人表皮干细胞的体外分离和培养

背景：如何获得高纯度的表皮干细胞以及维持其干细胞表型和体外增殖特性，是目前表皮干细胞体外培养过程中急需解决的问题。目的：建立人表皮干细胞体外分离和培养的技术方法。设计、时间及地点：细胞观察，于2005-03／2006-05在南昌大学第一附属医院烧伤科完成。材料：所用包皮来自2～12岁行包皮环切术的患者，患者无泌尿系统感染等疾病。方法：取包皮皮片，采用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞，Ⅳ型胶原快速黏附法富集分离表皮干细胞。收集处于指数生长期第二三代成纤维细胞的上清液，过滤后与角朊细胞无血清培养基等比例混合，并加入胎牛血清、表皮生长因子、牛垂体提取物等组成表皮干细胞培养液，用以人表皮干细胞的体外扩增培养，以角朊细胞作对照。主要观察指标：传至第2代，通过平板克隆形成实验计算克隆形成率和克隆维持时间，采用免疫组织化学染色检测β1整合素和角蛋白19的表达。结果：①与同一标本同一批次培养的角朊细胞相比，人表皮干细胞的克隆形成率明显升高，克隆维持时间延长（P〈0．01）。②表皮干细胞β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色均呈阳性。结论：应用Ⅳ型胶原快速黏附法及人成纤维细胞条件培养基，对人表皮干细胞成功进行了体外分离和培养。     

Ⅳ型胶原快速黏附法体外分选人胎儿表皮干细胞

背景:发育生物学研究表明,表皮干细胞是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键性源泉,如何从皮肤组织中分离获得更多的表皮干细胞,并在体外培养过程中保持干细胞特性是其在皮肤组织工程中应用的重要前提。目的:观察Ⅳ型胶原快速黏附法分选的人胎儿表皮干细胞体外生长状态及克隆形成情况,并与角质细胞进行对照。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料:因创伤等原因致意外流产的妊娠24~26周龄胎儿皮肤标本,由南昌大学第一附属医院产科提供。Ⅳ型胶原为美国Sigma公司产品,角质细胞无血清培养基为美国Gibco公司产品。方法:将Ⅳ型胶原用磷酸盐缓冲液稀释成100mg/L,均匀涂被培养板后于超净工作台中风干备用。无菌条件下取胎儿皮肤标本,剪成3.0mm×5.0mm皮条片,4℃胰蛋白酶 EDTA联合消化8~10h,表皮真皮分离,用角质细胞无血清培养基将表皮反复吹打,获得单细胞悬液接种于预处理好的Ⅳ型胶原培养板,置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中,20min后吸去培养液和未黏附细胞,加入含体积分数为0.1的胎牛血清、10μg/L表皮生长因子及角质细胞无血清培养基的表皮干细胞培养液,细胞约70%~80%融合后传代扩增;将未黏附细胞接种于另一培养板中,相同条件下作为角质细胞对照培养。主要观察指标:表皮干细胞的形态变化、免疫细胞化学染色鉴定结果及克隆形成率。结果:经贴壁筛选的表皮干细胞接种后呈圆形,折光性较强;1d后细胞略伸展为扁平的多角形,胞质近中央处有圆形核;3d时出现表皮干细胞克隆;5d时克隆数量明显增多,细胞之间紧密衔接,呈铺路石状;14d左右细胞基本融合。分离培养的人表皮干细胞克隆β1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。表皮干细胞克隆形成率明显高于角质细胞克隆形成率(t=1.972,P<0.05)。结论:采用Ⅳ型胶原快速黏附法成功筛选出纯度较高的人胎儿表皮干细胞,且呈明显克隆性生长,具有典型的干细胞生物学特性。     

成体表皮干细胞的分离培养与鉴定

目的 探讨成体表皮干细胞体外分离、培养和鉴定的技术方法。为组织工程皮肤的构建提供种子细胞。方法 通过中性蛋白酶消化成人包皮获得表皮细胞，再通过胰蛋白酶与乙二胺四乙酸（EDTA）消化并制成单个表皮细胞悬液，接种至人胎盘Ⅳ型胶原包被的培养瓶内．以Dulbecco改良Eagle培养基／F12（DMEM／F12，1：1）作为表皮干细胞培养基置培养箱内培养，37℃静置10～l5min，留用快速贴壁细胞继续培养，所得细胞分别以能否呈克隆状生长、流式细胞仪测细胞周期、透射电镜观察其超微结构及β1-整合素、角蛋白19（K19）免疫细胞化学染色进行鉴定。结果 人胎盘Ⅳ型胶原包被的培养瓶内快速贴壁细胞继续培养24h后细胞呈克隆状生长；电镜观察其超微结构示非成熟细胞特征；细胞周期分析示，第2代中静息期／DNA合成前期（G0／G1期）细胞占86．83％。β1-整合素、K19免疫细胞化学染色呈阳性。结论 成体表皮干细胞在体外得到成功分离与培养。     

体外分离、纯化人表皮于细胞促进皮肤的功能生理性修复

目的 表皮干细胞是皮肤发生、修复、重建的关键“种子细胞”，因而研究建立人表皮干细胞体外分离、培养及鉴定的方法非常重要。方法 通过本科消化法，分离小儿包皮的表皮与真皮层，表皮制成单细胞悬液，以高糖低钙的DMEM培养基，补充100ml/L的干细胞培养专用胎牛血清（FBS），0.05mmol/L氯化钙，10ng/ml表皮生长因子，1&;#215;10^-6mol/L氢化可的松进行培养，在实验之前用胶原Ⅳ包被直径35mm的培养皿，其中有些放置消毒盖坡片以制“细胞玻片”，置4℃冰箱中放置30min以上，吸干胶原Ⅳ，再将培养皿置室温下自然干燥半小时以上，备用。调整细胞含量为2&;#215;10^6/ml，接种于包被好胶原Ⅳ的培养皿中快速黏附10-15min（37℃），弃去未黏附细胞，保留快速黏附细胞继续培养。培养至21d对所培养细胞进行流式细胞仪α6、CD71表型鉴定，角蛋白19（K19）、角蛋白5（K5）免疫细胞化学染色鉴定以及形态学观察、克隆计数。结果 在胶原Ⅳ包被的细胞化学染色鉴定以及形态学观察、克隆计数。结果 在胶原Ⅳ包被的培养皿中快速贴壁细胞经继续培养，可见细胞克隆数增多，细胞传代次数达8-10次，培养时间达2个月。K19，K5免疫化学染色阳性，α6^briCD71^dim细胞占细胞总数的40%左右。结论 研究表明用胶原Ⅳ快速黏除法可从包皮分离和富集表皮干细胞，用此体外培养体系，可较好地扩增表皮干细胞。     

皮肤组织工程中表皮干细胞培养的实验研究

目的:通过表皮干细胞对基底膜的黏附性,利用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为递质,探索提取和培养表皮干细胞的技术方法。方法:取新生1～3d的Wistar大鼠全层皮肤,通过酶消化法获得幼鼠表皮,并制成单表皮细胞悬液。以层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为基底膜的替代物,利用表皮干细胞对基底膜的吸附性筛选表皮干细胞。结果:与角质细胞对照,表皮干细胞对层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的吸附性很好,克隆形成率较高。用SABC法对其进行整合素β1单抗的免疫组化染色;广谱角蛋白单抗的免疫组化染色观察细胞克隆的细胞浆内出现棕黄色的阳性表达。结论:用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原快速黏附法可从大鼠皮肤分离和富集表皮干细胞。     

体外分离、纯化人表皮干细胞促进皮肤的功能生理性修复

目的表皮干细胞是皮肤发生、修复、重建的关键“种子细胞”,因而研究建立人表皮干细胞体外分离、培养及鉴定的方法非常重要。方法通过酶消化法,分离小儿包皮的表皮与真皮层,表皮制成单细胞悬液,以高糖低钙的DMEM培养基,补充100ml/L的干细胞培养专用胎牛血清(FBS),0.05mmol/L氯化钙,10ng/ml表皮生长因子,1×10-6mol/L氢化可的松进行培养。在实验之前用胶原IV包被直径35mm的培养皿,其中有些放置消毒盖玻片以制“细胞玻片,置4℃冰箱中放置30min以上,吸干胶原IV,再将培养皿置室温下自然干燥半小时以上,备用。调整细胞含量为2×106/ml,接种于包被好胶原IV的培养皿中快速黏附10～15min(37℃),弃去未黏附细胞,保留快速黏附细胞继续培养。培养至21d对所培养细胞进行流式细胞仪α6、CD71表型鉴定,角蛋白19(K19)、角蛋白5(K5)免疫细胞化学染色鉴定以及形态学观察、克隆计数。结果在胶原IV包被的培养皿中快速贴壁细胞经继续培养,可见细胞克隆数增多,细胞传代次数达8～10次,培养时间达2个月。K19,K5免疫化学染色阳性,α6briCD71dim细胞占细胞总数的40%左右。结论研究表明用胶原IV快速黏附法可从包皮分离和富集表皮干细胞,用此体外培养体系,可较好地扩增表皮干细胞。     

皮肤组织工程中表皮干细胞培养的实验研究

目的：通过表皮干细胞对基底膜的黏附性，利用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为递质，探索提取和培养表皮干细胞的技术方法。方法：取新生1～3d的Wistar大鼠全层皮肤，通过酶消化法获得幼鼠表皮，并制成单表皮细胞悬液。以层粘连蛋白和Ⅳ型胶原作为基底膜的替代物，利用表皮干细胞对基底膜的吸附性筛选表皮干细胞。结果：与角质细胞对照，表皮干细胞对层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的吸附性很好，克隆形成率较高。用SABC法对其进行整合素β1单抗的免疫组化染色；广谱角蛋白单抗的免疫组化染色观察细胞克隆的细胞浆内出现棕黄色的阳性表达。结论：用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原快速黏附法可从大鼠皮肤分离和富集表皮干细胞。     

重复利用Ⅳ型胶原以差速贴壁法分选表皮干细胞

目的:观察表皮干细胞对Ⅳ型胶原的黏附特性,评价重复利用Ⅳ型胶原以差速黏附法在分选表皮干细胞中的效果。方法:实验于2004-09/2005-06在解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所基础部完成。①包皮来自解放军空军总医院泌尿外科收治的7～25岁行包皮环切术患者。②未包被胶原的培养瓶作为对照1组,首次Ⅳ型胶原和3次Ⅳ型胶原包被的培养瓶分别作为对照2组和实验组1,将包被Ⅳ型胶原并曾黏附细胞的培养瓶消化后作为实验组2。③人角质形成细胞分别接种其上,15min后对贴壁细胞进行显微摄像并计数;对贴壁细胞的生长及增殖活性进行观察;并用β1整合素、鼠抗人角蛋白19对贴壁的细胞进行鉴定。结果:①胶原包被组的贴壁细胞数明显增多(P≤0.05),并于5d铺满培养瓶底,而对照1组2d后仍未铺满瓶底。对照1组15min细胞贴壁数显著低于对照2组、实验1组、实验2组[(119.0±3.0),(246.3±19.6),(241.3±15.3),(262.0±11.1)个/100倍视野,P≤0.01];对照2组与各实验组差异无显著性意义(P>0.05)。②贴壁细胞β1整合素和鼠抗人角蛋白19表达阳性。结论:表皮干细胞对Ⅳ型胶原具有较好的黏附特性,回收利用Ⅳ型胶原对表皮干细胞的黏附特性几乎无影响,并可节约费用。     

人皮肤真皮组织中角朊干细胞样细胞的分离与培养

背景：皮肤真皮组织是皮肤损伤修复时除表皮基底层以外可形成表皮层结构的重要干细胞来源。目的：探索从人皮肤真皮组织中分离培养角朊干细胞样细胞的新方法。方法：将一定大小的成人腹部全层皮肤组织用Dispase过夜消化后去除表皮层结构,然后用0．1％I型胶原酶过夜消化,离心分离以获取真皮来源总细胞。将分离的细胞用含有体积分数1％N2,2％B27,20μg／L表皮生长因子和40pg／L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM／F12（1：1）无血清培养液悬浮后以低密度接种于培养皿进行培养。采用RT-PCR和免疫细胞荧光染色法对其进行分析。结果与结论：RT-PCR分析结果显示所分离的真皮细胞中含有表达Lgr5和Lirgl等特异基因的毛囊来源干细胞;免疫细胞荧光分析结果显示其表达细胞角蛋白8和细胞角蛋白14。在无血清条件下培养6d时,可观察到表达细胞角蛋白14和整合素α6的“铺路石”样细胞克隆。进行传代培养后P1细胞表达角朊干细胞标志物CD29、细胞角蛋白14和P63。传代培养至P3,4时大部分细胞分化,不能继续传代。结果证实,以无血清培养液结合低密度培养法可直接从人真皮组织中有效地培养增殖活跃、细胞角蛋白14和P63阳性的角朊干细胞样细胞。     

黄芪多糖对毛囊干细胞增殖及其特异性标记物K19及β1整合素基因表达的调控作用

目的:观察黄芪多糖对毛囊干细胞增殖及其特异性标记物K19及β1整合素基因表达的调控作用。方法:取7～8 d龄Wistar大鼠,分离隆突区细胞,用Ⅳ型胶原黏附法获取毛囊干细胞。将获取的毛囊干细胞分为实验组a1～a4(培养液中分别加入黄芪多糖50～5μg/mL)及对照组b,未黏附细胞设为对照组c(KSFM培养液中均不加入黄芪多糖),培养10 d。运用K15、19及β1整合素单克隆抗体免疫组化鉴定培养细胞;并测定各组培养细胞K15、K19、β1整合素阳性表达率;Real-Time PCR检测各组培养细胞K19、β1整合素mRNA表达因表达水平。结果:免疫组化鉴定显示Ⅳ型胶原黏附细胞符合毛囊干细胞特征。实验组K15、K19、β1整合素阳性表达率及K19、β1整合素基因表达水平较对照组显著提高(P<0.05),黄芪多糖浓度为10～20μg/mL时作用最为明显。结论:黄芪多糖能促进毛囊干细胞增生及特异性标记物K19、β1整合素基因表达,中药黄芪促进毛发生长或治疗脱发病的机制可能与此相关。     

自制血清替代物行无血清条件培养人表皮干细胞

目的:建立一种人表皮干细胞的无血清培养方法,并与目前表皮干细胞常用的有血清培养方法进行比较,探讨该条件是否更适合表皮干细胞的生长和有利于实施表皮干细胞的调控,提高实验的准确性。方法:实验于2002-05/2004-07在江西医学院第二附属医院医学分子中心完成。①从幼儿包皮中分离表皮细胞、用胶原Ⅳ分别黏附表皮细胞10～15min,收集黏附细胞,即为纯化的表皮干细胞。②分3组进行培养,3组培养条件均有无钙低糖Dulbecco改良的Eagle培养基,0.05mmol/LCaCl2,10μg/L表皮细胞生长因子,1×10-6mol/L氢化可的松;有血清培养组还含有100g/L螯合钙的干细胞专用血清;无血清培养组1还含有100g/L无血清培养基血清替代物。无血清培养组2还含有100g/L无血清培养基血清替代物和50μg/L牛垂体提取物。③培养20d后,在倒置显微镜下对所培养细胞进行形态学观察;同时计数细胞数(大于100个细胞团为1个集落称克隆),计数各组克隆数;采用胰酶消化传代,计数传代数及多次传代后所得细胞总数;流式细胞术分析α6,CD71(人表皮干细胞表面标记)的表达情况,计算人表皮干细胞α6briCD71dim细胞百分率;采用流式细胞术进行细胞周期分析处于静止期/DNA合成前期人表皮干细胞百分率,采用免疫组化法鉴定细胞角蛋白19及5/8(均表明人表皮干细胞生长情况,且以角蛋白19更能明确表明人表皮干细胞生成情况)和角蛋白10表达情况。结果:①人表皮干细胞细胞形态学观察结果:应用倒置显微镜下观察检测,无血清培养组1与有血清培养组人表皮干细胞细胞形态学基本相同,无血清培养组1集落形成时间稍晚于有血清培养组。②形成的克隆数及经胰酶消化可传代数、细胞总得数:胰酶消化传代后,形成的克隆数、细胞总得数及细胞传代数无血清培养组1与有血清培养组相近(P>0.05),两组形成的克隆数、细胞总得数明显低于无血清培养组2(P<0.05)而细胞传代数组明显高于无血清培养组2(P<0.05)。③细胞周期分析及α6,CD71鉴定结果:采用流式细胞术检测,有血清培养组与无血清培养组1中人表皮生长干细胞α6briCD71dim细胞百分率及处于静止期/DNA合成前期细胞(即人表皮干细胞)百分率相近(P>0.05),且均高于无血清培养组2(P<0.05)。④细胞角蛋白19和5/8及10表达情况:免疫细胞化学鉴定结果,有血清培养组与无血清培养组1角蛋白19和5/8及10阳性细胞百分率相近(P>0.05),而两组角蛋白19阳性细胞百分率明显高于无血清培养组2(P<0.05),角蛋白5/8和10阳性细胞百分率明显低于无血清培养组2(P<0.05)。结论:①利用自制的无血清培养基血清替代物,添加一些辅助因子(0.05mmol/LCaCl2,10μg/L表皮细胞生长因子,1×10-6mol/L氢化可的松)能较好的培养表皮干细胞,传代次数多,培养时间长,形成克隆数较多,说明此类细胞具有较强的自我复制能力,结合所培养细胞中人表皮干细胞α6briCD71dim细胞及角蛋白19和5/8阳性细胞比例较高等特点,表明该无血清培养条件适合表皮干细胞的生长。②自制的无血清培养基血清替代物添加一些辅助因子(0.05mmol/LCaCl2,10μg/L表皮细胞生长因子,1×10-6mol/L氢化可的松,50μg/L牛垂体提取物)的无血清培养组2能较快获得大量人表皮细胞,当组织工程需要大量细胞时可用此种培养扩增方法。     

鼠表皮干细胞的稳定分选方法及其体外培养体系建立

背景:采用多种人工合成材料构建的组织工程皮肤,存在着创面愈合后不耐受摩擦、瘢痕增生及挛缩严重、缺乏皮肤附件等不足.而表皮干细胞尽管在体内可无限增殖分化以维持皮肤更新,但在体外普通培养条件下易发生终末分化.目的:为抉得稳定生长的鼠表皮干细胞,拟建立或完善能够调控其增殖分化的体外培养体系.设计、时间及地点:细胞观察,于2007-05/11在广州市创伤外科研究所完成.材料:清洁级1～3 d龄Wistar大鼠20只用于制备表皮于细胞.方法:采用两步酶消化法获得单个表皮细胞悬液,Ⅳ型胶原快速贴壁法分选贴壁细胞,加入含胎牛血清、0.05 mmol/L CaCl2以及表皮细胞生长因子、腺苷、胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素等复合的DMEM培养基进行培养,原代分离细胞时胎牛血清体积分数为0.2以维持细胞活性,第2次换液时改为0.1.主要观察指标:光镜下观察细胞生长情况,免疫组化法检测目的细胞角蛋白19和P63整合素的表达,流式细胞仪检测β1整合素和CD71的表达,通过细胞周期及生长曲线观察其增殖能力.结果:①Ⅳ型胶原筛选的细胞在复合DMEM培养基中生长良好,细胞活性>98%,培养6 d后形成含100-200个细胞的大克隆,呈鹅卵石样铺满瓶底.②角蛋白19和P63均呈阳性表达,β1整合素表达率为98.57%,CD71表达率为9.05%.③94.99%细胞处于G0/G1期,细胞呈指数增长.结论:两步酶消化 Ⅳ型胶原快速黏附法可成功分选稳定生长的鼠表皮干细胞.含霍乱毒素、腺苷、胰岛素等因子的复合DMEM培养基可维持表皮干细胞的增殖能力,其中合适的血清浓度及Ca2 浓度至关重要.     

不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶反转录酶表达的比较

目的:目前已知端粒酶活性的丧失及其增殖相关基因表达的改变是造成多种成体干细胞体外复制和扩增受限的主要原因,而端粒酶反转录酶对端粒酶活性起关键作用。体外分离培养人胚胎、少儿、成人3种不同皮肤来源的表皮干细胞,对比观察不同发育阶段端粒酶反转录酶表达的差异。方法:实验于2005-09/2007-04在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。①对象:因创伤等原因致意外流产的妊娠24～26周龄胎儿皮肤标本,4～12周岁少儿及25～45岁成年人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本,分别由南昌大学第一附属医院产科、烧伤科提供,产妇与烧伤患者对治疗及实验均知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:取胎儿、少儿和成年人的全层皮肤,用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,胶原快速贴附法纯化人表皮干细胞,用未黏附的角质细胞作为对照,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液组成的表皮干细胞培养基进行体外培养。③实验评估:通过β_1整合素、角蛋白19、p63免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定,计算克隆形成率。以免疫细胞化学染色法和图像定量分析法检测3种不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶的表达差异。结果:①细胞生长特征:分离培养的人表皮干细胞呈明显克隆性生长,克隆形成率高于角质细胞对照组(P<0.05)。②表皮干细胞的鉴定:细胞克隆经免疫细胞化学染色后,β_1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。③端粒酶反转录酶免疫细胞化学染色及定量表达:不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶均呈阳性,但表达强度不同,人胚胎>少儿>成人。3种皮肤来源的表皮干细胞平均吸光度值和阳性面积值均随年龄增加而逐渐降低,人胚胎>少儿>成人(P<0.05)。结论:人胚胎、少儿、成人皮肤来源的表皮干细胞均有端粒酶反转录酶表达,其表达强度依次减弱。提示诱导和增强端粒酶反转录酶的表达对维持表皮干细胞在体外自我更新和增殖能力可能具有重要意义。     

重复利用Ⅳ型胶原以差速贴壁法分选表皮干细胞

目的：观察表皮干细胞对Ⅳ型胶原的黏附特性，评价重复利用Ⅳ型胶原以差速黏附法在分选表皮干细胞中的效果。 方法：实验于2004—09／2005-06在解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所基础部完成。①包皮来自解放军空军总医院泌尿外科收治的7-25岁行包皮环切术患者。②未包被胶原的培养瓶作为对照1组，首次Ⅳ型胶原和3次Ⅳ型胶原包被的培养瓶分别作为对照2组和实验组1，将包被Ⅳ型胶原并曾黏附细胞的培养瓶消化后作为实验组2。③人角质形成细胞分别接种其上，15min后对贴壁细胞进行显微摄像并计数；对贴壁细胞的生长及增殖活性进行观察；并用β1整合素、鼠抗人角蛋白19对贴壁的细胞进行鉴定。 结果：①胶原包被组的贴壁细胞数明显增多沪≤0．05），并于5d铺满培养瓶底，而对照1组2d后仍未铺满瓶底。对照1组15min细胞贴壁数显著低于对照2组、实验1组、实验2组[（119．0&;#177;3．0），（246．3&;#177;19．6），（241．3&;#177;15．3），（262．0&;#177;11．1）个／100倍视野，P≤0．01]；对照2组与各实验组差异无显著性意义（P〉0．05）。②贴壁细胞β1整合素和鼠抗人角蛋白19表达阳性。 结论：表皮干细胞对Ⅳ型胶原具有较好的黏附特性，回收利用Ⅳ型胶原对表皮干细胞的黏附特性几乎无影响，并可节约费用。     

不同发育阶段人皮肤表皮干细胞增殖分化相关基因的表达特征

背景：目前研究认为表皮干细胞数量及增殖分化潜能的差异,可能是创面愈合能力随年龄增大而逐渐降低的重要原因之一。目的：探讨不同发育阶段人皮肤表皮干细胞B1整合素、角蛋白19、p63转录因子和端粒酶反转录酶的表达特征。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2005—09／2007—04在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料：流产胎儿皮肤标本由南昌大学第一附属医院产科提供,4～12周岁少儿、25～45岁成人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本由南昌大学第～附属医院烧伤科提供。方法：标本取材后立即用中性甲醛固定,常规石蜡包埋,4℃保存。所有标本经系列切片后,分别采用鼠抗人角蛋白19、β1整合素、p63转录因子、端粒酶反转录酶单克隆抗体作为一抗,以免疫组织化学EnVision法检测皮肤组织中表皮干细胞标志物的表达。 主要观察指标：200倍光镜下观察免疫组化染色结果,测定表皮干细胞标志物阳性表达率。结果：胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤表皮的基底部、毛囊周围细胞B1整合素、角蛋白19、p63和端粒酶反转录酶均呈棕黄色阳性表达。胎儿表皮基底层细胞β1整合素、角蛋白19和p63均呈强阳性表达：少儿表皮基底层细胞叶1大部分表达β1整合素、角蛋白19和p63,阳性细胞均匀分布;成人表皮基底层细胞B1整合素、角蛋白19和p63呈弱阳性表达,阳性细胞散在分布;胎儿表皮基底层端粒酶反转录酶阳性细胞表达强度,少儿表皮〉成人表皮。随年龄的增加,β1整合素、角蛋白19、p63和端粒酶反转录酶在胎儿、少儿、成人皮肤组织中的阳性表达率呈下降趋势（F=5．06,P〈0．01）。 结论：胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤表皮干细胞主要位于表皮基底层,端粒酶表达阳性区域及信号强度与表皮干细胞的定位分布及阳性表达强度相一致。提示表皮干细胞的数量、端粒酶活性表达的强弱可能与不同发育阶段皮肤组织的修复能力差异密切相关。     

自制血清替代物行无血清条件培养人表皮干细胞

目的：建立一种人表皮干细胞的无血清培养方法，并与目前表皮干细胞常用的有血清培养方法进行比较，探讨该条件是否更适合表皮干细胞的生长和有利于实施表皮干细胞的调控，提高实验的准确性。方法：实验于2002-05／2004-07在江西医学院第二附属医院医学分子中心完成。①从幼儿包皮中分离表皮细胞、用胶原Ⅳ分别黏附表皮细胞10～15min，收集黏附细胞，即为纯化的表皮干细胞。②分3组进行培养，3组培养条件均有无钙低糖Dulbecco改良的Eagle培养基，0．05mmol／LCaCl2，10μg／L表皮细胞生长因子，1&;#215;10^-6mol／L氢化可的松；有血清培养组还含有100g／L螯合钙的干细胞专用血清；无血清培养组1还含有100g／L无血清培养基血清替代物。无血清培养组2还含有100g／L无血清培养基血清替代物和50μg／L牛垂体提取物。③培养20d后。在倒置显微镜下对所培养细胞进行形态学观察；同时计数细胞数(大于100个细胞团为1个集落称克隆)，计数各组克隆数；采用胰酶消化传代，计数传代数及多次传代后所得细胞总数；流式细胞术分析α6，CD71(人表皮干细胞表面标记)的表达情况，计算人表皮干细胞α6bri CD71dim细胞百分率；采用流式细胞术进行细胞周期分析处于静止期／DNA合成前期人表皮干细胞百分率，采用免疫组化法鉴定细胞角蛋白19及5／8(均表明人表皮干细胞生长情况，且以角蛋白19更能明确表明人表皮干细胞生成情况)和角蛋白10表达情况。结果：①人表皮干细胞细胞形态学观察结果：应用倒置显微镜下观察检测，无血清培养组1与有血清培养组人表皮干细胞细胞形态学基本相同，无血清培养组1集落形成时间稍晚于有血清培养组。②形成的克隆数及经胰酶消化可传代数、细胞总得数：胰酶消化传代后，形成的克隆数、细胞总得数及细胞传代数无血清培养组1与有血清培养组相近(P&;gt;0．05)，两组形成的克隆数、细胞总得数明显低于无血清培养组2(P&;lt;0．05)而细胞传代数组明显高于无血清培养组2(P&;lt;0．05)。③细胞周期分析及α6，CD71鉴定结果：采用流式细胞术检测，有血清培养组与无血清培养组1中人表皮生长干细胞α6^briCD71^dim细胞百分率及处于静止期／DNA合成前期细胞(即人表皮干细胞)百分率相近(P&;gt;0．05)，且均高于无血清培养组2(P&;lt;0．05)。④细胞角蛋白19和5／8及10表达情况：免疫细胞化学鉴定结果，有血清培养组与无血清培养组1角蛋白19和5／8及10阳性细胞百分率相近(P&;gt;0．05)，而两组角蛋白19阳性细胞百分率明显高于无血清培养组2(P&;lt;0．05)，角蛋白5／8和10阳性细胞百分率明显低于无血清培养组2(P&;lt;0．05)。结论：①利用自制的无血清培养基血清替代物．添加一些辅助因子(0．05mmol／L CaCl2，10μg／L表皮细胞生长因子，1&;#215;10^-6mol／L氢化可的松)能较好的培养表皮干细胞，传代次数多，培养时间长，形成克隆数较多，说明此类细胞具有较强的自我复制能力，结合所培养细胞中人表皮干细胞α6^briCD71^dim细胞及角蛋白19和5／8阳性细胞比例较高等特点，表明该无血清培养条件适合表皮干细胞的生长。②自制的无血清培养基血清替代物添加一些辅助因子(0．05mmol／LCaCl2，10μg／L表皮细胞生长因子，1&;#215;10^-6mol／L氢化可的松，50μg／L牛垂体提取物)的无血清培养组2能较快获得大量人表皮细胞，当组织工程需要大量细胞时可用此种培养扩增方法。     

表皮干细胞与毛囊干细胞生物学特性的比较

背景:获取更合适的组织工程皮肤种子细胞可使皮肤功能得到更好的修复。目的:分离、培养表皮干细胞和毛囊干细胞,并比较两种细胞的生物学特性。方法:体外分离培养2月龄新西兰兔表皮干细胞和毛囊干细胞,取生长良好的第2,3,6代细胞观察其生物学特性。结果与结论:毛囊干细胞较表皮干细胞贴壁快,具有更高的增殖活性。免疫组化及荧光定量PCR检测显示毛囊干细胞β1整合素、角蛋白19蛋白及mRNA表达均明显高于表皮干细胞。提示作为皮肤组织工程的种子细胞,毛囊干细胞较表皮干细胞更具优势。     

糖尿病大鼠表皮干细胞的分离培养及特性

背景:表皮干细胞作为皮肤组织特异性干细胞,在创面修复中发挥关键作用。但有关糖尿病皮肤来源的表皮干细胞体外分离培养及生物特性研究较少。目的:探索糖尿病大鼠表皮干细胞体外分离培养的方法及其生物特性,为糖尿病难愈创面的防治及机制研究提供实验依据。方法:SD大鼠随机分成糖尿病组和正常对照组。糖尿病组采用一次性腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型,正常对照组不作处理。分别取成模糖尿病和正常大鼠背部全层皮肤,采用酶消化联合Ⅳ型胶原黏附法分离培养大鼠表皮干细胞。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和细胞克隆形成,细胞计数绘制生长曲线,计算克隆形成率,免疫细胞化学染色和图像分析软件鉴定K19、β1-integrin阳性表达和测定阳性细胞的积分吸光度(IA)值。结果与结论:糖尿病组大鼠表皮干细胞原代贴壁数量较少,其克隆形成率明显低于正常对照组(P<0.01)。表皮干细胞的K19、β1-integrin均呈阳性表达,糖尿病组阳性细胞的IA值均低于正常对照组(P<0.01)。结果提示,运用酶消化联合Ⅳ型胶原黏附法可以实现糖尿病大鼠表皮干细胞的体外分离培养;糖尿病大鼠表皮干细胞体外增殖能力较正常皮肤增殖能力弱,这可能是导致糖尿病创面难愈合的重要因素之一。     

Ⅳ型胶原黏附法分选表皮干细胞

目的:评估Ⅳ型胶原黏附法分选表皮干细胞的分选效果及对细胞生物学特性的影响。方法:实验于2004-11/2005-05在中山大学附属第一医院外科实验室完成。选取中山大学附属第一医院外科门诊包皮环切手术患者的皮肤标本5份(患者知情同意),进行表皮细胞的分离培养。取培养的二三代表皮细胞,消化后加入铺有100mg/LⅣ型胶原的培养瓶中分选。取分选细胞悬液于培养箱中过夜培养,第2天取出爬片,磷酸缓冲液冲洗3min×2次,去除残留培养液,4%多聚甲醛室温下固定10min,磷酸缓冲液冲洗3min×2次,以含0.1%Triton-100的3%山羊血清封闭、透膜20min,滴加稀释好的角蛋白K19/β1整合素抗体进行双标,4℃过夜孵育,磷酸缓冲液冲洗3min×2次,加入配置好的双标用二抗,37℃下孵育20min,磷酸缓冲液冲洗3min×2次,加入5mg/L的Hochest33258,标记细胞核,37℃下孵育5min,磷酸缓冲液冲洗3min×2次,滴加含40%甘油的碳酸氢钠缓冲液,盖玻片封片,以上步骤均在暗室中操作,同时以磷酸缓冲液代替一抗作为阴性对照。激光共聚焦显微镜下观察,拍照。同时表达角蛋白K19、β1整合素认为是表皮干细胞。分别取分选前及筛选后细胞各4×106个,检测表皮干细胞(α6briCD71dim细胞)、短暂扩增细胞(α6briCD71bri细胞)及终末分化细胞(α6dim细胞)的百分率及分选前后的细胞周期。结果:①分选后细胞体积小,均匀一致,核浆比例大,免疫荧光检测同时表达K19、β1整合素。②与分选前细胞比较,分选后细胞中表皮干细胞α6briCD71dim细胞、短暂扩增细胞α6briCD71bri细胞的百分率明显增高,差异显著[(9.41±0.31)%,(38.74±1.09)%;(43.66±1.12)%,(48.92±2.49)%,P<0.01]。③与分选前细胞比较,分选后细胞G0/G1期所占比例明显增高,差异显著[(80.80±1.69)%,(94.37±1.32)%,P<0.01]。提示分选后细胞处于相对静止状态的表皮干细胞所占比例高。结论:Ⅳ型胶原黏附分选出的细胞含有高纯度的表皮干细胞,此分选方法对细胞活力无明显影响。能够为组织工程皮肤构建提供理想的种子细胞。     

黄芪对人皮肤表皮干细胞增殖活性的影响

背景:利用干细胞技术修复创面是当前医学领域治疗伤口愈合的重要策略,黄芪具有扶正固本、益气活血、延缓衰老等作用,被广泛应用于临床各科多种病证的治疗.目的:探讨黄芪对人皮肤表皮干细胞增殖活性的调控作用.设计、时间及地点:细胞分子生物学实验,于2005 09/2008-06在南昌大学第一附属医院完成.材料:烧伤整形患者植皮剩余皮片来源于南昌大学第一附属医院烧伤中心.黄芪注射液为正大青春宝药业有限公司产品,批号0207114,每毫升含黄芪甲苷≥1.0 mg,相当于含生药2 g.方法:采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸联合消化法分离表皮,Ⅳ型胶原快速贴附法纯化培养人表皮干细胞.实验组以含黄芪、表皮生长因子和角质细胞无血清培养基组成的表皮干细胞培养液进行体外培养,对照组不含黄芪,其余培养条件相同.主要观察指标:计算细胞克隆形成率,流式细胞仪测定细胞周期,免疫细胞化学染色法和图像定量分析法观察端粒酶反转录酶表达的变化.结果:表皮干细胞呈贴壁生长,10 d左右有大的细胞克隆形成,实验组人表皮干细胞克隆形成率、G0/G1期细胞比例均明显高于对照组(t=3.17,P<0.01;t=2.83,P<0.05).两组细胞端粒酶反转录酶均呈阳性表达,定量分析结果显示实验组平均吸光度值和阳性面积值均明显高于对照组(t=2.25,P<0.05;t=4.12,P<0.01).结论:黄芪可有效增强人皮肤表皮干细胞端粒酶反转录酶的表达和体外增殖活性.