IFN—γ基因转染膀胱癌瘤苗诱导的特性抗肿瘤免疫反应

探讨转ＩＦＮ－γ基因膀胱癌瘤苗的可行性。采用脂质体介导法将携带鼠ＩＦＮ－γ基因的逆转录病毒载体转染入鼠膀胱癌细胞系ＢＴＴ７３９中，免疫荧光法检测转基因细胞ＭＨＣⅠ类抗原表达；动物实验观察其致瘤性和抗肿瘤免疫功能。     

转染IL-2基因的膀胱癌瘤苗诱导的抗肿瘤作用

为了探讨以白细胞介素2(IL-2)基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗治疗膀胱癌的应用价值,采用脂质体介导法将携带IL-2基因的逆转录病毒载体转染入膀胱癌细胞系BTT_(739)中,流式细胞仪行细胞DNA周期分析,动物实验观察放射线灭活后基因瘤苗(BTT_(739)/IL-2细胞)的抗肿瘤免疫作用。建立能分泌IL-2的膀胱癌瘤苗BTT_(739)/IL-2细胞、DNA周期分析表明IL-2基因的导入及表达对BTT_(739)细胞的增殖无影响。放射线灭活后BTT_(739)/IL-2细胞丧失增殖能力,但仍能维持一定水平的IL-2分泌活性达2周左右。先用灭活的瘤苗免疫小鼠,可诱导免疫保护,3周后接种BTT_(739)时不形成肿瘤;用灭活的瘤苗治疗荷瘤小鼠,可使50％小鼠肿瘤消退并长期存活;对治愈后长期存活的小鼠再次接种高剂量BTT_(739)细胞,仍无肿瘤形成。结果提示转染IL-2基因的膀胱癌瘤苗诱导的抗肿瘤作用对预防肿瘤的发生、抑制和清除微小瘤灶,防止膀胱癌复发具有重要的应用价值。     

膀胱肿瘤基因瘤苗诱导抗肿瘤作用的形态学研究

转染白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ制备膀胱肿瘤基因瘤苗，在同基因鼠观察基因瘤苗致瘤和抗肿瘤作用的形态学改变，并结合这些改变探讨基因瘤苗的抗肿瘤作用机制。发现接种基因瘤苗所形成的肿瘤和经基因瘤苗治疗后的肿瘤生长缓慢，瘤内大量淋巴细胞浸润，并和瘤细胞粘附，瘤细胞的特征性改变是膜的孔形损害。提示基因瘤苗诱导的抗肿瘤作用主要是激活机体的抗肿瘤免疫反应。     

膀胱肿瘤基因瘤苗诱导的抗肿瘤作用

报道转染白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ制备的膀胱肿瘤基因瘤苗诱导的抗肿瘤作用并讨论其在膀胱肿瘤治疗中的应用价值。逆转录病毒载体介导ＩＬ－２ｃＤＮＡ转染鼠源性膀胱肿瘤细胞ＢＴＴ７３９后，阳性转染克隆ＢＴＴ７３９／ＩＬ－２每１０￣（１０）细胞分泌ＩＬ－２为４～１３２Ｕ·ｍｌ￣（－１）·２４ｈ￣（－１），在同基因小鼠Ｔ７３９同时接种ＢＴＴ７３９和ＢＴＴ７３９／ＩＬ－２或接种ＢＴＴ７３９后不同时间再接种ＢＴＴ７３９／ＩＬ－２，可抑制肿瘤形成；先用ＢＴＴ７３９／ＩＬ－２细胞免疫小鼠，可诱导免疫保护，再次接种ＢＴＴ７３９时不形成肿瘤。我们认为基因瘤苗诱导的抗肿瘤作用对提高膀胱肿瘤患者的免疫功能，抑制术后残余瘤细胞和多中心病变，提高治疗效果具有重要的应用价值。     

转人白细胞介素-12基因膀胱癌瘤苗的抗肿瘤作用

目的 制备人白细胞介素—12(hIL-l2)转基因膀胱癌瘤苗，观察其特异性抗肿瘤免疫作用。方法 经逆转录病毒载体将hIL—12编码基因导入膀胱癌细胞株MBT—2中，用聚合酶链反应(PCR)技术检测目的基因是否整合入MBT—2基因组中，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测hIL—12活性，将转基因细胞接种到36只荷瘤小鼠，检测细胞毒T细胞杀伤活性。结果 hIL—12 cDNA经逆转录病毒载体导入MTT—2细胞中后，hIL—12基因已完整、稳定地整合到MBT—2基因组中，使MBT—2细胞具有分泌hIL—12活性，每24h达32．8mol/L以上。转基因细胞接种荷瘤小鼠后，可见瘤体变小(P＜0．01)，细胞毒T细胞杀伤活性增强。结论 转hIL—12基因瘤苗，能够诱导小鼠的特异性抗肿瘤免疫反应。     

IFN-γ基因和IL-2基因共转染的膀胱癌瘤苗的应用基础研究

为探讨两种具有协同作用的细胞因子基因共转染的瘤苗是否具有更好的抗肿瘤作用,我们将IFN-γ(干扰素γ)基因和IL-2(白细胞介素2)基因共转染BTT739膀胱癌细胞,获得同时分泌IFN-γ和IL-2的BTT739细胞克隆株(命名为BTT739／IL-2-IFN-γ细胞),并观察其体内致瘤性和瘤苗效果。结果表明BTT739／IL-2～IFN～γ细胞的体内致瘤性明显低于IL-2基因或IFN-γ基因单独转染的BTT739细胞,而且事先接种BTT739／IL-2-IFN-γ细胞的小鼠能更好地抵抗再次接种的野生型BTT739膀胱癌细胞的生长。因此,认为IFN-γ基因和IL-2基因共转染的膀胱瘤细胞具有更佳的瘤苗效果。     

腺病毒介导的p16基因转染对膀胱癌细胞生长影响的研究

目的　探讨复制缺陷型腺病毒介导的 p16基因转染对人膀胱癌细胞生长的影响。 　方法　将 p16重组腺病毒 (Ad p16 )感染p16蛋白表达阴性的人膀胱移行细胞癌T2 4细胞株 ,Ad LacZ、X gal染色法检测重组腺病毒的转染效率 ;Westernblot法检测 p16蛋白的表达 ;MTT法及流式细胞术评估Ad p16对T2 4细胞增殖的影响。　结果　在感染复数 (MOI)为 5 0时 ,重组腺病毒对T2 4细胞的转染率达 97% ;此Ad p16在T2 4细胞中可获高效表达 ;与转染Ad LacZ组及未转染组相比 ,转染Ad p16组T2 4细胞生长受到明显抑制 (P <0 .0 5 ) ,细胞周期分析表明生长抑制主要发生在G1 S节点。　结论　腺病毒载体可有效地将外源 p16基因导入T2 4细胞 ;p16基因重组腺病毒载体转染能抑制T2 4细胞的生长。     

转Fas基因对膀胱癌细胞的作用

目的　探讨Fas基因转染对膀胱癌细胞的作用。　方法　将人FascDNA通过脂质体导入膀胱癌细胞EJ中 ,并利用Northernblot、原位杂交、流式细胞术检测细胞的FasmRNA和分子表达。用流式细胞仪、DNA梯形带和MTT法分析顺铂对转染前后的EJ细胞抑制增殖和诱导凋亡的能力。　结果　Fas基因转染可明显增强膀胱癌细胞EJ的Fas表达 ,顺铂对转染后的EJ细胞抑制细胞增殖和诱导凋亡的能力明显增强。　结论　转染的Fas基因可显著上调膀胱癌细胞EJ的Fas表达 ,促进细胞凋亡 ,联合应用Fas基因转染和顺铂可获得协同的细胞毒作用     

膀胱癌耐药细胞株MDR1基因表达水平的检测

为探讨膀胱癌耐药细胞亚系ＢＩＵ－８７ＰＲ的耐药机理，我们应用ＭＤＲ_１ｃＤＮＡ探针检测了该细胞株ＭＤＲ_１基因的表达情况，ＲＮＡ斑点杂交结果表明：膀胱癌亲代细胞株ＢＩＵ－８７为阴性，而ＢＩＵ－８７ＰＲ耐药细胞株呈阳性。提示该低度耐药细胞株的耐药机理可能与ＭＤＲ_１基因的表达有关。     

膀胱肿瘤表皮生长因子受体基因扩增及其表达的研究

为了探讨膀胱肿瘤表皮生长因子受体（ＥＧＦｒ）过表达的分子生物学行为，采用核酸分子杂交、免疫组织化学技术研究了１３例膀胱移行细胞癌ＥＧＦｒ基因扩增，ｍＲＮＡ和受体表达状况，并相互进行了比较。结果表明：１３例膀胱肿瘤中ＥＧＦｒ基因未见扩增，５例ｍＲＭ过表达，７例ＥＧＦｒ阳性，但二者表达的量并无相关性。提示在膀胱肿瘤中ＥＧＦｒ基因扩增并不普遍，而其ｍＲＮＡ及受体过表达则较常见，推断可能系ＥＧＦｒ基因转录和翻译调控机制异常引起。     

一氧化氮对组织特异性溶瘤腺病毒转染膀胱肿瘤细胞的影响

目的:研究一氧化氮(NO)对肿瘤组织特异性溶瘤病毒转染过程的影响及对外源基因表达的调节作用。方法:构建组织特异性溶瘤腺病毒,常规培养膀胱肿瘤BIU-87和5637细胞株,以硝普钠作为外源性NO的供体。应用PTIO和L-NMMA分别作为内源性NO的清除剂和诱导型一氧化氮合酶(NOS)的抑制剂。采用Nitrate/Nitrite Assay Kit检测NO和(或)病毒作用前后膀胱肿瘤细胞培养液中的NO水平。应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测NO对重组病毒抗肿瘤细胞增殖的影响;透射电镜观察腺病毒颗粒进入细胞情况和亚细胞结构变化。结果:膀胱肿瘤细胞BIU-87和5637本身培养液中NO水平很低,给予外源性NO供体后NO水平随时间延长而升高。重组病毒Ad-UPⅡ-E1A能通过E1A基因发挥溶瘤作用。NO能够促进该病毒转染入BIU-87、5637细胞。50μmol/L和100μmol/L的NO联合Ad-UPⅡ-E1A 30MOI作用后能够促进肿瘤细胞的增殖,而200μmol/L的NO联合重组腺病毒作用后则促进肿瘤细胞的死亡。NO对Ad-UPⅡ-E1A的作用具有时间依赖性。透射电镜观察发现,重组病毒Ad-UPⅡ-E1A能够进入并在膀胱肿瘤细胞内复制,而NO能够提高病毒的转染效率并引起肿瘤细胞自吞噬和凋亡。结论:NO能够促进溶瘤腺病毒Ad-UPIIE1A转染膀胱肿瘤细胞的效率,但NO因其浓度不同对溶瘤腺病毒的溶瘤效果具有双向调节作用,低剂量的NO能够下调重组病毒E1A的表达从而促进肿瘤细胞增殖,而高剂量的NO通过上调E1A的表达因而发挥溶瘤效应。     

抗肿瘤药物膀胱灌注的研究进展

抗肿瘤药物膀胱灌注是预防和治疗浅表性膀胱癌的重要手段。膀胱灌注的理想抗肿瘤药物最好是 :价廉 ,全身吸收和局部毒性极少 ,且能有效防止原发灶切除后肿瘤的复发和进展或根治不易完全切除的病灶。但目前各种灌注治疗药物大都存在着长期疗效不肯定、副作用发生率高甚至有可能出现一些不可预测的严重并发症等缺点。寻求更有效的抗肿瘤药物、更合适的灌注治疗方案以及最佳的给药方法成为目前的研究热点。     

干扰素γ和白介素2基因共转染的膀胱癌瘤苗的研究

联合应用 2种具有协同作用的细胞因子可以达到更佳的免疫治疗效果 ,如果将 2种具有协同作用的细胞因子基因共转染入一种肿瘤细胞内 ,利用这种转基因的肿瘤细胞进行细胞因子基因治疗可能会得到更佳的抗肿瘤效果。我们将干扰素γ(ＩＦＮ γ)基因与白细胞介素 2(ＩＬ 2 )基因共转染入ＢＴＴ739膀胱癌细胞内 ,并观察其体内致瘤性及作为瘤苗的治疗效果。一、材料和方法1.材料 :小鼠膀胱移行细胞癌细胞ＢＴＴ739由南京铁道医学院泌尿科提供。ＩＦＮ γ基因、ＩＬ 2基因单独转染的ＢＴＴ739细胞 (ＢＴＴ739/ＩＦＮ γ、ＢＴＴ739/ＩＬ 2 )及ＩＦＮ …     

BCG激活淋巴细胞对膀胱肿瘤细胞的抗肿瘤作用研究

利用ＢＣＧ激活的外周血单核细胞（ＰＢＭＮＣ）作为肿瘤杀伤细胞———ＢＡＫ细胞，观察其对移行上皮肿瘤细胞系ＢＴＡ和１１例原代培养细胞的细胞毒作用。结果表明，单独ＢＣＧ对培养肿瘤细胞没有细胞毒作用；ＮＫ细胞仅表现较低的细胞毒作用，在效靶比４０∶１对ＢＴＡ的特异性杀伤率为１７．６３％，对原代细胞为１２．４９％；ＢＡＫ细胞分别为３１．２６％和１９．１６％（Ｐ＜０．０５）；ＬＡＫ细胞分别为３５．５３％和２４．２１％；对ＢＴＡ细胞的细胞毒作用ＬＡＫ细胞＞ＢＡＫ细胞（Ｐ＜０．０５），对原代细胞的细胞毒作用ＬＡＫ细胞和ＢＡＫ细胞之间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。认为ＢＡＫ细胞是不同于ＬＡＫ细胞的一类肿瘤杀伤细胞，在ＢＣＧ抗肿瘤的过程中起着重要作用。     

自稳定反义IGF1R基因片段对膀胱癌细胞的影响

目的　探讨针对胰岛素样生长因子 1受体 (IGF1R )基因的自稳定反义脱氧寡核苷酸(ODN)对膀胱癌细胞的影响。　方法　采用RT -PCR、Westernblot、MTT试验、流式细胞仪对经反义ODN作用后的T2 4膀胱癌细胞进行动态分析。　结果　自稳定反义ODN在血清培养基中 2 4h内均保持稳定状态 ,而硫代反义ODN 4h后基本降解。自稳定反义ODN可有效降低T2 4膀胱癌细胞IGF1R基因及蛋白表达 ,增强膀胱癌细胞对丝裂霉素的敏感性及凋亡易感性。　结论　IGF1R基因的自稳定反义ODN可能是一种治疗膀胱肿瘤的新途径     

BCG激活膀胱肿瘤浸润淋巴细胞的抗肿瘤作用研究

为了探讨ＢＣＧ的抗肿瘤机理，从１５例手术切除的膀胱移行细胞癌新鲜组织标本中制备肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ），分别在含ＢＣＧ或ＩＬ－２的全培养基中培养扩增，测定不同培养时间的抗瘤活性。结果：用活ＢＣＧ培养的ＴＩＬ第１２天对自体肿瘤细胞的杀伤活性达高峰，杀伤率为４８．３％；用ＩＬ－２培养的ＴＩＬ第１４天达杀伤高峰，杀伤率为４３．８％，用死ＢＣＧ培养的ＴＩＬ，其扩增结果和抗瘤活性均明显低于活ＢＣＧ及ＩＬ－２。提示ＢＣＧ对ＴＩＬ的直接激活作用可能是其抗肿瘤机理之一。     

以体外侵袭力构建高转移膀胱癌细胞亚系

以穿透人工基底膜能力为依据筛选具有体外高侵袭能力的膀胱癌细胞，观察侵袭与转移的关系。用体外培养法收集扩增能侵袭穿透人工基底膜的细胞，对比筛选前后细胞体内外增殖和侵袭转移能力。结果显示：筛选后的子代细胞体外侵袭力均有明显的提高，其中有２株子代细胞裸鼠皮下接种后能形成肿瘤局部侵袭和淋巴结转移。表明侵袭对转移形成有重要影响，但完成转移还需要其它因素的参与。转移能力与细胞增殖有一定关系，但却分别受不同因素控制。     

转染XIAP基因对丝裂霉素诱导膀胱癌细胞凋亡的影响

目的：探讨XIAP基因对低剂量丝裂霉素C(MMC)诱导膀胱癌细胞凋亡的影响。方法：脂质体介导XIAP基因转染膀胱癌T24细胞3天后．用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测XIAP基因的表达．用低剂量MMC诱导细胞凋亡启动,用MTT比色法分析检测癌细胞生长活性．用3末端脱氧核苷酰转移酶介导生物素标记法检测细胞凋亡率。结果：各组癌细胞在低剂量MMC的诱导下发生凋亡、与单用MMC组比较．转染XIAP基因的癌细胞组的凋亡率显著降低。结论：XIAP基因在癌细胞中的过度表达可以明显降低化疗药物诱导的膀胱癌细胞凋亡,其可能在膀胱癌多药耐药中起一定作用。     

突变型端粒酶逆转录酶基因转染对膀胱癌细胞T24增殖的影响

目的　探讨转染缺失突变的人端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因对膀胱癌细胞株T2 4端粒酶活性和体外增殖的影响 ,为膀胱肿瘤基因治疗提供新的基因靶点。　方法　采用DNA 磷酸钙共沉淀法 ,将绿色荧光蛋白基因标记的含突变型hTERT真核表达载体 pEGFP hTERT导入人膀胱癌细胞株T2 4中。应用荧光显微镜、端粒酶PCR ELISA法、与衰老相关的 β 半乳糖苷酶染色、软琼脂集落形成试验、裸鼠皮下成瘤试验等方法动态观察转染细胞中端粒酶活性及对细胞恶性表型的影响。　结果　在转染 pEGFP hTERT细胞中可见与突变型hTERT基因融合的绿色荧光蛋白稳定表达于细胞核内 ,转染细胞端粒酶活性降低 ,衰老相关 β 半乳糖苷酶表达增加 ,软琼脂中集落形成减少 ,裸鼠成瘤性降低。与转染空载体组及未转染组细胞相比 ,差别有显著性意义 (P <0 .0 5 )。　结论　转染突变型人端粒酶逆转录酶基因hTERT能抑制膀胱癌细胞T2 4的端粒酶活性 ,促进其衰老并逆转膀胱癌细胞的恶性表型 ,对膀胱肿瘤基因治疗具有潜在的临床应用价值