bcl-2表达明显减弱（P<0.05）。结论 高表达的STAT1对人脑胶质瘤U251细胞具有抑制增殖或促进凋亡的作用，并且STAT1可调控多分子信号转导通路，对脑胶质瘤的发生和发展起到了关键的作用。     

siRNA对人食管癌EC9706细胞真核起始因子4E表达的影响

目的探讨siRNA对人食管癌EC9706细胞中eIF4E表达的影响。方法针对GeneBank中eIF4E基因的不同靶点,设计并合成两条特异siRNA及一条无义siRNA寡核苷酸模板,利用体外转录法合成siRNA,在脂质体介导下以150ng/μl、200ng/μl和250ng/μl三种浓度转染EC9706细胞,分别培养24h、48h、72h,同时设正常对照组。采用免疫细胞化学及原位杂交技术检测转染前后EC9706细胞中eIF4E蛋白和mRNA的表达;应用流式细胞技术检测转染前后EC9706细胞周期的变化情况。结果转染siRNA后细胞形态发生明显改变。不同浓度的两条特异siRNA转染细胞后,eIF4E蛋白及mRNA表达量均较正常对照组降低,并且具有显著的剂量依赖性（P<0.05）,但两转染组之间相比,差异无统计学意义（P>0.05）;无义siRNA未表现出对eIF4E基因表达的抑制效应（P>0.05）;两条特异siRNA转染组与无义siRNA转染组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。三种不同浓度siRNA转染细胞72h后与无义转染组及正常对照组相比,G₀/G₁期细胞比例显著增加,S期细胞比例相对减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论特异性siRNA能有效抑制人食管癌EC9706细胞中eIF4E基因的表达,抑制细胞增殖。