靶向增强型TK表达载体在鼻咽癌细胞中的作用研究

目的探讨hTERT启动子及CMV增强子双调控机制的增强型表达载体pGL3-bas-ic-EGFP-TK-hTERTp-CMV enhancer在鼻咽癌细胞中的靶向杀伤效应。方法构建靶向性增强型hTERT启动子及CMV增强子双调控TK表达载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp-CMV enhancer,并以单启动子载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp作为对照组,分别转染端粒酶阳性的人鼻咽癌细胞株5-8F、人乳腺癌细胞MCF-7（阳性对照）及正常人血管内皮细胞ECV（阴性对照）。荧光显微镜下观察其TK基因绿色荧光蛋白表达,实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中TK基因mRNA定量表达差异,Stretch PCR法检测肿瘤细胞端粒酶活性,MTT法分析杀灭鼻咽癌细胞的效果等作为检验指标。结果①该增强型表达载体转染5-8F细胞及MCF-7细胞后的绿色荧光表达及TK基因的mRNA表达均强于单启动子pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp组;而ECV细胞只有极微弱的绿色荧光和极弱的TK基因的mRNA表达。实时荧光定量PCR显示,增强型载体组A值较对照组单启动子组明显增高,是单启动子组的2～5倍。StretchPCR法检测转染前后5-8F细胞端粒酶活性明显被抑制。②加入GCV后增强载体组对鼻咽癌5-8F细胞及乳腺癌MCF-7细胞体外增殖均有明显抑制作用,均高于单启动子载体组、不加GCV的增强型载体组、空载体组及空白对照组。结论以hTERT启动子及CMV增强子双调控机制介导TK基因的新型靶向增强型表达载体能够高效靶向性杀灭鼻咽癌细胞,这种新型高效靶向增强型载体有可能成为一种针对包括鼻咽癌在内的具有较为广泛抗癌谱的恶性肿瘤临床靶向基因治疗的新策略。     

增强型胸苷激酶基因表达载体的构建及其杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨改良构建人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit promoter,hTERT)启动子及巨细胞病毒原核(cytomegalovirus,CMV)增强子联合调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(thymidine kinase,TK)的增强型表达载体在鼻咽癌细胞体内外实验中的靶向杀伤效应及体内应用的安全性评价.方法 以pGL3-basic空载体为模板,分别酶切连接hTERT启动子、CMV增强子及TK基因构建靶向性增强型表达载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMV(以hTERT单启动子调控TK基因表达载体作为对照组),转染端粒酶阳性的人鼻咽癌5-8F细胞及用做对照组的人乳腺癌MCF-7细胞和端粒酶阴性的正常人脐静脉内皮细胞ECV-304,分别采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达差异、实时荧光定量PCR检测转染后TK基因mRNA表达差异、TeloChaser法检测上述细胞中的端粒酶活性、四甲基偶氮唑蓝(MTt)联合Boyden小室实验分析增强型载体对鼻咽癌细胞增殖及侵袭抑制的作用.将鼻咽癌细胞接种于裸鼠腋部皮下,构建裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,研究增强型载体对裸鼠移植瘤的体内生长抑制作用及对全身的毒副反应情况.结果 ①成功改良构建hTERT/CMV双调控TK基因的增强型表达载体.②转染增强型载体组及单启动子载体组的鼻咽癌5-8F细胞均有绿色荧光表达,但前者荧光数量及强度均较后者强,对照组端粒酶阳性的乳腺癌细胞也有很强的荧光表达,而ECV-304细胞几乎无绿色荧光表达.实时荧光定量PCR结果显示,增强型载体组的TK基因mRNA表达量是单启动子组的2-5倍.③ TeloChaser法结果显示,两种肿瘤细胞(5-8F细胞、MCF-7细胞)端粒酶活性均为阳性,正常对照ECV-304细胞端粒酶活性为阴性.④MTT联合Boyden小室侵袭实验结果显示,增强型表达载体对5-8F细胞体外增殖及侵袭力均有明显抑制作用.相对细胞存活率为37.0%,较对照组明显低(P<0.01).⑤体内实验结果显示,增强型靶向表达载体对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长具有明显抑制作用,抑瘤率达56.3%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),而裸鼠肝肾病理检查未发现明显损害.结论 以hTERT/CMV双调控机制介导TK基因的增强型表达载体能够高效、靶向杀伤鼻咽癌细胞及移植瘤,实验动物体内应用无明显毒副作用.     

短发夹RNA抑制hTERT基因对鼻咽癌细胞端粒酶活性及PCNA和Caspase-3蛋白表达的影响

目的:研究靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹RNA(shRNA)对鼻咽癌细胞系(CNE)端粒酶活性及PCNA、Caspase-3蛋白表达的影响.方法:构建表达靶向hTERT mRNA特异的shRNA的质粒pEGFP-shTERT.将pEGFP-shTERT转染CNE细胞,TRAP PCR-ELISA法检测端粒酶活性,MTT法测定细胞增殖活性,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blotting检测蛋白表达.结果:pEGFP-shTERT成功转染入CNE细胞后, 端粒酶活性显著下降;细胞增殖活性明显受抑制;大量细胞凋亡;处理后24及48 h,PCNA蛋白下调至64.41%、58.67%(P<0.05),Caspase-3上调到1.55、1.60倍(P<0.05).结论:shRNA靶向抑制hTERT基因在鼻咽癌CNE细胞系中的表达,能显著地抑制细胞的端粒酶活性,调节PCNA和Caspase-3蛋白表达,从而抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡.端粒酶、PCNA和Caspase-3共同参与了鼻咽癌的发生、发展过程.     

人类鼻咽癌端粒酶活性的研究及其临床意义

目的　探讨端粒酶在鼻咽癌中的表达及其临床意义。方法　采用TRAP 银染法对 42例鼻咽部低分化鳞状细胞癌、10例鼻咽部正常粘膜和 8例鼻咽纤维血管瘤进行端粒酶活性检测及血清VCA/IgA检测 ,并分析其与临床病理的关系。结果　鼻咽部正常粘膜和鼻咽癌端粒酶阳性率分别为 2 0 %和 88.1% ,8例鼻咽纤维血管瘤均未检测到端粒酶活性。鼻咽癌伴颈部淋巴结转移者端粒酶阳性率高于无颈部淋巴结转移者 (P =0 .0 35 ) ,临床晚期 (III、IV)端粒酶阳性率高于临床早期 (I、II) (P=0 .0 48) ,而端粒酶与鼻咽癌患者的年龄、性别及远处转移均无明显相关性 (P >0 .0 5 )。鼻咽癌患者血清EB病毒VCA/IgA阳性率明显高于鼻咽粘膜正常者 (P <0 .0 0 1)。结论　端粒酶活性表达在鼻咽癌发病机制中起着重要作用。端粒酶活性结合血清EB病毒抗体的检测有利于鼻咽癌的早期诊断。     

靶向性重组TRAIL基因诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡的效应

目的研究TRAIL基因结合端粒酶启动子特异性靶向治疗的作用。 方法刺激人外周血淋巴细胞增殖,提取总DNA。采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL功能区的融合基因,克隆入pGL3-181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL。将该重组载体经阳离子脂质体转染入人黑色素瘤细胞株A375中,以台盼蓝拒染法和电镜下细胞形态变化,观察转染的A375细胞的凋亡。结果构建了肿瘤人可溶性TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL,其表达产物能诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡。结论成功地构建了重组真核表达载体pGL3-181hTERT /TRAIL,为肿瘤的基因靶向治疗提供了可能性。     

端粒酶抑制因子PinX1基因在鼻咽癌细胞中的表达及作用效应分析

目的 探讨PinX 1基因在鼻咽癌细胞中的表达及其作用效应分析.方法 构建包含全长人PinX 1基因序列的质粒载体pEGFP-C 3-PinX 1及Pinx 1的小干扰RNA,PinX1-FAMsiRNA.脂质体法转染人鼻咽癌5～8F细胞,采用RT-PCR检测PinX 1基因和端粒酶催化亚单位( hTERT) mRNA...     

肿瘤靶向性人可溶性TRAIL载体的构建及其在鼻咽癌细胞株CNE-2的表达

目的克隆人可溶性TRAIL(sTRAIL)基因并构建肿瘤细胞特异性真核表达载体,为鼻咽癌基因治疗的靶向性奠定实验基础。方法提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,克隆入真核表达载体pGL3-181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建可分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL。用Western blot鉴定鼻咽癌细胞株CNE-2中表达产物。结果RT-PCR扩增得到了613 bp的cDNA片断。经酶切及测序鉴定,与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致,成功构建了肿瘤特异性高效分泌表达可溶性人TRAIL的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL。Western blot结果显示,获得的瞬时转染TRAIL在鼻咽癌CNE-2肿瘤细胞中能有效表达。结论重组真核表达载体pGL3/TRAIL的成功构建,为鼻咽癌基因治疗的靶向性提供了可能性。     

Tiam1基因表达与鼻咽癌浸润转移的关系

目的:探讨Tiam1基因表达与鼻咽癌浸润转移的关系。方法:应用RT-PCR技术,对41例鼻咽癌组织和20例正常鼻咽部组织进行Tiam1mRNA表达水平的检测。结果:41例鼻咽癌组织的Tiam1mRNA平均表达水平(1.83±0.73)明显高于正常鼻咽部组织(0.87±0.45)(P<0.01);鼻咽癌组织中Tiam1mRNA高表达率与临床分期、T分级呈正相关;有淋巴结转移者Tiam1mRNA高表达率为59.3%(16/27),无淋巴结转移者为21.4%(3/14),二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Tiam1基因在鼻咽癌组织中的表达明显高于正常鼻咽部组织,其过表达与鼻咽癌浸润转移呈正相关。     

建立稳定表达融合自杀基因CD／UPRT．UL49的CNE-2鼻咽癌细胞株

目的：建立稳定表达融合自杀基因CD／UPRT．UL49的CNE-2鼻咽癌细胞株。方法：构建表达载体pcDNA3．1（一）E6．BARFlP．cD／UPRT．UL49,经脂质体法转染CNE-2细胞,G418和前体药物5-氟胞嘧啶筛选出阳性克隆细胞并扩大培养。抽提阳性克隆细胞总蛋白质,Western-blotting检测目的基因表达。结果：融合自杀基因CD／UPRT．UL49在CNE2转染细胞内稳定表达。结论：本组通过脂质体转染技术,成功地建立了稳定表达融合CD／UPRT．UL49基因的CNE-2细胞株。     

hTR反义寡核苷酸诱导鼻咽癌细胞凋亡的研究

目的：探讨人端粒酶反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞凋亡的作用。方法：脂质体介导反义寡核苷酸转染鼻咽癌ＨＮＥ１细胞株,采用吖啶橙荧光染色计数,透射电镜观察ＨＮＥ１细胞凋亡改变。结果：反义寡核苷酸转染ＨＮＥ１细胞４８小时后,ＨＮＥ１细胞形态出现改变,细胞娄减少。吖啶橙荧光染色计数及透射电镜分别发现,反义寡核苷酸组较对照组有更多的调亡细胞及更高的调亡指数。结论：针对端粒酶ＲＮＡ的反义寡核苷酸能有效地通过抑制端粒