原位聚合酶链反应检测结核分枝杆菌L型的初步研究

目的：建立一种不需提取ＤＮＡ的检测分枝结核杆菌Ｌ型的分子生物学方法。方法：采用原位聚合酶链反应（原位ＰＣＲ）技术,扩增结核杆菌Ｌ型及其感染的人和小鼠血标本中的结核杆菌ＩＳ６１１０基因,再用免疫组化技术显色。结果：结核杆菌Ｌ型菌株中的ＤＮＡ被扩增,血标本中,可见到红细胞和淋巴细胞周围粘附大量结核杆菌ＤＮＡ阳性颗粒。结论;红细胞和淋巴细胞具有免疫粘附功能,原位ＰＣＲ快速、简便,可用于检测稳定和不稳定分     

运用聚合酶链反应技术检测结核分枝杆菌

ＰＣＲ检测结核分枝杆菌是一种高效的实验方法，具有极高的敏感性和特异性；检测出结果所用时间比生物培养法综合了约１００倍，比涂片法更加敏感，甚至可检测到１个结核杆菌。     

荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌的价值

目的分析使用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测结核分支杆菌的应用价值。方法收集首都医科大学附属北京同仁医院临床各科室各类结核病或疑似结核病患者检测标本178例,使用FQ-PCR法进行结核分枝杆菌脱氧核糖核酸检测,标本同时进行抗酸染色显微镜下观察。结果 FQ-PCR法和抗酸染色涂片法对不同来源标本检测结核分枝杆菌的结果存在较好的一致性(Kappa=0.615,P<0.01)。使用FQ-PCR法检测结核分枝杆菌的阳性检出率为12.9%,抗酸染色涂片法的阳性检出率为6.2%,二者比较差别有统计学意义(χ2=4.682,P<0.05)。结论 FQ-PCR法检测标本中的结核分枝杆菌的灵敏度高于传统的抗酸染色涂片法,可作为结核病病原学诊断的优先方法。     

聚合酶链反应扩增38KDa蛋白质基因诊断结核分枝杆菌

应用ＭＴ１和ＭＴ２引物通过聚合酶链反应扩增人型和牛型结核分枝杆菌的３８ＫＤａ蛋白质基因。测定了反应体系的灵敏度（０．１２×１０２ＣＦｕ／ｍｌ）和特异性。对三种不同的ＤＮＡ抽提法作了比较，认为用Ｔｗｅｅｎ２０和ＮＰ４０作为裂解液与ＳＤＳ法比较有显著性差异（Ｐ＜０．０５），且Ｔｗｅｅｎ２０比ＮＰ４０更适合。     

荧光定量聚合酶链反应技术检测痰结核分枝杆菌DNA及其临床应用研究

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)技术在肺结核诊断中的临床价值。方法对144例活动性肺结核的痰及30例健康对照者的痰进行 FQ-PCR 检测,并与痰涂片检查法、改良罗氏培养法结果进行比较。结果 FQ-PCR 检测痰结核分枝杆菌阳性率、痰涂片抗酸检查法阳性率、改良罗氏培养法阳性率分别为61.1%(88/144)、51.4%(74/144)、55.6%(80/144),以 FQ-PCR 检测痰结核分枝杆菌阳性率为最高,FQ-PCR 检测特异性为100%。结论 FQ-PCR 技术检测痰结核分枝杆菌具有较高的敏感性和特异性,该方法快速、准确,对肺结核的诊断有一定价值。     

肺结核患者结核分枝杆菌L型培养的临床意义

目的了解肺结核患者MTB-L型的感染情况,并探讨其培养的临床意义。方法选取2004年1月～2004年12月确诊为肺结核患者的痰标本372例进行MTB-L型培养。结果MTB-L型总培养阳性率为16.7%。菌阳肺结核组MTB-L型培养阳性率为21.8%,菌阴组为9.6%;活动性肺结核组MTB-L型培养阳性率为18.6%,非活动性组为2.5%,两者差异极显著(P<0.01);服药时间>6个月组MTB-L型培养阳性率为33.8%,服药时间<1个月组MTB-L型培养阳性率为10.9%,两者有极显著差异(P<0.01)。初治肺结核组MTB-L型培养阳性率为13.9%,复治组MTB-L型培养阳性率为35.4%,两者差异极显著(P<0.01)。结论肺结核患者MTB-L型感染占一定比例,服药时间>6个月和复治的患者MTB-L型感染率较高,若在痰结核分枝杆菌培养的同时进行MTB-L型培养,不仅可使肺结核患者细菌学的诊断率提高一定比例,而且对肺结核患者的治疗以及判断预后也具有重要意义。     

聚合酶链反应-微孔板杂交技术检测临床标本中结核分枝杆菌

目的评价聚合酶链反应 (PCR) -微孔板杂交技术检测临床标本中结核分枝杆菌的价值。方法 :应用结核病细菌学涂片、培养常规检测方法及PCR -微孔板杂交技术检测 138例结核病患者痰标本 ,4 2例非结核呼吸系统疾病患者痰标本。结果 :用常规细菌学方法检测临床标本中结核杆菌敏感度为 37% (5 1/ 138) ,用PCR-微孔板杂交技术检测敏感度为 5 6 % (77/ 138) ,高于常规检测法 19%。用PCR -微孔板杂交技术检测临床标本特异性为 10 0 %。结论 :PCR -微孔板杂交技术将PCR扩增、核酸杂交的技术及酶免技术相结合 ,简便、快速、敏感度高、特异性强 ,是结核病辅助诊断的有效方法之一。     

结核分枝杆菌稳定L型感染检测方法的研究

目的探讨结核分枝杆菌稳定L型感染标本的病原学的检测方法。方法以非高渗分离培养法诱导并获得结核分枝杆菌稳定L型纯培养物,将其感染豚鼠后进行病原体分离培养,采用PCR方法检测稳定L型培养物的IS986序列并鉴定其性质。结果结核分枝杆菌稳定L型在常规细菌学方法检查中不能发现或鉴定,但采用非高渗分离培养法能够检出,5例动物病变组织有4例检测出稳定L型,PCR直接扩增动物病变组织有3例呈阳性反应。结论采用以非高渗分离培养和基因检测为主要内容的非高渗分离培养法,能够快速的检测出样品中潜伏存在的结核分枝杆菌稳定L型,可提高病原学诊断的阳性率和特异性。     

应用PCR技术快速鉴定结核分枝杆菌复合群菌种

目的 建立快速鉴定结核分枝杆菌复合群菌种的方法.方法 将7对结核分枝杆菌复合群各菌种特异性引物(Mtbc1-7)进行聚合酶链反应(PCR)扩增,通过对扩增产物的不同系带型进行分析,对已知标准株和96株临床分离株进行菌种鉴定.结果 用3株结核分枝杆菌复合群(MTBC)标准株,9株非分枝杆菌标准株以及27株非结核分枝杆菌的分枝杆菌(MOTT)对7对结核分枝杆菌复合群各菌种特异性引物进行特异性鉴定,结果证明引物Mtbc1能鉴定出分枝杆菌和非分枝杆菌;引物Mtbc2能鉴定出MOTT和MTBC;引物Mtbc3能鉴定出田鼠分枝杆菌;引物Mtbc4能从MTBC中识别出牛分枝杆菌和卡介苗;引物Mtbc5能鉴定出非洲分枝杆菌Ⅱ型和结核分枝杆菌;引物Mtbc6和引物Mtbc4结合能鉴定出卡介苗;引物Mtbc7和引物Mtbc5联合能鉴定出canettii分枝杆菌.96株临床分离株经7对引物扩增,扩增结果显示MOTT 20株,牛分枝杆菌1株,卡介苗1株,canettii分枝杆菌3株,田鼠分枝杆菌3株,非洲分枝杆菌Ⅰ型3株,caprae分枝杆菌1株,结核分枝杆菌或非洲分枝杆菌Ⅱ型64株.结论 应用PCR技术鉴定结核分枝杆菌复合群菌种结果准确可靠,且具有简便和快速等优点,有较大的分子流行病学应用价值.     

结核分支杆菌荧光PCR试剂盒的研制及临床试验

目的用荧光PCR(fluorescence PCR,F-PCR)方法研制结核分支杆菌(TB)DNA检测试剂盒,通过临床试验评价其性能,并与其他方法进行比较。方法F-PCR是PCR和荧光探针杂交技术结合所产生的PCR方法。由于采用完全闭管荧光检测,避免了PCR后处理导致的假阳性污染;又采用了荧光检测技术,可以提高检测的灵敏性。应用F-PCR检测了297份肺结核病人和249份非结核对照者的痰液标本,以改良罗氏培养法、金胺荧光染液涂片法、Abbott公司的LCx试剂盒检测作为对照。结果设计合成了TB F-PCR诊断试剂盒。检测阳性率49.1%,灵敏性89.2%,特异性98.8%,符合率93.6%。结论F-PCR在灵敏性上显著优于培养法和涂片法,与LCx试剂盒检测无显著差异。F-PCR试剂盒可以检测TB的真实感染情况,对于临床诊断和疗效考察有一定的指导意义。     

结核分枝杆菌自身淬灭探针荧光定量PCR检测方法的建立

目的利用自身淬灭探针技术建立敏感、特异、快速、价廉且能广泛应用的结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法。方法构建重组质粒PET-32a（＋）-16srRNA作为标准品,自行设计自身淬灭探针,建立、优化定量PCR体系。并进行方法学评价及临床应用。结果所建立方法的线性检测范围为102～109copies／μL,灵敏度为lcopy／μL,特异性为100％。高拷贝样品的天问CV为2．65％、批内CV为1．86％,低拷贝样品的天间CV为2．12％、批内CV为0．78％。该方法比培养方法更快速、灵敏。结论以自身淬灭探针技术为平台的结核分枝杆菌荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,对结核病的早期快速诊断有较高价值。     

实时荧光定量PCR在结节病与不典型结核鉴别诊断中的临床应用

目的验证和评价实时荧光定量PCR（polymerase chain reaction）的方法检测结核分枝杆菌DNA在结节病与不典型结核病鉴别诊断中的实际应用价值。方法以2008年6月至2009年6月期间,经病理活检证实为肉芽肿性疾病,但无法确定为结节病或结核病的49例患者为研究对象。运用我科前期建立的实时荧光定量PCR的方法检测上述患者石蜡包埋病理组织标本中的结核分枝杆菌DNA（Tuberculosis polymerase chain reaction,TBPCR）,以1.14×10~3拷贝/ml作为鉴别结节病与不典型结核病的最佳cutoff值,结合临床、影像、病理和其他检查结果帮助临床鉴别诊断并指导用药。随访所有患者至2009年8月1日,通过临床表现、影像学、治疗效果等变化来验证和评价本方法的实际应用价值。结果 49例患者定量TB-PCR结果中,10例患者结核分枝杆菌DNA为阳性（2.01×10~3～7.98×10~4拷贝/ml）（阳性率20.41%）,39例为阴性。结合患者临床资料及TB-PCR结果确定诊断,33例为结节病,2例结核病,诊断明确率达到72%（35/49）。诊断明确患者治疗后随访（2～14个月）,33例结节病和2例结核病患者经相应治疗均达到稳定或不同程度好转,无1例出现病情恶化。结论实时定量PCR法检测石蜡包埋组织中结核菌DNA能灵敏而高效地检出不典型结核病肉芽肿中的结核杆菌DNA,可作为鉴别结节病和不典型结核病的有效方法之一。     

结核杆菌感染外周血单个核细胞对细胞免疫功能的影响

目的 :探讨结核杆菌感染外周血单个核细胞 (PBMC)对细胞免疫功能的影响及在结核病转归中的作用。方法 :用PCR检测结核病患者PBMC中结核杆菌DNA(TB DNA) ,用生物素 链霉亲和素 (BSA)系统同步检测其T细胞亚群及经植物血凝素 (PHA)诱导前后膜白介素 2受体 (mIL 2R)水平。结果 :结核病患者T细胞亚群及mIL 2R水平与对照组相比均显著降低(P <0 .0 5～P <0 .0 1)。其中PBMC内TB DNA(+)组与TB DNA(- )组相比 ,CD3+ 、CD4+ 百分率及CD4+ /CD8+ 比值降低 ,CD8+ 百分率增高 (P <0 .0 5 ) ;PHA诱导前后mIL 2R水平较对照组相比均低下 ,差异均有显著性 (P <0 .0 1)。结论 :结核病患者体内细胞免疫功能低下 ,结核杆菌感染PBMC后可加重患者细胞免疫功能紊乱 ,抑制其mIL 2R表达。     

结核分支杆菌rpoB基因套式PCR在利福平耐药和结核病辅助诊断中的应用

目的 分析耐利福平的结核分支杆菌(Mtb)rpoB基因突变状况。方法 对38株耐利福平Mtb菌株的rpoB基因突变高频区域进行套式PCR扩增，并进一步全自动测序。结果 38株耐利福平Mtb中有36株存在突变(包含5个密码子11种形式的突变)，突变率94．7％。结论 Mtb xpoB基因的突变与利福平耐药高度关联，rpoB基因套式PCR及测序能快速、正确鉴别耐利福平菌株。     

荧光定量PCR在结核分枝杆菌快速诊断中的研究

目的 在痰液标本中,探讨荧光定量PCR技术快速检测结核分枝杆菌应用的诊断价值。方法 选取210例初诊的疑似结核病患者的痰液标本,分别进行痰涂片、MGIT960液体培养以及荧光定量PCR的检测,其中103例标本还进行了Xpert MTB/RIF检测,通过比较来分析荧光定量PCR在检测结核分枝杆菌方面的敏感度和特异性。结果 荧光定量PCR方法从痰液中检出结核分枝杆菌的阳性率高达28%,显著高于痰涂片15.2%的检出率,并且与结核培养的30.9%检出率相接近。以MGIT960液体培养为金标准,荧光定量PCR方法检测痰液标本中的结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为67.7%、 89.7%,阳性预测值和阴性预测值分别为74.6%和86.1%,两者之间差异没有统计学意义。将荧光定量PCR方法与Xpert MTB/RIF诊断方法相比较,分析发现荧光定量PCR方法的敏感度和特异度分别为85.9%、94.9%,阳性预测值和阴性预测值分别为96.5%和80.4%,两者之间差异没有统计学意义。结论 荧光定量PCR方法在检测结核分枝杆菌时具有较好的敏感度和特异度,效果优于传统的痰涂片方法,并且与Xpert MTB/RIF方法具有较好的一致性。荧光定量PCR检测成本较低,且结果准确,在快速检测结核菌方面具有比较好的应用前景。     

支气管肺泡灌洗液中结核分枝杆菌检测的方法比较

目的：用刷片、集菌、培养、聚合酶链反应等四种方法检测支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）中结核分枝杆菌，对其结果进行比较。方法：采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）法对４６例肺结核患者及３２例非结核病患者的标本进行检测，并与刷片、集菌、培养法比较。结果：ＰＣＲ的敏感性显著高于刷片、集菌、培养法。结论：支气管肺泡灌洗液ＰＣＲ结果阳性，可作为早期诊断结核病的重要指标。     

耐药肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌L型四种检测方法比较

目的:比较耐多药肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌L型的四种实验室检查方法及其临床意义.方法:对103例耐多药肺结核患者的痰标本分别采用萋-尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法、改良罗氏培养法、聚合酶链反应(PCR)和结核分枝杆菌L型培养法进行检测.结果:结核分枝杆菌L型培养阳性率高于抗酸染色涂片、改良罗氏培养和PCR检测(P＜0.05～P＜0.005).结论:结核分枝杆菌L型培养可提高结核分枝杆菌的阳性检出率,对结核病的早期、快速诊断具有重要价值;耐多药肺结核患者有较高的结核分枝杆菌L型感染率,这也是结核病程缓慢变化、复发、难治的重要原因.