氨基酰化酶高产菌株的选育与发酵

本实验以赭曲霉F_(449)为出发菌株,发酵产生氨基酰化酶,其野生型菌株产酶单位为12.2μ/ml发酵液。我们首先以紫外线诱变处理2min,得到其变异株F_9,产酶16μ/ml发酵液,然后对F_9菌株的原生质体进行亚硝基胍诱变处理15min,得F_(28)菌株,产酶24.7μ/ml发酵液,将F_(28)菌株在优化培养基中发酵培养,其产酰化酶单位提高到32.4μ/ml发酵液,与此同时,提取得到粗品酰化酶,其酶活为15,000μ/g。     

豆豉纤溶酶产生菌发酵条件研究

对从豆豉中筛选到的一株纤溶酶产生菌--枯草芽孢杆菌HGD107进行发酵产酶条件研究.在最适发酵条件下,该菌株产豆豉纤溶酶酶活达到尿激酶3643u/ml发酵液.     

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶生产菌的选育

以产N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的恶臭假单胞菌MZ0315为出发菌株，应用紫外和硫酸二乙酯的复合诱变，经底物类似物5-氟尿嘧啶的筛选，获得高产、稳定的优良菌株MF0506。经过发酵培养基优化，诱变株的产酶活力由出发菌株的0．443u／ml提高至0．680u／ml。     

通过获得链霉素抗性基因(str)突变株筛选梅岭霉素高产菌株

本文通过链霉素对梅岭霉素（meilingmycin）产生菌南昌链霉菌NS－41－80菌株孢子致死浓度的测定，采用诱变剂EMS四种不同诱变剂量对菌株的孢子进行诱变处理，诱变处理的孢子涂布在含链霉素致死浓度的高氏平板上，获得了大量的链霉素抗性基因（str）突变株。然后从链霉素抗性基因突变株进一步筛选到梅岭霉素高产菌株80－5．11－221，在摇瓶条件下，只产梅岭霉素不产南昌霉素，梅岭霉素活性效价达1500μg/ml，比出发菌株NS－41－80的摇瓶发酵效价855μg/ml提高了77．9％，该菌株连续传代六代进行摇瓶发酵，其F2代和F3代梅岭霉素发酵效价稳定，F4代至F6代随着传代数增加，其梅岭霉素发酵效价急速下降。通过EMS诱变剂量分别与抗药性突变率和链霉素抗性基因突变株产梅岭霉素产量的产势统计分析表明，菌株抗药性突变与产抗生素突变密切相关，产抗生素突变的EMS诱变剂量高于链霉素抗性基因突变诱变剂量。在0．03mol/L的EMS剂量作用下，菌株致死率为99．43％，而抗药性突变率为0．0440％，建立了梅岭霉素产生菌链霉素抗性基因突变筛选方法，为南昌链霉菌高产菌种选育研究作了有益的尝试，并有助于其它链霉菌属的抗生素产生菌育种研究。     

由DL-5-苯乙内酰脲酶法生产D-苯甘氨酸的菌种选育

本实验以假单孢菌Pseudomonas SP.27为出发菌株由DL-5-苯乙内酰脲发酵生产D-苯甘氨酸。野生菌产量为15.85μg/ml.首先对其进行紫外诱变处理1min,筛选出菌株Q_6,其产量为256.7μg/ml.然后用Q-6制备球形体,进行亚硝基胍诱变处理60min,得到Q_(68)菌株,其产量为453.4μg/ml.     

产青霉素酰化酶的大肠杆菌菌株诱变的研究

应用大肠杆菌的酰化酶裂解青霉素制备半合成青霉素的原料6-氨基青霉烷酸。为了提高大肠杆菌酰化酶活力,我们采用紫外线、硫酸二乙酯和亚硝基胍等因素单一或复合诱变试验,结果如下: 一、单一诱变法 1.紫外光照射。15 W波长2537A紫光灯距30厘米处照射,大肠杆菌诱变前酶活力5.6u/g(NIPAB法测定,下同),照射1、2、3分钟后,最高酶活力为6.05u/g,突变率7.67％。 2.1％硫酸二乙酯(DES)处理;大肠杆菌诱变前酶活力5.9u/g,1％ DES处理40分、60分钟后,最高酶活力为9.56u/g,突变率61.48％。 3.亚硝基胍处理:诱变前酶活力为5.97u/g,经0.25mg/ml和0.5mg/ml亚硝基胍处理15、30、45分钟,最高酶活力可达17.7u/g,突变率196.4％。     

红霉素高产菌株的选育

以红霉素链霉菌0－11－26为出发菌株，经LiCl和紫外线复合诱变处理，再用含有4种不同结构类似物的培养基定向筛选，获得4株突变株，其中M－03－59摇瓶效价6876u/ml，比起始菌株（5328u/ml）提高29.1%，在10t发酵罐上连续6批验证，平均发酵效价7016u/ml，比原生产水平（5652u/ml）提高24.1%，并且质检全部合格，对生产实际具有重要意义。     

链霉菌702抗药性致死突变标志微波诱变筛选研究

目的 筛选出产抗真菌活性物质的高产链霉菌702突变株.方法 分别以链霉菌702菌株为试验材料和以庆大霉素为敏感抗生素建立链霉菌702孢子致死突变标志的微波诱变筛选模型,通过微波对链霉菌702菌株孢子进行不同时间的诱变处理,将诱变处理后的孢予悬液涂布于含致死浓度的庆大霉素的PDA平板培养基上,获得抗庆大霉素突变株,分别挑取单个抗药性突变菌株进行摇瓶初筛和复筛.生物效价测定采用一剂量法.结果 微波处理30s对菌株的致死率可达70.53%,抗药性突变率高达23.13%,获得的抗药性突变株经过摇瓶初筛和复筛,获得高产突变株20-29-47菌株,产抗真菌活件物质的摇瓶发酵单位达到1478μg/ml,比出发菌株发酵单位986μg/ml提高T49.9%.结论 采用抗药性致死突变标志的微波诱变筛选模型可以获得产抗真菌活性物质的链霉菌702高产菌株.     

肌苷产生菌LL—111突变株的选育及发酵罐小试研究

以枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis)LSBS-1247为出发菌株，经NTG和紫外诱变处理，获得一株高产突变菌LL111（ade^-,his^-,thi^-,8-AG1,Gua^-)摇瓶发酵产量为28mg/ml，发酵条件优化后可达29.6mg/ml。5L发酵罐产量最高为24.7g/L。菌株性状稳定。     

氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究

目的筛选氨甲酰妥布霉素高产菌株并稳定其发酵效价。方法以黑暗链霉菌Ts-228为出发菌株，经自然分离，UV诱变结合耐自身代谢产物处理，采用琼脂块法并结合摇瓶发酵来筛选高产菌，获得了Tt-49新菌株。以摇瓶发酵考察生长特性，罐上发酵绘制代谢曲线。结果效价提高了1．8倍，妥布霉素含量高达68．5％。该菌株生长周期仅4d，传代稳定。种龄18h左右，接种量10％。按照代谢曲线图进行调控，发酵罐的产抗水平达5865u／ml。结论自然分离与诱变相结合，是黑暗链霉菌选育的有效途径。出发菌株经UV诱变和耐受驯育，发酵效价显著提高。溶氧是妥布霉素发酵生产中的重要调控因子。     

基因工程菌A56（pPA22）生物合成青霉素酰化酶的发酵工艺研究

青霉素酰化酶基因工程菌E.coli A_(56)(pPA_(22))中试研究,在500升发酵罐考察该菌株生物合成青霉素酰化酶的工艺条件,发酵温度22.5℃,通气比1∶0.4,搅拌转速70转/分。同时还考察了不同浓度苯乙酸和苯乙酸加入时间。试验证明低浓度的溶解氧对酰化酶合成有利。发酵过程pH控制范围:生长期7.2～7.5,酶合成期7.5～8.0,发酵末期8.2～8.5。500升发酵罐最高酶产量达215.9u/100ml。     

原生质体ARTP诱变选育阿维拉霉素高产菌株

目的 筛选获得阿维拉霉素A含量高的菌株,进一步提高绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogene)发酵阿维拉霉素的水平。方法 对绿色产色链霉菌AVL4(S. viridochromogene AVL4)菌株原生质体制备及再生条件进行了优化,并在此基础上,采用ARTP诱变系统对其原生质体进行了诱变研究。结果 S. viridochromogene AVL4原生质体制备和再生的最佳条件为：以活化斜面转接至种子摇瓶培养24h的菌丝体为出发菌丝体,以SMM溶液作为渗透压稳定剂,采用12mg/mL的溶壁酶,30℃酶解反应60min。以原生质体为诱变对象,ARTP处理40s后的菌株经菌落形态初筛和摇瓶发酵复筛,获得一株编号S251的菌株,其摇瓶发酵阿维拉霉素的生物效价较出发菌株提高19.3%,其中,阿维拉霉素A占组分含量81%,较原始出发菌株AVL4含量提高6.4%,而且斜面连续转接五代遗传相对稳定。另外,成功实现变株S251的50L罐发酵验证,其产素水平最高达到4500U/mL,较对照菌株AVL4提高27.4%。结论 ARTP处理AVL4菌株原生质体,能够有效提高绿色产色链霉菌产阿维拉霉素的能力,获得的变株S251具有非常好的生产阿维拉霉素的工业化应用潜力。     

链激酶高产菌株的选育

对原始出发菌株-S1P1 C1.727交替使用亚硝基胍（NTG）及紫外线（UV）进行诱变处理，以过纯化，再用超声波和UV复合处理，纯化得到一株高产菌株-Cou2‘11,使摇瓶单位提高了七倍，五立升玻璃发酵罐单位达到1000u/ml以上。     

产乳糖酶酵母菌株的筛选及高产酶酵母K.fragilis株培养产酶条件的优化

从9株能诱导产乳糖酶的酵母菌株中,筛选出一株既能利用蔗糖糖蜜增殖良好,又能利用乳糖诱导产酶最高的K.frasilis菌株。完成了对该菌株的增殖培养及产酶条件的优化,证实该菌株不仅可利用蔗糖糖蜜为主要原料替代乳糖作增殖碳源,且酶产量高于用乳糖作增殖的。确定了乳糖量为1.5％的诱导培养液及产酶培养的其它条件。将增殖和诱导培养二步法组成一连续发酵工艺,经实验室培养液发酵试验所得单位酶产量达38IU/ml,比“七五”科技攻关合同要求的单位酶产量(3IU/ml)提高了许多,为利用廉价原料生产“医用乳糖酶制剂”奠定了基础。     

高产GL-7ACA酰化酶菌株的获得及其培养条件的研究

从假单胞菌的野生菌株SP-821出发,经化学、物理诱变,获得GL-7ACA酰化酶高产菌株79u-18,酶活性高达700u/L。在菌株选育过程中一个突破性进展是分离获得构成型GL-7ACA酰化酶产生菌株,即该菌在培养中不需加入戊二酸作诱导剂。本文介绍上述菌株的获得及培养条件的研究。     

石刁柏细胞的L-天冬酰胺酶发酵条件的研究

优化了石刁柏细胞L-天冬酰胺酶发酵条件并对其粗提进行了探索。其最佳产酶条件为:最适培养基为MS 蔗糖(35 g/L) 6-(苄胺基)嘌呤(0.01 mg/L) α-奈乙酸(3 mg/L)最适pH值为6.4、最适温度为27℃、最适转速为110 r/min、接种量为5.0×104个/ml。在此发酵条件下,L-天冬酰胺酶发酵液酶活力的峰值可达到22.37 U/ml、产酶稳定期持续7~8 d,利用吴氏提取工艺可以得到回收率为30.8%,纯化倍数为9.85,比活力为0.55 U/mg的L-天冬酰胺酶。     

原生质体诱变选育阿霉素高产菌株及发酵产品质量的初步分析

目的 利用原生质体诱变方法从一株链霉菌原始菌株Streptomyces sp.H-323 (CGMCC 4827)选育阿霉素高产突变菌株,以提高阿霉素的发酵单位,并对发酵产品的质量进行了初步研究.方法 通过研究不同甘氨酸浓度、溶菌酶酶解时间、酶解温度、酶浓度对H-323原生质体形成的影响,确定了原生质体的最佳制备和再生条件.通过阿霉素抗性选育,诱变原生质体筛选阿霉素高产突变菌株.最后通过高效液相、核磁等波谱分析法初步确定发酵法生产的阿霉素产品的质量.结果 制备Streptomyces sp.H-323原生质体的最佳条件:种子培养基中甘氨酸浓度0.5％、溶菌酶浓度3mg/mL、酶解时间60min、酶解温度30℃.通过原生质体诱变结合阿霉素抗性选育,得到一株高产突变株,阿霉素发酵单位由出发菌株的300mg/L提高到700mg/L.通过波谱分析,发酵产物达到国外注册标准.结论 通过原生质体诱变和抗性选育大大提高了阿霉素的产量,为高产阿霉素产业化提供方法支持.     

复合诱变筛选avermectins高产菌株

由Streptomyces avermitilis初始菌株经过自然分离可以得到三种不同类型的菌株，即灰色粉末型、白色和光秃型。其中灰色粉末型产素水平最高，摇瓶发酵效价达到6835．1μg／ml，B1组分达到56．3％。经过紫外线和亚硝基胍对初始菌株的孢子的诱变及对其原生质体的诱变再生。并且经过异亮氨酸和链霉素的定向筛选，得到的高产菌株摇瓶发酵效价达到8542．9μg／ml，B。组分达到64．9％；同时通过对高产菌株进行传代培养检验其传代稳定性，结果表明，传代3代后，菌株开始退化，并且其发酵效价有比较显著的下降。     

假单胞菌发酵制备精氨酸脱亚胺酶

采用假单胞菌（Pseudomonas sp．）发酵制备精氨酸脱亚胺酶，优化发酵培养基配方及培养条件，以葡萄糖为碳源，酵母膏和蛋白胨为氮源，30℃振荡培养20h时，发酵液中精氨酸脱亚胺酶的酶活力可达2．17u／ml。向HepG2肝癌细胞培养液中加入酶粗品0．5u／ml，对肿瘤细胞的生长抑制率为93．4％。     

产生酰化酶菌种的选育

青霉素酰化酶(penicillin acylase)是半合成抗菌素工业上的一种重要酶类,它可用于青霉素或重排酸(7-苯乙酰氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸)的裂解,以生产6-氨基青霉烷酸(6-APA)或7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA);也可用于缩合制取氨苄青霉素、羟氨苄青霉素及其他半合成青霉素或头孢菌素。但目前国内广泛使用的产生酰化酶的菌种,酶产量较低,因此我们开展菌种选育工作。以大肠杆菌B-EC-1及B-EC-2二株为出发菌株,经紫外线(UV)诱变二次累积处理,选育到1.236菌株,使酰化酶产量由原来的24.84单位/