重组粉尘螨Ⅱ类变应原的原核表达及纯化

目的表达并纯化粉尘螨2类变应原Der f 2蛋白,检测其变应原性。方法用1mmol/L的IPTG诱导含重组质粒pET30a-Der f2的大肠埃希菌BL21(DE3),SDS-PAGE电泳检测并纯化目的蛋白,ELISA检测其与尘螨哮喘患者血清IgE的结合活性。结果 SDS-PAGE电泳检测重组质粒pET30a-Der f 2表达产物,其分子质量单位为15ku,与预期大小相符。ELISA检测纯化的Der f 2蛋白可与尘螨哮喘患者血清IgE反应。结论成功获得并纯化了Der f2重组蛋白,该蛋白具有变应原性,为进行尘螨过敏性疾病的变应原特异性免疫治疗的动物实验奠定了物质基础。     

粉尘螨变应原第16组分基因克隆及表达

目的获得粉尘螨变应原第16组分(Der f 16)编码基因并构建其原核表达体系。方法提取粉尘螨总RNA,根据GenBank(AF465625)设计并合成引物,经RT-PCR合成Der f 16全长基因,克隆至pCold TF DNA载体,热转化至E.coli JM109;将测序正确的pCold TF-Der f 16质粒转化BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE验证产物。结果 RT-PCR扩增获得目的基因Der f 16,全长1 443bp,与参考序列同源性99.72%。将构建的pCold TF-Derf 16质粒转化宿主菌E.coli BL21后进行诱导,SDS-PAGE电泳显示其全细胞、上清及沉淀物均有蛋白表达,且上清表达量高于沉淀物。生物信息学分析显示该重组蛋白由480个氨基酸组成,分子质量单位为55.1315ku,二级结构由(-螺旋(35.21%)、延伸主链(20.83%)和无规卷曲(43.96%)组成。该变应原含有4个凝溶胶蛋白位点。结论粉尘螨变应原第16组分原核表达获得成功,为进一步规模生产该变应原并应用于临床诊治奠定了基础。     

粉尘螨Ⅰ类变应原瞬时表达载体的构建及其在烟草中的表达

目的 构建粉尘螨I类变应原瞬时表达载体TRBO-Der f 1并观察其在烟草中的表达。方法 以粉尘螨总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Der f 1基因并定向克隆到瞬时表达载体TRBO中,转化根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV1301株后,抽提质粒进行酶切及PCR鉴定。将含TRBO-Der f 1重组质粒的GV1301注射本氏烟叶片,SDS-PAGE电泳检测注射3、4、5、6 d后Der f 1的表达,并进行Western blot鉴定。结果 电泳及测序表明Der f 1基因克隆成功,大小为627 bp。经PCR及酶切结果证实重组质粒TRBO-Der f 1成功转入根癌农杆菌。SDS-PAGE电泳检测表明,该蛋白于第5和6 d在烟草叶片中高表达,并通过Western blot得到验证。结论 粉尘螨I类变应原Der f 1成功表达于烟草叶片,为进一步研究源于植物的粉尘螨疫苗奠定了基础。     

粉尘螨变应原Der f 8全长基因克隆及表达

目的获得粉尘螨(Dermatophagoides farinae)变应原Der f 8全长基因并构建其原核表达质粒。方法参考Gen Bank登录号为AY283295的Der f 8部分序列设计并合成引物。以粉尘螨总RNA为模板,RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段。采用5′cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得Der f 8全长序列,连接至pMD19-T载体,热转化至大肠埃希菌(Escherichia coli),挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。根据Der f 8全长序列设计并合成引物,以粉尘螨总RNA为模板进行RT-PCR扩增,产物回收后连接pCold TF载体,热转化至E.coli,涂板过夜培养后,挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。将pCold TF-Der f 8质粒转化至E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。采用生物信息学软件预测Der f 8的理化特性、结构和功能,并构建系统进化树。结果以Der f 8部分序列设计的引物行RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段,长度为600 bp;5′RACE获得Der f 8剩余序列,长度为300 bp;以全长基因序列设计的引物进行RT-PCR扩增获得了Der f 8基因CDS区,长度为696 bp,测序均正确。SDSPAGE结果显示,目的蛋白为可溶性表达,相对分子质量(M_r)为81 000,与预期大小一致。序列经生物信息学分析结果显示,Der f 8全长序列与参考序列(Gen Bank登录号为AY283295)同源性为98.49%,预测其编码的疏水性蛋白具有谷胱甘肽S转移酶活性,二级结构包括α-螺旋(45.45%)、延伸主链(11.26%)和无规卷曲(43.29%)。系统进化树结果显示,粉尘螨与户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)聚成一簇。结论获得了Der f 8全长基因及其原核表达质粒。     

粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA原核表达质粒的构建与表达

目的构建粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA基因的重组表达质粒，并在大肠埃希菌中表达。方法采用亚克隆技术，用Sac Ⅰ和Not Ⅰ从重组质粒pMD-18T-Der f2上切下Der f2 cDNA片段，插入表达载体pET-32a( )质粒，转化大肠埃希菌BL21，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性重组子，并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒pET-32a( )-Der f2转化大肠埃希菌，IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳和薄层凝胶扫描定量分析。结果对重组质粒进行酶切和PCR鉴定，获得455bp大小的目的基因片段，与预期结果相符，证明已成功构建携带Der f2基因的重组原核表达质粒pET-32a( )-Der f2。核酸序列测定及同源性分析证实，所构建的原核表达质粒pET-32a( )-Der f2中所含的Der f2 cDNA片段与GenBank中的Der f2序列同源性达到100％。Der f2 cDNA在大肠埃希菌诱导表达后获得分子质量单位为34ku的蛋白，蛋白含量占菌体蛋白含量的16％。结论成功构建了粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA基因的重组表达质粒pET-32a( )-Der f2，并在大肠埃希菌中获得高效表达，为获得重组纯化Der f2变应原并用于尘螨变应性疾病的诊治奠定基础。     

粉尘螨Ⅰ类变应原基因的多态性分析及表达蛋白的特性鉴定

目的克隆表达我国深圳地区粉尘螨I类变应原Der f 1基因,并进行该基因的多态性分析和鉴定该纯化蛋白的变应原性,为研究具有我国区域特色的粉尘螨变应原奠定基础。方法从深圳地区挑取经形态鉴定的活粉尘螨,提取总RNA,RT-PCR扩增Der f 1基因,克隆到T载体测序确认。通过计算机软件进行该基因的多态性分析。将该目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 1。工程菌经IPTG诱导培养,表达Der f 1目的蛋白。重组Der f 1蛋白通过6 His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,并进行Western-Blot检测纯化的Der f 1蛋白与粉尘螨过敏病人血清中IgE的反应性,以鉴定重组Der f 1的变应原性。结果以粉尘螨总RNA为模板,经RT-PCR从深圳地区克隆了4株Der f 1基因。该基因与GenBank公布的Der f 1(No.AB034946.1)比较发现核苷酸的同源性在99.48%-100%之间,理论推导的氨基酸序列同源性在99.69%-100%之间。工程菌经IPTG诱导后高效表达的Der f 1重组蛋白,并主要以包涵体形式存在。Western-Blot试验证实该4株Der f 1基因表达的重组蛋白都具有变应原性。结论本研究克隆了4株深圳地区粉尘螨I类过敏原基因并实现了原核表达,为进一步开展Der f 1蛋白研究和重组变应原免疫治疗疫苗研究奠定基础。     

粉尘螨6类变应原（Der f6）的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定

目的 构建粉尘螨6类变应原（Dermatophagoides farinae，Der f6）基因的高效原核表达载体，并进行表达、纯化及生物学功能分析。 方法 根据Der f6基因已知序列，设计1对引物，通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA，采用RT-PCR方法扩增出Der f6基因片段，PCR产物克隆入pMD18-T载体，转化大肠埃希菌（E.coli Top10），经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养，碱裂解法提取质粒，所得重组质粒pMD18-T-Der f6和空质粒pET-24a同时用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，经纯化后连接并转化至E.coli Top10。构建的重组质粒pET24a-Der f6经PCR、酶切和测序鉴定后，再转化至E.coli BL21（DE3）， 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定其表达效果，用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET24a-Der f6表达产生的组氨酸重组蛋白。 结果 构建了重组质粒pMD18-T-Der f6和pET24a-Der f6。SDS-PAGE 结果表明Der f6基因在E.coli Bl21(DE3）中获得良好的表达，所得重组蛋白相对分子质量(Mr) 为31 000, 与理论值一致, 经亲和层析纯化后，SDS-PAGE 结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting, 结果表明具有良好的IgE结合活性。 结论 克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f6。     

户尘螨Ⅱ类变应原Der p2 T细胞表位融合基因的克隆和原核表达

目的原核表达、纯化户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)主要变应原Der p2的T细胞表位融合肽。方法将已报道的户尘螨Der p2中编码4个T细胞表位(T1~T4)的核苷酸序列以T1-T2-T3-T4的方式连接,人工合成为嵌合基因,命名为Der p2 T。PCR扩增目的基因Der p2 T,将纯化的扩增片段克隆至p ET-28a(+)载体,构建原核重组表达质粒p ET-28a(+)-Der p2 T,并进行双酶切验证。大量诱导表达含p ET-28a(+)-Der p2T的E.coli BL-21菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经Ni-NTA亲和层析获得纯化重组蛋白,并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析。ELISA法检测重组Der p2 T细胞表位融合肽对户尘螨过敏患者血清Ig E抗体的结合能力。结果双酶切结果表明,构建了原核重组表达质粒p ET-28a(+)-Der p2 T。SDS-PAGE分析结果显示,获得相对分子质量(Mr)为10 000的重组Der p2 T细胞表位融合肽。Western blotting分析结果显示,纯化了Der p2的T细胞表位融合肽。Der p2 T细胞表位融合肽对粉尘螨哮喘患者的血清Ig E结合能力[(37.70±9.89)μg/ml]较Der p2显著降低[(85.89±9.63)μg/ml](P0.01)。结论制备Der p2 T细胞表位融合肽。与Der p2相比,重组Der p2 T细胞表位融合肽对户尘螨过敏患者血清Ig E抗体的结合能力明显降低。     

空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1基因的检测

目的应用PCR技术检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1的基因。方法从深圳和北京地区分别收集20台、10台空调过滤网上的灰尘样品,分别提取其生物总基因组DNA作PCR模板,分别设计Der f1和Der p1各两套内外扩增引物分两步进行PCR,通过扩增出目的片段来检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1基因片段,并以深层泥土DNA提取物为阴性对照和以培养的粉尘螨、屋尘螨基因组DNA提取物为阳性对照。PCR产物经电泳后切胶回收目的片段并克隆到T载体上,进行DNA序列分析并与Gen Bank进行同源性比较分析。结果深圳地区20台空调空气滤网上收集的灰尘中均含有粉尘螨和屋尘螨主要变应原Der f1和Der p1基因片段;北京地区10台空调空气滤网上收集的灰尘样品中,只有4份均含有Der f1和Der p1;它们扩增部分的序列与GenBank数据库里相应序列同源性为100%。从阴性对照提取物中未扩增得到目的变应原Der f1和Der p1基因片段,从阳性对照的DNA提取物中分别扩增得到目的变应原Der f1和Der p1基因片段。结论本研究首次应用分子生物学技术证实了空调空气滤网上的灰尘中存在尘螨主要变应原Der f1和Der p1基因,并提示深圳地区空调过滤网灰尘中尘螨可能比北京地区的多,从而为今后防治空调中尘螨引起的变态反应性疾病提供了依据。     

粉尘螨3类变应原基因的克隆、表达、纯化与变应原性鉴定

目的 克隆表达粉尘螨3类变应原（Der f 3）基因，并鉴定纯化蛋白的变应原性。 方法 取华南地区采集经实验室培养的粉尘螨（约500只）提取总RNA，经RT-PCR扩增Der f 3基因。将目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 3。大肠埃希菌（E.coli）BL21（DE3）经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导培养，表达Der f 3目的蛋白。重组rDer f 3蛋白经6His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化，蛋白质印迹法（Western blotting）分析该纯化Der f 3蛋白与粉尘螨过敏患者血清IgE反应性，以鉴定重组Der f 3的变应原性。 结果 以粉尘螨总RNA为模板克隆出Der f 3基因，该基因与GenBank（D63858）公布的Der f 3比较有4个核苷酸差异，但同源性为99.5%。E.coli BL21（DE3） 经IPTG诱导后高效表达Der f 3重组蛋白，主要以包涵体形式存在。经Western blotting分析该重组蛋白Der f 3能与粉尘螨过敏患者血清的IgE反应，而不与健康者血清IgE反应。 结论 构建了华南地区粉尘螨3类变应原的原核表达载体，并高效表达和纯化出具变应原性的Der f 3重组蛋白。     

刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2基因片段克隆、表达及抗原性分析

目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)磷酸甘油酸变位酶2(TgPGAM2)基因片段,并分析其抗原性。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增TgPGAM2基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。结果PCR扩增产物约为750 bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约30 000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析证实其能被兔抗弓形虫血清识别。结论刚地弓形虫RH株TgPGAM2基因片段可在原核表达系统中表达,且该可溶性重组蛋白具有抗原性。     

日本血吸虫组织蛋白酶L1基因在大肠埃希菌中的表达

目的　在原核表达体系大肠埃希菌中进行日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)基因表达。　方法　通过PCR从质粒pcDNA3-SjCL1中扩增得到SjCL1基因 ,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T -1中 ,构建重组质粒pGEX-SjCL1,将该重组质粒转化大肠埃希菌JM109,转化子经异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷诱导表达 ,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)分析SjCL1基因表达产物。　结果　获得长约 1kb的PCR片段 ,构建了pGEX-SjCL1质粒。SDS-PAGE和Westernblotting检测表达产物 ,相对分子质量为 62 0 0 0。　结论　SjCL1基因在大肠埃希菌中以融合形式得到表达。     

粪肠球菌溶血素cylL基因的原核表达

目的克隆表达粪肠球菌溶血素cylL基因,为制备单抗、开发疫苗及其致病机制研究奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增溶血素cylL基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET42a中,构建pET-cylL重组质粒。将pET-cylL质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。经KpnI、XhoI酶切及测序鉴定,以IPTG诱导表达融合蛋白,用SDS-PAGE、Western blot进行分析。结果PCR体外扩增cylL基因产物约206bp,成功构建了重组表达质粒pET-cylL;SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为39.6kD。结论成功构建粪肠球菌溶血素cylL基因的重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 构建日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST-Sj32,观察该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Sj26GST和Sj32抗原编码基因,然后采用基因拼接法剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST-Sj32融合基因,克隆至大肠埃希菌原核表达载体pET28α,构建重组质粒pET28α-Sj26GST-Sj32,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹法对表达产物进行分析和鉴定.结果 基因拼接法扩增出长度约1991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入pET28α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约69×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的25%;Western印迹法鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.

Abstract：

Objective To construct and express the recombinant plasmid pET28α-Sj26GST-Sj32 of Schistosoma japonicum(Sj) in Escherichia coli BL21 (DE3). Methods Total RNA was extracted from Sj adult worms by ultrasound-breaking, Sj26GST and Sj32 antigen gene was respectively amplified by RT-PCR from the total RNA; Sj26GST-Sj32 fusion gene obtained with gene splicing by overlap extension(SOEing) was cloned into prokaryotic expression plasmid pET28α and transformed into Escherichia coli BL2 (DE3) to construct pET28α-Sj26GST-Sj32;BL21 (pET28α-Sj26GST-Sj32) was induced with isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), and the expressed products were analyzed and identified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis (SDS-PAGE)and Western blotting. Results The 1991 bp Sj26GST-Sj32 fusion gene was successfully amplified by gene SOEing and cloned into pET28α by restriction analysis and PCR identification, the recombinant plasmid pET28α-Sj26GST-Sj32 was successfully constructed; the relative molecular mass of the expressed recombinant protein was approximately 69 × 103 by SDS-PAGE, and the amount of the expressed protein was 25% of the total bacterial proteins; the fusion protein could be recognized by sera from rabbits infected with Sj by Western blotting.Conclusions The recombinant plasmid pET28α-Sj26GST-Sj32 is successfully constructed and highly expressed in Escherichia coli in fused form with His-tag, and the expressed fusion protein shows specific antigenicity.     

HEV ORF3真核表达载体的构建、鉴定和真核表达

目的构建表达戊型肝炎病毒(HEV)ORF3-pXF2RH融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的L02细胞系。方法利用PCR技术从HEV基因组中扩增出ORF3基因片断,HindⅢ/EcolⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pXF2RH真核表达载体,转化DH5α菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒ORF3-pXF2RH。将阳性克隆用脂质体法转染L02细胞系,G418筛选抗性克隆,SDS-PAGE、Western blot分析鉴定ORF3-pXF2RH融合蛋白的表达。结果真核表达质粒转染L02细胞,SDS-PAGE显示在28.5kD左右蛋白表达量明显高于对照组,Western blot在28.5kD左右有一条强的棕色条带。结论成功构建ORF3-pXF2RH真核表达质粒,在L02细胞表达融合蛋白,为进一步研究该蛋白生物学功能奠定了基础。     

pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得pTAT-XIAP融合蛋白;为其用于神经系统疾病的治疗奠定基础。方法体外合成大鼠XIAP基因,将其插入pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体,转入大肠杆菌表达菌株BL21plysS进行诱导表达。SDS-PAGE及Western blot法鉴定融合蛋白。结果表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,于64 kD处有一明显表达条带,与理论结果相符。结论成功构建了pTAT-XIAP原核表达载体并成功表达出目的融合蛋白,该载体成功表达pTAT-XIAP融合蛋白,有望用于临床神经系统疾病的治疗。