小鼠肺炎链球菌psaA核酸疫苗的制备及其初免-蛋白加强免疫策略的研究

白加强免疫1次,对照组5只小鼠经pVAX1空载体免疫3次后,生理盐水加强免疫1次,分别采集血清测定两组抗PsaA抗体水平.结果 成功克隆出psaA基因并实现其亚克隆;所构建的psaA核酸疫苗序列正确,同时实现了PsaA蛋白的一步亲和纯化;psaA核酸疫苗可在293T真核细胞中成功表达;核酸疫苗初免后蛋白加强组的抗PsaA抗体滴度高于对照组(t=87.518,P＜0.05).结论 成功构建出psaA核酸疫苗,采用核酸疫苗初免-蛋白加强免疫策略能增强肺炎链球菌psaA核酸疫苗的免疫原性.     

CTB增强PsaA疫苗对肺炎链球菌急性中耳炎的保护作用

目的研究以霍乱毒素B(CTB)作为PsaA蛋白疫苗黏膜佐剂经鼻腔黏膜途径免疫在BALB/c小鼠体内诱导的特异性免疫应答能力以及对肺炎链球菌急性中耳炎的保护作用。方法 6~8周龄的BALB/c小鼠随机分为3组,分别接受PsaA蛋白免疫(PsaA组,15μg PsaA蛋白),PsaA蛋白及CTB免疫(PsaA/CTB组,15μg PsaA/4μg CTB),CTB免疫(CTB组,4μg CTB),经鼻腔途径免疫,相同剂量和方法每周免疫两次,连续三周,末次免疫后两周收集鼻腔灌洗液、中耳灌洗液及支气管肺泡灌洗液检测特异性IgA抗体反应;收集血清,检测特异性IgG、IgG1及IgG2a抗体反应;末次免疫后2周,小鼠经鼓膜注射14型肺炎链球菌,攻毒后5天组织病理学评估中耳炎症程度。结果PsaA/CTB组鼻腔黏膜免疫获得了较高水平的全面免疫应答:鼻腔、中耳和支气管肺泡灌洗液中特异性IgA抗体水平明显高于PsaA组和CTB组(P<0.05);血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体水平明显高于PsaA组和CTB组(P<0.05);攻毒后5天PsaA/CTB组中耳炎症细胞数少于PsaA和CTB组(P<0.05)。结论 CTB是肺炎链球菌蛋白疫苗PsaA有效的黏膜免疫佐剂,黏膜免疫也是PsaA有效的免疫途径,该免疫策略研究为新一代肺炎链球菌疫苗的设计提供了实验基础。     

Th17细胞在小鼠变应性鼻炎模型中的表达及调控作用

目的:通过探讨变应性鼻炎小鼠与正常小鼠、抗IL-17抗体治疗后的变应性鼻炎小鼠的行为学、组织病理学,Th1、Th2、Th17细胞因子的数量以及Th17细胞特异性转录因子的表达水平,评价Th17细胞在变应性鼻炎发病机制中的作用.方法:以卵清蛋白致敏模型组和治疗组小鼠建立BALB/c小鼠变应性鼻炎模型,造模成功后治疗组予IL-17抗体治疗.对照组以生理盐水对照.采集外周血ELISA法测IL-17、IL-4和IFN-γ.并取黏膜行苏木精-伊红染色及RT-PCR法测孤儿核受体(RORγt)mRNA的表达水平.结果:卵清蛋白造模成功,治疗后症状及炎症病理缓解.模型组IL-17、IL-4及RORγt mRNA表达水平均较对照组明显增高,IFN-γ降低;治疗后前三者降低而后者升高(P<0.05).结论:Th17细胞与Th2细胞在变应性鼻炎中大量表达,说明两者可能与其发病机制有关,本实验从IL-17抗体局部治疗有效方面提出治疗依据,通过调控Th17细胞可能成为有效阻止变应性鼻炎的治疗方法.     

肺炎球菌溶血素基因的克隆

目的应用基因工程技术克隆肺炎球菌溶血素（pneumolysin,Pn）基因,为研制中耳炎蛋白多糖结合疫苗奠定基础.方法根据Walker等肺炎球菌溶血素基因序列（GenBank accession no.X52474）,设计一对各带有一个限制性酶切位点的引物,运用PCR从肺炎球菌的染色体DNA扩增出肺炎球菌溶血素基因.对该PCR产物进行酶切、回收,并将其克隆入表达载体pET-28a,然后转化至大肠杆菌JM109（DE3）宿主细胞中.结果通过常规基因克隆方法和PCR技术,成功构建重组体,酶切鉴定和基因测序证实构建正确.结论利用基因工程技术成功克隆了肺炎球菌溶血素基因.     

与内耳免疫反应有关的耳蜗病理生理

近年临床研究表明内耳功能障碍与多种免疫性疾病存在着明显的关系,但其病理生理机制不明,因此有必要建立适当的动物模型进行深入的研究。作者用健康、或龄豚鼠分为对照组(12只)、初次免疫反应纽(初免组11只)和再次免疫反应组(再免组9只),接种KLH(钥孔槭血蓝素)前抽血测抗KLH抗体和测CM(耳蜗微音电位)和AP(Ⅷ脑神经N_1复合动作电位)。于右侧耳蜗基部钻一直径250μm的小孔进入鼓阶,抽外淋巴15～20μl作抗KLH测定,换管缓注     

小RNA干扰细胞周期蛋白Y基因表达对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的 利用RNA干扰技术下调细胞周期蛋白Y(Cyclin Y,CCNY)基因的表达,观察其对喉癌Hep-2细胞增殖的影响.方法 构建针对CCNY基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,包装慢病毒感染喉癌Hep-2细胞.将细胞分为2组,对照组和实验组(感染CCNY shRNA慢病毒组).运用Real-time PCR检测CCNY在RNA水平的变化;四甲基偶氮唑蓝法和平板克隆形成实验检测CCNY表达下调对细胞增殖的影响.结果 成功包装表达CCNYshRNA的慢病毒并感染Hep-2细胞,shRNA下调CCNY的表达后,与对照组相比CCNY在mRNA水平的表达显著下降,抑制率为75.3％ (P ＜0.05).表达CCNY shRNA的慢病毒感染5d后,继续培养6d,细胞的生长明显受到抑制(P ＜0.001).细胞在体外培养10 d后形成克隆的潜力降低了60％.结论 靶向CCNY基因RNA干扰能够阻抑喉癌Hep-2细胞的CCNY表达,抑制细胞增殖,CCNY基因有望成为喉癌基因治疗靶点.     

大鼠Atohl真核表达载体pAtoh1-IRES2-EGFP的构建及转染293T细胞的研究

目的:利用基因工程方法克隆SD大鼠Atohl基因编码区序列,构建Atohl的真核表达载体pA-tohl-IRES2-EGFP,并验证其在293T细胞中的表达.方法:通过RT-PCR从SD大鼠结肠组织内扩增出Atohl基因全长CDS序列,并TA克隆于PMD-19T载体中.纯化回收的目的片段测序后连接于真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,构建pAtohl-IRES2-EGFP真核表达载体.再次测序后脂质体介导重组质粒转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.结果:测序后将扩增得到的大鼠Atohl CDS序列与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基应为单核苷酸多态性,突变为无义突变,不影响蛋白表达.双酶切和测序结果证明Atohl已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,重组质粒转染293T细胞24 h后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达.结论:获得正确Atohl编码序列,真核表达载体pAtohl-IRES2-EGFP构建成功并可以在293T细胞中表达,为进一步对感音神经性聋的基因治疗奠定了基础.     

卡介菌多糖核酸注射液对血管运动性鼻炎的疗效观察

目的:观察卡介菌多糖核酸注射液对血管运动性鼻炎的临床治疗效果和安全性.方法:60例临床拟诊为血管运动性鼻炎患者按随机单盲对照试验方法分为卡介菌多糖核酸组和对照组(2组各30例),卡介菌多糖核酸组给予卡介菌多糖核酸注射治疗,每次1.0 mg,每周2次,共2个月,必要时予氮卓斯汀鼻喷剂对症治疗.对照组单独给予氮卓斯汀鼻喷剂.每日2次,症状缓解后酌减.均随访至停药后6个月.观察并记录治疗后症状得分、药物评分及不良反应.结果:卡介菌多糖核酸注射治疗2个月刚结束时,卡介菌多糖核酸组症状得分及药物评分均明显低于对照组(P＜0.01).至6个月后末次随访时,卡介菌多糖核酸组较对照组症状得分稍低但差异无统计学意义(P＞0.05),药物评分明显低于对照组(P＜0.01).卡介菌多糖核酸注射时不良反应仅1例诉有局部疼痛.结论:卡介菌多糖核酸是血管运动性鼻炎的一种安全有效的治疗方法.     

低氧对Hep-2细胞肿瘤干细胞特性和化疗抵抗的影响及其作用机制

目的 探讨低氧对Hep-2细胞肿瘤干细胞特性和化疗抵抗的影响,并分析其相关机制.方法 构建针对低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)的短发夹RNA重组质粒,转染Hep-2细胞,经筛选建立HIF-1 α基因敲除的Hep-2细胞并检测HIF-1α表达的变化;观察低氧条件培养的Hep-2细胞增殖、克隆形成、细胞周期、凋亡及CD133表型等细胞生理学特性变化;流式细胞仪分选CD133+细胞,观察CD133+细胞克隆形成及顺铂杀伤情况,并检测相关基因Oct-4、p53及survivin表达变化.用方差分析及两样本均数比较的t检验进行统计分析.结果 成功建立HIF-1α基因敲除Hep-2细胞,HIF-1 α在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调;低氧培养Hep-2细胞具有较高的增殖活性及克隆形成能力,凋亡率降低,细胞周期GO/G1期阻滞、CD133表达升高,而HIF-1α基因敲除后上述变化减弱;成功分选出Hep-2细胞中的CD133+细胞,CD133+细胞克隆形成能力高、顺铂杀伤抗性强,而HIF-1α基因敲除后上述能力降低,并出现Oct-4表达下调,p53表达上调,survivin表达下调.结论 低氧能够诱导和强化Hep-2细胞的肿瘤干细胞特性,增强CD133+细胞的增殖分化和化疗抵抗能力,其作用机制可能与HIF-1α及其诱导的相关基因表达变化相关.     

基因工程技术制备中耳炎肺炎球菌疫苗新型蛋白载体

目的应用基因工程技术制备中耳炎肺炎球菌疫苗新型载体——肺炎球菌溶血素（pneumolysin，Pn）。方法根据报道的Pn基因序列，设计一对各带有一个限制性内切酶位点的引物，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术从肺炎球菌基因组DNA中扩增出Pn基因，对该基因片段进行酶切、回收后克隆入表达载体pET-28a，并转化至大肠杆菌JM109（DE3）宿主细胞中。在培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导Pn基因的表达，用超声波破菌后，经固化镍树脂亲和吸附和纯化在羧基端带有6个组氨酸的重组Pn蛋白。结果通过常规克隆方法和PCR技术，成功构建Pn基因，DNA测序证实基因构建正确，表达产物相对分子质量约52000，表达量约占总菌体蛋白的8％。结论利用基因工程技术可以克隆Pn基因，并获得该基因在宿主菌中的表达。采用固化镍树脂亲和纯化技术制备出重组Pn蛋白，为进一步研制肺炎球菌多糖和其自身蛋白结合的新型中耳炎疫苗提供参考。     

泪囊在鼻内镜泪囊鼻腔造口术中的解剖学研究及临床应用

目的 探讨经鼻内镜泪囊鼻腔造口术中泪囊在鼻腔外侧壁的解剖学定位.方法 对12具(24侧)成人尸头的泪囊在鼻腔外侧壁上的投影位置进行解剖学测量,为62例(85侧)慢性泪囊炎鼻泪管阻塞患者行经鼻内镜鼻腔泪囊造口术.结果 解剖学测量结果提示,15侧(62.5%)泪囊上界位于中鼻甲腋上方,9侧(37.5%)泪囊上界位于中鼻甲腋下方.临床结果:62例(85侧)术后随访6个月以上,治愈50例(70侧,82.3% ),好转8例(9侧,10.6%),无效4例(6侧,7.1%),总有效率为92.9%.结论 以中鼻甲腋前上0.7 cm为上界,腋前下0.3 cm为下界,钩突前缘向上延线为泪囊后界定位泪囊进行鼻腔泪囊造口为较佳选择.     

肠球菌属益生菌提取物LFK对变应性鼻炎小鼠血清IL-12的影响

目的 变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)小鼠模型经口途径给予经热处理及酶裂解的肠球菌faecalis FK-23菌株(lysed Enterococcus faecalis FK-23,LFK),观察对血清IL-12水平的影响,探讨LFK对实验性AR的抗变态反应作用。方法 BALB/c小鼠75只,随机分为阳性对照组、LFK干预组和阴性对照组。采用OVA腹腔注射及鼻腔激发建立小鼠AR模型,阴性对照组小鼠采用生理盐水代替OVA进行腹腔注射及滴鼻。用益生菌提取物LFK 0.5mL(60mg)对AR小鼠模型进行灌胃,共计21d;阳性和阴性对照组以生理盐水 0.5mL代替LFK灌胃处理。第22天取材,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清IL-12水平。结果 血清IL-12水平阳性对照组较阴性对照组显著降低(P＜0.001),LFK干预组较阳性对照组显著升高(P＜0.001),但与阴性对照组相比仍明显降低(P＜0.001)。结论 肠球菌属益生菌提取物LFK对细胞因子IL-12具有一定的调节作用,推测其与抗变态反应作用有关。     

口腔矫治器治疗对OSAHS患者焦虑抑郁及心理状态影响的研究

目的 探讨口腔矫治器治疗对阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者焦虑抑郁情绪及心理状态的影响。方法 对48名轻、中度OSAHS患者采用下颌前移矫治器进行治疗,在治疗前及治疗6个月后采用多导睡眠图(PSG) 监测、白天过度嗜睡(EDS)、症状自评量表(SCL-90)、焦虑自评量表(SAS)、抑郁自评量表(SDS)对治疗的疗效及患者的心理状况进行评分并进行统计学分析。结果 OSAHS患者的主客观症状均有显著改善;患者治疗前SCL-90各因子评分均高于中国正常成人常模,在戴用口腔矫治器治疗6个月后,SCL-90各因子及焦虑、抑郁评分显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 OSAHS患者心理健康水平较低,口腔矫治器治疗可以有效地改善OSAHS患者的心理状况。     

周围性面瘫的MRI增强扫描检查和损伤节段观察及预后相关性分析

目的 探究周围性面瘫的MRI检查和损伤节段观察及预后相关性。方法 周围性面瘫患者15例,用Siemens Magnet V1.5 T超导型磁共振,头线圈,扫描双侧颞骨,单侧面瘫扫描双侧面神经,健侧为阴性对照。常规T1WI、T2WI轴面及冠状面薄层扫描后,行T1WI-vibe横断位、T2WI-TSE冠状位、T2WI-SPACE横断位、增强后T1WI-Vibe横断位及T1WI-TSE冠状位扫描及钆喷替酸葡甲胺(Gd-DTPA)增强扫描(对比剂剂量0.1mmol/kg),延时30min对病变进行MRI扫描及图像多平面重建。结果 ①与手术相关者3例,面神经MRI重建显示面神经全程完整1例,没有中断、水肿。3个月后恢复,为H-B 1级。术前就发生面瘫的岩部巨大胆脂瘤患者1例,显示全程水肿,但没有中断,术后恢复十分缓慢,为H-B 3级。第3例巨大听神经瘤患者,MRI重建显示面神经仍连续,与术中观察一致。术前面瘫H-B 6级,术后仍为6级;②Bell氏面瘫者6例中,显示内听道段至鼓室段均有强化1例,强化在膝状神经节至乳突段2例,只在内听道段2例,在内听道段、迷路段、膝状神经节及鼓室段1例,术后均痊愈,H-B分级全部达到1级;③HUNT综合征患者6例中,未见面神经异常1例,强化在内听道2例,另膝状神经节强化3例,其中2例伴内听道内强化,只有1例还涉及乳突段,伴有耳蜗增强改变5例,治疗后H-B分级全部达到1级。结论 MRI增强和重建,可以很好地显示面神经损伤的节段和范围,也能为预后判定提供一些信息。     

低温等离子射频消融治疗常年性变应性鼻炎合并支气管哮喘的疗效及安全性评价

目的 探讨低温等离子射频消融治疗常年性变应性鼻炎合并支气管哮喘的疗效及安全性。方法 选择80例常年性变应性鼻炎合并支气管哮喘患者的临床资料,其中,观察组40例采用低温等离子射频消融术进行治疗,对照组40例采用微波治疗,比较两组的临床效果。结果 观察组支气管哮喘总有效率为90%,其常年性变应性鼻炎总有效率为95%,均明显高于对照组(P<0.05)。观察组鼻结膜炎生存质量问卷(RQLQ)评分、视觉模拟量(VAS)评分以及成人哮喘生存质量问卷(AQLQ)评分均较对照组明显改善(P<0.05)。结论 低温等离子射频消融术治疗常年性变应性鼻炎合并支气管哮喘疗效显著,改善了患者生活质量,值得临床应用。     

Assessment of Nutrient Supplement to Reduce Gentamicin-Induced Ototoxicity

Gentamicin is an aminoglycoside antibiotic used to treat gram-negative bacterial infections. Treatment with this antibiotic carries the potential for adverse side effects, including ototoxicity and nephrotoxicity. Ototoxic effects are at least in part a consequence of oxidative stress, and various antioxidants have been used to attenuate gentamicin-induced hair cell death and hearing loss. Here, a combination of nutrients previously shown to reduce oxidative stress in the hair cells and attenuate hearing loss after other insults was evaluated for potential protection against gentamicin-induced ototoxicity. Guinea pigs were maintained on a nutritionally complete standard laboratory animal diet or a diet supplemented with β-carotene, vitamins C and E, and magnesium. Three diets with iterative increases in nutrient levels were screened; the final diet selected for study use was one that produced statistically reliable increases in plasma levels of vitamins C and E and magnesium. In two separate studies, significant decreases in gentamicin-induced hearing loss at frequencies including 12 kHz and below were observed, with less benefit at the higher frequencies. Consistent with the functional protection, robust protection of both the inner and outer hair cell populations was observed, with protection largely in the upper half of the cochlea. Protection was independently assessed in two different laboratories, using two different strains of guinea pigs. Additional in vitro tests did not reveal any decrease in antimicrobial activity with nutrient additives. Currently, there are no FDA-approved treatments for the prevention of gentamicin-induced ototoxicity. The current data provide a rationale for continued investigations regarding translation to human patients.     

Evaluation of airway obstruction using virtual endoscopy

OBJECTIVES: This study examines the use of virtual endoscopy (VE) in the evaluation of patients with upper airway obstruction. The utility of VE compared with actual endoscopy was investigated with respect to accuracy of diagnosis and reproduction of endoscopic images. STUDY DESIGN: A random cohort of 30 patients with various causes of airway obstruction was examined. METHODS: The computed tomography (CT) data were reconstructed using a proprietary VE software program, FreeFlight, blind to the actual endoscopic findings. The cause of obstruction was identified and compared with actual endoscopic findings. This included 21 patients with airway stenoses, 8 patients with laryngotracheomalacia, 3 tracheal tumors, 2 glottic webs, 5 patients with innominate artery compression, 2 tracheal granulomas, and 7 patients with impaired true vocal cord mobility. RESULTS: Virtual endoscopic evaluation was accurate in assessing stenosis width and length of fixed airway lesions. Correlation of stenosis shape and contour between actual endoscopy and VE was excellent. The stenosis-to-lumen ratios were compared between VE and actual endoscopy and were found to be within 10% (SD = 8). However, virtual endoscopic evaluation could not illustrate one of the glottic webs, half of the cases of tracheomalacia, or any of the cases of impaired true vocal cord mobility. CONCLUSIONS: Virtual endoscopy was not as sensitive as actual endoscopy in detecting the cause of airway obstruction that was based on dynamic movement. However, VE was excellent for the measurement and definition of fixed airway lesions.     

慢性鼻-鼻窦炎的组织重塑研究进展

慢性鼻-鼻窦炎的病理特点是鼻腔及鼻窦黏膜存在持续炎症浸润,依据是否存在鼻息肉,被分为伴息肉及不伴息肉型。现有的研究表明,慢性鼻-鼻窦炎的发生、发展中存在组织重塑,其中TGF-β及基质金属蛋白酶是影响重塑最重要的细胞因子。研究重塑过程中的细胞因子及其作用机制,有助于选择最佳的治疗靶点。未来研究应进一步明确慢性鼻-鼻窦炎组织重塑复杂径路。     

离体培养时Wnt3a对椭圆囊毛细胞再生的影响

目的 在小鼠椭圆囊体外培养模型上,通过Wnt3a激活经典WNT信号,与DMSO共同作用,研究其对椭圆囊毛细胞再生的影响。方法 40只小鼠随机分成8组。实验第一部分：小鼠椭圆囊经4mmol/L新霉素处理后,在不同浓度(0、25、100、200ng/mL)Wnt3a的培养液中继续培养1d,培养结束后对β-catenin,毛细胞纤毛及细胞核进行免疫荧光染色。实验第二部分：小鼠椭圆囊经4mmol/L新霉素处理后,在含25ng/mL Wnt3a的培养液中培养6d,分别在空白对照组,50μmol/L DAPT、0.1%DMSO、50μmol/L DAPT+25ng/mL Wnt3a培养液中继续培养7d,共培养14d。在所有培养过程中均加入10μmol/L Brdu。培养结束后Brdu,Myocin7a及细胞核进行免疫荧光染色。结果 实验第一部分：在25ng/mL Wnt3a组中可见β-catenin在支持细胞胞浆中有阳性表达,β-catenin阳性细胞数与其他各组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。实验第二部分：DMSO组中可见Myosin7a染色阳性细胞,对照组、Wnt3a+DAPT组及DATP组中可见大量Brdu阳性细胞而未见Myosin7a染色阳性细胞,DMSO组中Myosin7a阳性细胞数与其他3组相比较,组间差异具有显著性(P<0.01)。结论 顺序联合应用Wnt3a和DMSO可通过激活经典WNT信号途径,促使椭圆囊内细胞向毛细胞样细胞转分化。