玻璃化冷冻技术在人类辅助生殖中的应用

玻璃化冷冻技术是一种快速冷冻细胞或组织的方法,可避免冻融过程中细胞内冰晶的形成,最大限度的降低细胞损伤,在人类配子、胚胎的冷冻保存中取得了不少进展。近十几年来,玻璃化冷冻技术已成功应用于成熟卵母细胞、未成熟卵母细胞、精子及胚胎的各个发育时期的冷冻保存并陆续有健康婴儿出生的报道。该技术操作简单、迅速快捷,正逐渐成为人类辅助生殖技术中重要的应用技术之一。本文综述了玻璃化冷冻技术在人类辅助生殖中应用于配子、胚胎冻存的研究进展。     

玻璃化技术冷冻人类囊胚和单胚胎移植

玻璃化冷冻技术简化了胚胎冷冻程序,提高了各个阶段胚胎的冷冻保存效果,尤其是对程序化冷冻效果差的囊胚的冷冻保存,是最具有前景的胚胎冷冻方法。囊胚移植和单胚胎移植被认为是提高种植率、降低多胎妊娠率的有效方法。本文就玻璃化冷冻的影响因素和囊胚玻璃化冷冻进展综述如下。     

玻璃化冷冻对卵母细胞、胚胎和子代的影响及其相关表观遗传学的研究进展

玻璃化冷冻技术目前已逐步取代程序化冷冻技术并广泛运用于体外受精-胚胎移植助孕过程。虽然卵母细胞及胚胎经玻璃化冷冻后有较好的临床结局,但玻璃化冷冻过程中使用的高浓度冷冻保护剂、体外冷冻复苏等操作是否对卵母细胞、胚胎以及其子代的安全性造成不良影响仍然备受关注。分子层面研究结果表明,虽然玻璃化冷冻不改变哺乳动物DNA序列,但可导致基因表观遗传修饰水平的变化进而影响其靶基因表达水平。本文从哺乳动物卵母细胞和胚胎经玻璃化冷冻后对胚胎、妊娠结局和子代的影响以及对相关表观遗传修饰水平的改变进行综述,探索玻璃化冷冻对卵母细胞和胚胎影响的分子机制,为进一步提高卵母细胞和胚胎的冷冻保存技术提供理论依据。     

封闭式载杆玻璃化冷冻和程序化冷冻的临床效果比较

目的回顾性分析封闭式玻璃化冷冻技术与程序化冷冻技术在胚胎冷冻解冻及移植临床效果的差异。方法首先比较2010年11～12月采用三种开放式载杆和一种封闭式载杆对卵裂期胚胎进行的玻璃化冷冻。然后对2010年11月至2011年11月采用封闭式载杆行玻璃化冷冻和2009年1月至2010年12月采用程序化冷冻的数据进行对比,比较两组的复苏率、着床率和临床妊娠率等。结果三种开放式载杆与封闭式载杆的复苏率及着床率、临床妊娠率无显著性差异(P>0.05)。封闭式玻璃化冷冻和程序化冷冻两种冷冻方法比较显示:卵裂期胚胎采用玻璃化冷冻共2,61 9周期,解冻6,627枚胚胎,复苏6,276枚,复苏率为94.7%(6,276/6,627),1,522枚胚胎着床,着床率为24.3%(1,522/6,276),共1,1 35周期获得临床妊娠,移植妊娠率为43.3%(1,1 35/2,619),均显著高于程序冷冻组(P<0.05),后者的复苏率、着床率和移植妊娠率分别为59.9%(7,797/1 3,01 6),20.6%(1,603/7,797)和39.3%(1,224/3,11 7)。玻璃化冷冻囊胚共331周期,解冻677枚胚胎,复苏589枚,复苏率为87.0%(589/677),21 4枚胚胎着床,着床率为36.3%(214/589),168周期获得临床妊娠,移植妊娠率为50.8%(1 68/331),均显著高于程序冷冻组(P<0.05),后者共114周期,解冻21 7枚胚胎,140枚复苏,复苏率为64.5%(140/217),着床率为22.1%(31/140),妊娠率23.7%(27/114)。结论采用封闭式载杆玻璃化冷冻胚胎是一种较程序化冷冻更有效、更安全的胚胎冷冻方法。     

程序化冷冻与玻璃化冷冻卵裂期胚胎移植的母婴结局对照分析

目的探讨分析程序化冷冻与玻璃化冷冻卵裂期胚胎复苏周期移植的母婴结局。方法对102例程序化冷冻复苏周期及109例玻璃化冷冻复苏周期进行回顾性分析,比较两组的临床结局及新生儿情况。结果两组患者的一般情况相似;程序化冷冻组和玻璃化冷冻组的胚胎复苏率分别为89.7%和99.6%(P<0.05),两组的临床妊娠率、着床率、活产率分别为56.6%、38.1%、79.2%和54.1%、33.3%、71.2%,差异无统计学意义(P>0.05);两组新生儿的孕周、出生体重、出生缺陷率无显著性差异(P>0.05),玻璃化冷冻组早产率(19.2%)有高于程序化冷冻组早产率(12.3%)的趋势,但无显著性差异(P>0.05)。结论玻璃化冷冻显著提高胚胎复苏率,能提高胚胎利用率,程序化冷冻组与玻璃化冷冻组相比拥有相似甚至更好的母婴结局,玻璃化冷冻在成为常规工作之前还需加强对其母婴结局的后续研究及子代的长期随访。     

囊胚期胚胎玻璃化冷冻技术的临床应用研究(附一例成功分娩报道)

总结本中心囊胚期胚胎玻璃化冷冻方法在临床应用结果,探讨该冷冻方法临床应用的意义。一、资料与方法1.对象:对本中心2003年10月3日至11月28日17周期进行53个囊胚期行玻璃化冷冻,其中6周期16个囊胚解冻,目前还有37个囊胚继续冻存中。2.囊胚期胚胎的培养和玻璃化冷冻保存:在行体     

玻璃化冷冻小鼠胚胎对胎鼠及胎盘H19DMD甲基化状态的影响

目的 研究胚胎玻璃化冷冻对胎鼠及胎盘H19基因印记控制区(DMD)甲基化状态的影响. 方法 以正常生育期雌雄鼠合笼获得的14 d胎龄的胎鼠及胎盘为对照组;以促排卵、体外受精、体外培养及胚胎移植后获得14 d胎龄的胎鼠及胎盘作为体外受精组;冷冻组与体外受精组不同的是体外培养的胚胎经玻璃化冷冻复苏后再移植.对获得的胎鼠及胎盘提取基因组DNA,经亚硫酸盐变性后克隆测序分析H19 DMD的甲基化状态. 结果 体外受精组胎鼠H19 DMD区有甲基化丢失,胚胎冷冻组中丢失更严重;胎盘中也存在明显的甲基化丢失,但冷冻组与体外受精组相比无明显改变. 结论 本研究提示小鼠胚胎的玻璃化冷冻过程会加重体外操作等引起的植入后胎鼠H19 DMD甲基化丢失;对胎盘H19 DMD甲基化状态无明显影响.     

冻融卵母细胞显微授精后冻融胚胎移植成功并分娩一例报道

本文报道1例患者经玻璃化方法冷冻卵母细胞,解冻后行卵胞浆内单精子注射(ICSI)获得胚胎,部分胚胎行玻璃化冷冻,冻融胚胎移植后获得临床妊娠并分娩1正常男婴。为卵母细胞及胚胎多次冷冻后的临床应用及应用可行性提供一定的参考。     

人成熟卵母细胞玻璃化冷冻复苏后行ICSI-ET的妊娠结局

目的回顾性分析卵母细胞玻璃化冷冻复苏后行卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)的妊娠结局,为卵母细胞玻璃化冷冻的临床应用提供参考。方法收集2013年5月至2015年1月于我中心行辅助生殖助孕治疗、女方取卵当日无精子可用的6对夫妇为研究对象,收集6例女性的成熟卵母细胞进行玻璃化冷冻,复苏后行ICSI-ET,观察6例患者的卵母细胞复苏率、受精率、卵裂率、临床妊娠率等。结果 6例女性患者的6个取卵周期共获得成熟MⅡ卵母细胞94枚,均行玻璃化冷冻。择期复苏64枚,存活62枚,复苏率为96.8%。行ICSI授精后观察到正常受精卵43枚,卵裂40枚,获得可利用胚胎28枚,优质胚胎19枚,可利用胚胎率和优质胚胎率分别为70.0%和47.5%。鲜胚移植获得临床妊娠3例,孕囊5个;冻融胚胎移植1例,孕囊1个,均足月分娩,新生儿状况及Apgar评分良好。结论玻璃化冷冻卵母细胞技术可以在有适应证的患者中应用,并可获得较好的临床妊娠结局。但仍需更大样本量的临床研究予以验证。     

冻融胚胎移植可作为胚胎移植的优先选择——述评

正任何医疗措施的推广和实施都应该严格地以对患者安全有效及总体受益最大化为前提,在辅助生殖技术中患者方面应该包括母亲和相应的子代。人类胚胎冻融技术已经在辅助生殖技术实施过程中成功应用了30余年,从最初对卵裂球期胚胎的程序化慢速冷冻到近年来对卵裂球和囊胚期胚胎的玻璃化冷冻,胚胎冻融技术明显提高并且更加便捷高效。胚胎冻融技术的应用,为减少每次移植胚胎     

卵母细胞玻璃化冷冻对胚胎发育及妊娠结局的影响

目的探讨玻璃化冷冻对卵母细胞体外受精、胚胎发育以及妊娠结局的影响。方法将193枚玻璃化冷冻卵母细胞解冻复苏,采用卵胞浆内单精子注射法受精,观察胚胎发育形态,经72h体外培养后移植。结果成熟卵母细胞解冻复苏率为75．6％,正常受精率为72．6％,卵裂率为88．7％,优质胚胎率为48．9％。共移植19例,9例妊娠,已分娩2例,临床妊娠率为47．3％。新鲜周期与冻卵解冻周期相比,卵裂率、可移植胚胎率和优质胚胎率均无显著性差异（P〉0．05）。结论玻璃化冷冻方法对成熟卵母细胞的胚胎发育及妊娠结局无显著影响。     

卵裂期胚胎解冻移植结局的影响因素探讨

影响冻融胚胎移植结局的因素很多,包括患者年龄、冷冻胚胎的质量、内膜准备方式和冷冻方法等。传统的程序化冷冻在临床已使用20余年,虽经不断改进,解冻存活率仍在70%左右。玻璃化冷冻不需要程序化冷冻仪,且简便、快速,仅数分钟即可完成,消耗液氮量少,正逐渐广泛应用于辅助生殖实验室。     

胚胎玻璃化冷冻解冻技术对子代胚胎和胎盘中印记基因H19表达及甲基化水平的影响

目的建立玻璃化冷冻解冻移植小鼠模型,探究玻璃化冷冻解冻对子代胚胎及胎盘组织中印记基因H19表达及甲基化水平的影响。方法实验动物选择ICR清洁级小鼠,根据处理不同分为3组,自然妊娠(NC)组,胚胎体外培养(IVC)组和胚胎玻璃化冷冻解冻(VET)组,每组收集7只孕鼠。观测3组孕鼠孕9.5d的胎鼠存活率。取3组孕鼠孕9.5d的胚胎及胎盘标本,采用实时定量PCR技术分析H19基因在胎鼠及胎盘中的表达情况,采用焦磷酸测序技术检测H19基因在胎鼠和胎盘中的甲基化水平。结果 NC组的平均窝仔数(10.43±2.07)显著高于IVC组的(6.43±1.51)和VET组的(6.00±1.16)(P0.05)。IVC组和VET组的存活率分别为40.2%和37.5%,与NC组(100.0%)相比,具有显著性差异(P均0.05)。在胚胎组织中,与NC组相比,IVC组和VET组的H19表达水平显著增加(P0.05);在胎盘组织中,3组间H19基因的表达水平比较无显著性差异(P0.05);在胚胎和胎盘组织中,3组间H19基因甲基化水平比较均无显著性差异(P0.05)。结论胚胎的玻璃化冷冻解冻和胚胎体外培养均可导致小鼠存活率下降,胚胎中H19基因表达水平明显增高。但并未发现胎盘组织中H19基因水平的变化,且无论在胚胎或胎盘组织中,H19基因甲基化水平均未发现变化,后期需要更多的研究加以探索。     

应用冷冻环玻璃化冷冻小鼠囊胚的效果观察

目的比较冷冻环玻璃化冷冻小鼠各阶段囊胚的存活率及继续发育能力。方法应用冷冻环以15%二甲基亚砜(DMSO)+15%乙二醇(EG)为主要组成的玻璃化冷冻液,冷冻小鼠早期囊胚112个、囊胚120个、扩张囊胚105个,以同期未冷冻囊胚(100个)作对照;并于冷冻前人工皱缩小鼠囊胚30个,以同期未皱缩的囊胚(50个)为对照。比较冷冻复苏后胚胎存活率及继续发育能力。结果小鼠早期囊胚、囊胚、扩张囊胚各组的存活率分别为88.4%、69.2%和55.2%,囊胚孵出率分别为82.8%、65.1%和60.3%。早期囊胚组复苏后的存活率和囊胚孵出率均显著高于囊胚组和扩张囊胚组(P<0.05)。冷冻前人工皱缩扩张期囊胚,冷冻复苏后存活率达93.8%,孵出率78.1%,与未皱缩组比较差异有显著性(P<0.05)。结论玻璃化冷冻囊胚的效果与囊胚的发育阶段有关;冷冻前人工皱缩囊腔体积能明显提高扩张囊胚玻璃化冷冻的效率。     

小鼠卵巢组织冷冻保存方法对组织内分泌功能的影响

目的比较不同的冷冻方法对小鼠卵巢组织的保存效果及对组织内分泌功能的影响。方法 25只6周龄ICR雌鼠,取卵巢皮质切块后,根据不同冷冻方法随机分成5组:新鲜对照组、二甲亚砜慢速冷冻组(A组)、丙二醇慢速冷冻组(B组)、冷冻管玻璃化冷冻5min组(C组)及冷冻管玻璃化冷冻8min组(D组)。分别进行卵巢组织冷冻复苏,复苏后体外培养2周以及复苏后同种移植饲养2周实验。比较各组体外培养液中以及复苏移植后小鼠静脉血中雌二醇(E2)水平。结果体外培养过程中,各组培养液中E2水平均随培养时间不断增加(F=14.146,P0.001);同一天的E2水平比较,A、B组显著高于对照组及C、D组(P0.05),C、D组与对照组无统计学差异(P0.05)。移植饲养2周后,DMSO慢速冷冻复苏移植组、PROH慢速冷冻复苏移植组的平均E2水平显著高于两组玻璃化复苏移植组、新鲜组织移植对照组、未处理自然对照组及去势未移植对照组(P0.05),新鲜移植对照组、两组玻璃化复苏移植组及去势未移植对照组的平均E2水平显著低于未处理的自然对照组(P0.05)。结论慢速冷冻及玻璃化冷冻的小鼠卵巢组织复苏后,经过体外培养及同种移植均能保持一定的内分泌功能;慢速冷冻效果可能优于冷冻管玻璃化冷冻。     

不同冷冻方法对小鼠卵母细胞发育潜能及细胞骨架的影响

目的比较不同冷冻方法对不同成熟阶段小鼠卵母细胞复苏、胚胎发育及细胞骨架的影响,寻求最佳的卵母细胞冷冻方法。方法分别以SOPS玻璃化及慢速法冷冻小鼠中期(MII)和生发泡期(GV)卵母细胞。解冻复苏后,分别作体外培养成熟(IVM)、体外受精(IVF)或固定作免疫荧光标记,统计复苏率、成熟率、受精率、囊胚率及纺锤体等细胞骨架指标。结果玻璃化冷冻组MII卵和GV卵母细胞的复苏率及囊胚率均显著高于慢速冷冻组(P<0.05)。慢速冷冻组中MII卵复苏率显著低于GV卵(40.4%vs 57.1%,P<0.01)。但同一种冷冻方法保存的MII卵和GV卵的受精率及囊胚率相比,均无显著性差异(P>0.05)。两组的GV卵成熟率无显著差异。玻璃化冷冻组GV卵的纺锤体、染色体及纺锤体和染色体正常率均高于慢速冷冻组GV卵但无显著差异。结论玻璃化冷冻能有效改善冻融卵母细胞的复苏及胚胎发育;与MII卵比较,冷冻GV卵对细胞骨架损伤较小;两种冷冻方法均不影响GV卵冻融后成熟。     

玻璃化冷冻不同来源卵母细胞的临床研究

目的 探讨玻璃化冷冻对卵巢刺激（ovarian stimulation,OS）和控制性超促排卵（controlled ovarian hyperstimulation,COH）来源的卵母细胞影响.方法 对OS和COH来源的卵母细胞进行玻璃化冷冻,解冻后观察存活率,继续发育潜能及移植后的妊娠率并与COH来源的新鲜卵母细胞进行比较.结果 OS和COH来源的卵母细胞玻璃化冻融后的存活率和继续发育潜能无统计学差异（P＞0.05）,与新鲜卵母细胞差异无统计学意义（P＞0.05）.COH冷冻组和OS冷冻组的妊娠率和种植率分别是25.0%（3/12）、20.8%（5/24）和33.3%（1/3）、12.5%（1/8）.结论 玻璃化冷冻技术可以应用于OS和COH来源的成熟卵母细胞的冷冻保存,对其继续发育潜能和妊娠结局无显著影响.     

卵子玻璃化冷冻在睾丸取精失败周期中的临床应用(附8例报告)

目的:探讨卵子玻璃化冷冻在睾丸取精失败周期中的临床应用价值。方法:回顾分析体外受精周期取卵日因男方无精子症行睾丸取精失败且无供精接受卵子冷冻的8例不孕症妇女。所有卵子经玻璃化冷冻保存2个月后解冻,存活的成熟卵子采用与其丈夫血型一致的精子库冷冻精子行卵细胞胞质内单精子注射(ICSI)受精,记录卵子的存活、受精、卵裂、优质胚胎、临床妊娠及分娩情况。结果:冷冻-解冻60枚卵子中存活47枚,存活率为78.3%(47/60);其中41枚成熟卵子行ICSI受精,正常受精率为80.5%(33/41),卵裂率为81.8%(27/33),优质胚胎率为59.3%(16/27);15枚胚胎移植给8例患者,移植周期率为100%(8/8),平均移植胚胎数为1.9±0.8。B超显示有5个孕囊形成,胚胎种植率为33.3%(5/15);5例患者获得了临床妊娠,临床妊娠率为62.5%(5/8),均为宫内单活胎。4例已顺利分娩3男婴1女婴,体重为(3 787.5±513.7)g,染色体及发育均正常。结论:卵子玻璃化冷冻是睾丸取精失败患者的有效保障,与精子库冷冻供精受精可以获得理想临床结局。     

Cryotop玻璃化冻融人类囊胚79例报告

目的探讨玻璃化冷冻保存技术在人类囊胚冷冻复苏中的应用效果。方法将接受体外受精-胚胎移植患者第5天（D5）或第6天（D6）所获得的剩余囊胚进行Cryotop玻璃化冷冻保存,分析囊胚复苏后的复苏率、妊娠率及种植率等指标。结果玻璃化法冷冻囊胚共224个周期、543个囊胚;玻璃化冷冻复苏79个周期、142个囊胚、存活116个（81．7％）;移植70个周期、116个囊胚,临床妊娠25个周期（35．7％）,其中4例流产（16％）,3例足月分娩3个正常新生儿,18例继续妊娠。结论Cryotop玻璃化冷冻法适于人类囊胚的冷冻保存,获得较理想的复苏率、妊娠率和种植率,流产率没有明显提高,在临床中值得应用和推广。     

不同卵巢组织冷冻方法对保存女性生育力的研究

目的比较程序化冷冻和玻璃化冷冻两种方法保存人卵巢组织,解冻后组织病理分析原始卵泡存活情况。方法卵巢组织取自15例卵巢畸胎瘤患者,卵巢皮质切割成10mm×1mm×1mm的组织条随机分配到玻璃化冷冻组（A组）、程序化冷冻组（B组）、新鲜对照组（C组）,组织病理分析比较三组原始卵泡形态的影响。结果三组共有572个原始卵泡,C组中96．9％的原始卵泡保持形态学正常,A和B组分别为85．6％与83．9％,差别有统计学意义（P〈0．01）;A与B组比较,差别没有统计学意义（P〉0．05）。结论尽管冻融后组织的原始卵泡存活率小于新鲜组织,玻璃化冷冻与程序化冷冻方法都能较好地保存人类卵巢组织,可用于人类卵巢组织的冷冻保存。