三氧化二砷对淋巴瘤细胞酪氨酸磷酸酶1基因的去甲基化作用

目的 探讨淋巴瘤细胞系T2和非霍奇金淋巴瘤(NHL)组织中酪氨酸磷酸酶1基因启动子区甲基化状态,三氧化二砷(As2O3)对T2细胞中SHP-1的去甲基化作用及对T2细胞生长增殖的生物学影响.方法 以不同浓度As2O3处理淋巴瘤细胞株T2,采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测T2细胞的生长变化,采用流式细胞术检测细胞凋亡率的变化,采用实时定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和Western blot方法检测T2细胞SHP-1基因mRNA和蛋白表达及c-kit蛋白表达变化.采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测T2细胞和32例NHL组织SHP-1基因启动子甲基化状态.结果 As2O3使T2细胞增殖受抑,凋亡增加,效应均具有时间和剂量依赖性.As2O3能逆转T2细胞SHP-1基因启动子甲基化,SHP-1基因恢复表达,同时c-kit蛋白磷酸化水平降低.SHP-1基因在对照组淋巴组织中呈完全性非甲基化状态,而在NHL组织中启动子甲基化出现率为87.5%(28/32).结论 在淋巴瘤细胞和NHL组织中,SHP-1基因启动子区域存在高度甲基化.As2O3能逆转T2细胞DNA异常甲基化,诱导SHP-1基因表达,并可能通过抑制c-kit受体及其信号传导路径的活化,抑制肿瘤细胞增殖.     

三氧化二砷诱导卵巢癌OVCAR-3细胞周期阻滞及凋亡

目的探讨As2O3对卵巢癌细胞增殖的抑制作用及对细胞周期和凋亡的影响.方法采用MTT法及集落形成实验测定细胞的增殖活力,通过细胞形态学观察细胞分裂及凋亡,应用流式细胞仪进行细胞周期解析、凋亡及bcl-2蛋白表达的检测.结果As2O3呈剂量依赖性抑制OVCAR-3细胞增殖,抑制50%细胞生长的药物浓度(IC50)为2μmol/L.0.5～5μmol/L的As2O3作用7天,集落抑制率均在40%以上(P＜0.01).2μmol/L与5μmol/L的As2O3作用12 h后,细胞周期出现了G2/M期阻滞及亚二倍体凋亡峰,随着作用时间的延长,凋亡细胞随G2/M期细胞减少而逐渐增多.细胞形态学观察可见分裂期细胞及凋亡细胞明显增加.0.5～5μmol/L的As2O3均能下调bcl-2蛋白的表达.结论As2O3能够抑制卵巢癌OVCAR-3细胞的增殖,诱导M期阻滞及细胞凋亡.     

As2O3对人膀胱癌细胞凋亡和MDR1表达及细胞周期的影响

目的 :观察三氧化二砷 (As2 O3 )对人膀胱癌细胞株BIU 87的凋亡诱导作用及对多药耐药基因 (MDR1)蛋白表达、细胞周期的影响。方法 :采用四氮唑蓝 (MTT)法检测As2 O3 不同浓度、不同作用时间对BIU 87细胞的生长抑制率 ;流式细胞术(FCM )检测不同浓度As2 O3 作用 72h后细胞中与凋亡有关蛋白Fas、bcl 2及MDR1蛋白表达、细胞周期变化。结果 :As2 O3 可有效抑制BIU 87细胞的生长增殖 ,与浓度、时间相关 ,P <0 0 5 ;Fas、bcl 2的表达分别与浓度增高呈正、负相关 ,P <0 0 5 ,且二者随浓度增高呈负相关 ,P <0 0 5 ;MDR1蛋白表达与对照组相比As2 O3 1μmol/L作用后升高 ,P <0 0 5 ,2、5 μmol/L作用后降低 ,P <0 0 5 ;随As2 O3 浓度升高 ,细胞周期被阻滞在G0 /G1期。结论 :As2 O3 可有效抑制人膀胱癌细胞的生长增殖 ,诱导细胞凋亡及阻滞细胞周期可能起了重要作用     

三氧化二砷诱导K562细胞凋亡过程中Par-4及WT1基因表达的变化

 目的　探讨三氧化二砷（As2O3）诱导K562细胞凋亡过程中前列腺凋亡反应因子-4（Par-4）和WT1基因表达的变化。方法　用不同浓度As2O3（2～10 μmol／L）处理K562细胞24～72 h,MTT法测定细胞增生活力,流式细胞术检测细胞凋亡,采用荧光定量RT-PCR检测Par-4和WT1基因 mRNA表达变化,Western blotting检测Par-4和WT1蛋白表达的变化。结果　不同浓度As2O3作用于K562细胞,随浓度增加能明显抑制细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。同时Par-4基因mRNA和蛋白表达逐渐增加;而WT1基因mRNA及蛋白表达逐渐下降。结论　As2O3可抑制K562细胞生长,诱导细胞凋亡,Par-4与WT1基因可能参与As2O3诱导K562细胞凋亡的调控。     

砷剂诱导骨髓瘤细胞周期改变与SOCS-1基因去甲基化作用的研究

背景与目的:三氧化二砷(As2O3)在治疗多发性骨髓瘤中具有一定价值.有研究认为As2O3,的治疗作用可能与诱导细胞内抑癌基因去甲基化作用相关.本研究旨在探讨体外As2O3,诱导人骨髓瘤细胞周期改变与细胞内SOCS-1基因去甲基化之间可能存在的关系.方法:采用MTT法观察As2O3,对骨髓瘤细胞U266、RPM18226增殖情况的影响,流式细胞技术检测As2O3对骨髓瘤细胞周期的影响.甲基特异性PCR(MSP)法检测As2O3作用前后骨髓瘤细胞内SOCS-1基因甲基化状态的改变,实时PCR技术定量检测细胞用药前后SOCS-1基因mRNA的表达变化.结果:与对照组细胞相比,人骨髓瘤细胞U266、RPM18226在较大剂量As2O3(0.5umol/L、1.0 umol/L、2.0 umol/L)作用72 h后,细胞周期分布均发生G0/G1期阻滞,呈现G0/G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞周期改变与As2O3,剂量呈正相关(P均<0.05),骨髓瘤细胞内SOCS-1基因甲基化程度明显减弱(As2O3 0.5 umol/L作用72 h后)或消失(As2O3 1.0 umol/L或2.0 umol/L作用72 h后),SOCS-1基因在mRNA水平上表达明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05).结论:As2O3具有剂量依赖的诱导骨髓瘤细胞周期改变的作用,该作用可能与As2O3诱导SOCS-1基因去甲基化和SOCS-1基因再表达相关,这可能为进一步阐释As2O3,治疗多发性骨髓瘤中的可能机制提供新的思路和方向.     

三氧化二砷诱导尤文肉瘤细胞凋亡及对EWS-FLi1融合蛋白的影响

目的:探讨三氧化二砷(Arsenic trioxide,As2O3)诱导尤文肉瘤细胞凋亡及对融合蛋白EWS-FLi1表达的影响.方法:应用噻唑蓝(MTT)法、形态学观察、原位末端标记法(TUNEL)、流式细胞术(FCM)观察As2O3对体外生长的尤文肉瘤RD-ES细胞系生物行为的影响;应用半定量RT-PCR测定应用As2O3前后c-myc基因mRNA水平的变化;应用免疫细胞化学及固定化蛋白印迹法(Western blot)观察用药前后EWS-FLi1融合蛋白表达水平的变化.结果:As2O3对体外生长的RD-ES细胞系具有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡.c-myc基因mRNA表达水平和EWS-FLi1融合蛋白表达量随As2O3作用时间延长逐渐降低.结论:常规治疗浓度的As2O3对体外生长的尤文肉瘤细胞具有明显的杀伤作用,其作用机制与改变线粒体膜通透性和抑制EWS-Fli1融合蛋白、降低c-myc基因表达有关.     

As2O3对淋巴瘤Raji细胞抑制效应及其Id4基因表达的影响

目的:探讨As2O3对恶性淋巴瘤细胞的作用和对DNA结合抑制因子(Id4)基因表达的影响.方法:体外培养人Burkitt's淋巴瘤细胞株Raji细胞,设对照组和用不同浓度的As2O3作用不同时间处理Raji细胞的实验组.MTT比色法检测细胞生长;流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡并分析As2O3对细胞周期的影响.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测处理前后Id4 mRNA的表达情况.结果:实验组MTT比色实验结果表明,AsO3各浓度组作用于Raji细胞24、48及72 h后抑制率为12.15%～92.17%,P<0.05;流式细胞术检测细胞凋亡结果显示.实验组As2O3各浓度组作用于Raji细胞48 h后出现明显的凋亡峰,对照组未见凋亡峰或仅有低平的凋亡峰;细胞周期分析结果显示,实验组As2O3各浓度组作用于Raji细胞48 h后,As2O3可阻滞Raji细胞于G0/G1期,且随着As2O3浓度的增加,阻滞作用增强,呈一定剂量依赖关系.随药物浓度增加,Raji细胞中Id4基因mRNA的相对表达量逐渐增加,呈一定剂量依赖关系.结论:As2O3体外对Raji淋巴瘤细胞生长具有明显的抑制作用;As2O3能诱导Raji细胞凋亡,且使G0/G1期细胞比例增加,同时S及G2/M期细胞比例减少.随着As2O3浓度增加Id4基因出现表达.     

As2O3对人膀胱癌细胞凋亡和MDR1表达及细胞周期的影响

目的：观察三氧化二砷(As2O3)对人膀胱癌细胞株BIU-87的凋亡诱导作用及对多药耐药基因(MDR1)蛋白表达、细胞周期的影响。方法：采用四氮唑蓝(MTT)法检测As2O3不同浓度、不同作用时间对BIU-87细胞的生长抑制率；流式细胞术(FCM)检测不同浓度As2O3作用72h后细胞中与凋亡有关蛋白Fas、bcl-2及MDR1蛋白表达、细胞周期变化。结果：As2O3可有效抑制BIU-87细胞的生长增殖，与浓度、时间相关，P＜0．05；Fas、bcl-2的表达分别与浓度增高呈正、负相关，P＜0．05，且二者随浓度增高呈负相关，P＜0．05；MDR1蛋白表达与对照组相比As2O3 1 μmol／L作用后升高，P＜0．05，2、5 μmol／L作用后降低，P＜0．05；随As2O3浓度升高，细胞周期被阻滞在G0／G1期。结论：As2O3可有效抑制人膀胱癌细胞的生长增殖，诱导细胞凋亡及阻滞细胞周期可能起了重要作用。     

三氧化二砷诱导HL-60细胞凋亡过程中ROS、NF-kB和C-IAP2的变化

背景与目的:探讨As2O3(arsenic trioxide,ATO)对HL-60细胞凋亡过程中细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、NF-kB(nuclear factor kappa B).及GIAP2(cellular inhibitor of apoptosis proteins 2)的影响.材料与方法:以7.5 umol L As2O3单独应用及与500 umol L N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-Lcysteine,NAC)联合作用于HL-60细胞12、24 h后,流式细胞术检测HL-60细胞ROS的产生量;Western blot法检测NF-kB P65核蛋白的变化情况;半定量RT-PCR法检测C-IAP2的相对表达量.结果:7.5 umol L的As2O3作用HL-60细胞12、24 h后细胞内ROS的生成增加,与阴性对照比较,差异具有统计学意义(P<0.05).NF-kB P65核蛋白的相对含量分别为49.3%±4.4%和23.1%±2.1%,C-IAP2的相对表达分别为72.9%±5.8%和59.3%±4.4%,较对照组均明显降低(P<0.05).500 umol L NAC和7.5 umol L As2O3共同作用HL-60细胞12、24 h后细胞ROS生成量相对减少,与AS2O3单独作用组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);NF-kB P65核蛋白的相对含量分别为65.4%±4.9%和37.1%±3.4%,C-IAP2的相对表达量分别为81.1%±5.8%和73.7%±4.9%.较As2O3单独作用组均明显增加(P<0.05).结论:As2O3诱导HL-60细胞凋亡过程中,细胞内ROS生成增加,抑制NF-kB活性,同时下调其靶基因C-IAP2等的表达;NAC能阻断As2O3诱导HL-60细胞凋亡过程中ROS的生成,部分阻断了NF-kB活性的抑制.     

三氧化二砷联合5-杂氮-2′-脱氧胞苷对U937细胞SHP-1、JAK3、TYK2基因表达的影响

目的 探讨甲基化抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycytidine,5-aza-CdR）联合三氧化 二砷（As2O3）对白血病细胞株U937中JAK3、TYK2和造血细胞磷酸酶SHP-1表达水平的影响,并探讨它 们在白血病发病中的作用。方法 5-aza-CdR、As2O3单用及联合处理U937细胞,5-aza-CdR浓度为0.5、1、2 μmol/L,As2O3的浓度为1、2.5、5 μmol/L,As2O3 1μmol/L + 5-aza-CdR 0.5μmol/L、As2O32.5 μmol/L + 5-aza- CdR 1 μmol/L、As2O3 35 μmol/L + 5-aza-CdR 2 μmol/L 及不加药物组,分别处理24、48、72 h后提取细胞总 RNA,荧光实时定量PCR（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RQ-PCR）检测JAK3、TYK2 及SHP-1的表达。结果 As2O3和5-aza-CdR单独作用及两药合用时,SHP-1 mRNA在U937细胞中的表达呈 剂量及时间依赖性,其表达逐渐升高;JAK3 mRNA的表达呈剂量及时间依赖性,其表达逐渐降低;TYK2 mRNA的表达呈剂量及时间依赖性,其表达逐渐降低;SHP-1与JAK3、TYK2负相关,JAK3所受影响较 TYK2更为显著。结论 （1）甲基化抑制剂5-aza-CdR和As2O3可使SHP-1表达升高,JAK3、TYK2表达降 低,与浓度及作用时间有关。（2）SHP-1基因的重新表达与其发生去甲基化有关,对JAK/STAT通路有负调 控作用。     

A negative role of SHP-2 tyrosine phosphatase in growth factor-dependent hematopoietic cell survival

SHP-2 tyrosine phosphatase is highly expressed in hematopoietic cells; however, the function of SHP-2 in hematopoietic cell processes is not fully understood. Recent identification of SHP-2 mutations in childhood leukemia further emphasizes the importance of SHP-2 regulation in hematopoietic cells. We previously reported that SHP-2 played a positive role in IL-3-induced activation of Jak2 kinase in a catalytic-dependent manner. Interestingly, enforced expression of wild-type (WT) SHP-2 in Ba/F3 cells enhanced growth factor deprivation-induced apoptosis. Biochemical analyses revealed that although IL-3 activation of Jak2 kinase was increased, tyrosyl phosphorylation of its downstream substrate STAT5 was disproportionately decreased by the overexpression of SHP-2. Following IL-3 deprivation, the tyrosyl phosphorylation of STAT5 that is required for its antiapoptotic activity was rapidly diminished in SHP-2 overexpressing cells. As a result, reduction of the putative downstream targets of STAT5-Bcl-X(L) and pim-1 was accelerated by overexpression of SHP-2. Further investigation showed that SHP-2 associated with STAT5, and that it was indeed able to dephosphorylate STAT5. Finally, overexpression of SHP-2 in primary bone marrow hematopoietic progenitor cells compromised their differentiative and proliferative potential, and enhanced growth factor withdrawal-induced cell death. And, the effect of SHP-2 overexpression on growth factor-dependent survival was diminished in STAT5-deficient hematopoietic cells. Taken together, these results suggest that SHP-2 tyrosine phosphatase negatively regulates hematopoietic cell survival by dephosphorylation of STAT5.     

Macrophage-derived SHP-2 inhibits the metastasis of colorectal cancer via Tie2-PI3K signals

This research aimed to explore the influence of Src homology-2 containing protein tyrosine phosphatase (SHP- 2) on the functions of tyrosine kinase receptors with immunoglobulin and EGF homology domains 2 (Tie2)-expressing monocyte/macrophages (TEMs) and the influence of the angiopoietin(Ang)/Tie2-phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt)/mammalian target of rapamycin (mTOR) (Ang/Tie2-PI3K/Akt/mTOR) signaling pathway on the tumor microvascular remodeling in an immunosuppressive microenvironment. In vivo, SHP-2- deficient mice were used to construct colorectal cancer (CRC) liver metastasis models. SHP-2-deficient mice had significantly more metastatic cancer and inhibited nodules on the liver surface than wild-type mice, and the high-level expression of p-Tie2 was found in the liver tissue of the macrophages’ specific SHP-2-deficient mice (SHP-2MACKO) + planted tumor mice. Compared with the SHP-2 wild type mice (SHP-2WT) + planted tumor group, the SHP-2MAC-KO + planted tumor group experienced increased expression of p-Tie2, p-PI3K, p-Akt, p-mTOR, vascular endothelial growth factor (VEGF), cyclooxygenase-2 (COX-2), matrix metalloproteinase 2 (MMP2), and MMP9 in the liver tissue. TEMs selected by in vitro experiments were co-cultured with remodeling endothelial cells and tumor cells as carriers. It was found that when Angpt1/2 was used for stimulation, the SHP-2MAC-KO + Angpt1/2 group displayed evident increases in the expression of the Ang/Tie2-PI3K/Akt/mTOR pathway. The number of cells passing through the lower chamber and the basement membrane and the number of blood vessels formed by cells compared with the SHP-2WT + Angpt1/2 group, while these indexes were subjected to no changes under the simultaneous stimulation of Angpt1/2 + Neamine. To sum up, the conditional knockout of SHP-2 can activate the Ang/Tie2-PI3K/Akt/mTOR pathway in TEMs, thereby strengthening tumor micro angiogenesis in the microenvironment and facilitating CRC liver metastasis.     

砷诱导肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡机理研究

目的 研究三氧化二砷(As203)诱导肝母细胞瘤细胞系HePG2细胞凋亡的机理及其对细胞核基质相关蛋白——前髓白血病蛋白(PML)表达的影响。方法 Hep2细胞培养于MEM培养基中,用不同浓度As2O3分别处理24或96h。运用原位末端脱氧核苷转换酶(TdT)标记法(TUNEL)和DNA阶梯法检测细胞凋亡。以激光共振聚交显微镜及Western杂交观察PML的表达。结果 TUNEL阳性的凋亡细胞及DNA阶梯片段可见于As203处理组。用2μmol/L As203处理的Hep2细胞核基质蛋白内PML表达减弱。激光共振聚交图像显示,经2μmol/L As203处理的Hep2细胞核中,PML蛋白的表达明显减弱;用5μmol/L As203处理后,PML在Hep2细胞核中的微小点状表达几乎消失。结论 As203在体外可明显抑制Hep2细胞生长,其诱导HePG2细胞凋亡的作用依时间及剂量不同而异。As203可降解HepG2细胞核中PML蛋白,且PML的表达降低与细胞凋亡密切相关。核基质相关蛋白PML可能是As203作用的靶蛋白。     

p27Kip1在As2O3诱导白血病细胞凋亡中的作用机制

目的:研究三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)及转录生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对人HL-60细胞增殖的影响,并探讨相关信号通路.方法:流式细胞术检测细胞周期及凋亡,RT-PCR检测p27Kip1、TGF-β1、Cyclin E和Bcl-2表达,免疫组织化学方法和Western blot方法检测p27Kip1、TGF-β1、Cyclin E和Bcl-2蛋白水平.结果:As2O3、TGF-β1单药或联合处理均可诱导细胞凋亡,以联合处理组凋亡最明显,并且As2O3单药组及联合处理组细胞周期阻滞于G1期.As2O3单药及联合处理组可见p27Kip1、内源性TGF-β1表达上调,Cyclin E和Bcl-2表达下调,外源性TGF-β1处理组可见p27Kip1 mRNA及蛋白表达上调,内源性TGF-β1 mRNA表达上调,内源性TGF-β1蛋白水平与对照组比较无明显变化,Cyclin E和Bcl-2表达下调,联合处理组p27Kip1及内源性TGF-β1表达上调及Cyclin E和Bcl-2表达下调程度强于单药处理组.结论:As2O3诱导细胞凋亡的机制可能是通过上调TGF-β1,从而上调p27Kip1,拮抗Cyclin E和Bcl-2的作用,抑制细胞增殖,使细胞周期阻滞于G1期,从而诱导细胞发生凋亡,外源性TGF-β1通过上调内源性TGF-β1,从而上调p27Kip1,增强As2O3诱导细胞凋亡的作用.     

三氧化二砷的抗大肠癌作用及其机制

目的观察三氧化二砷(As2O3)对大肠癌LS-174T细胞生长及端粒酶活性的影响。方法As2O3作用于大肠癌LS-174T细胞和裸鼠移植瘤后,采用噻唑盐(MTT)比色法检测结肠癌细胞生长抑制情况,电镜检测细胞超微结构的改变,荧光染色观察细胞核形态变化,流式细胞术(FCM)检测As2O3对细胞周期的影响,聚合酶链反应-酶联免疫反应(PCR-ELISA)试剂盒检测细胞中端粒酶活性变化。结果MTT法显示,随着As2O3浓度的升高,LS-174T细胞存活率明显下降,IC50= 5.23μmol/L。As2O3作用于LS-174T细胞24 h即出现凋亡峰,凋亡细胞的数量随着作用时间增加而增加。As2O3对LS-174T细胞提取液端粒酶活性有一定的抑制作用,对癌细胞端粒酶活性抑制作用随作用时间的延长而加强。从实验动物瘤体积和瘤重两个指标分析,As2O3组与对照组相比具有明显的抑癌作用(P<0.05)。结论经体外、体内实验证实,As2O3对结肠癌LS-174T细胞生长和裸鼠移植瘤均有抑制作用,其抗癌机制可能与诱导细胞凋亡和抑制端粒酶活性有关。     

Role of the Grb2-associated binder 1/SHP-2 interaction in cell growth and transformation

Grb2-associated binder 1 (Gab1) is a docking protein that is tyrosine phosphorylated following the activation of multiple cytokine receptors and receptor tyrosine kinases. Its function then is to recruit and activate multiple signaling molecules. In our previous work, we showed that Gab1 enhances cell growth and induces the transformed phenotype in NIH3T3 cells downstream of the epidermal growth factor (EGF) receptor. In this report, we analyze how it produces these effects. Because SHP-2 is the major binding partner of Gab1, we mutated its binding site in the Gab1 cDNA (Gab1/DeltaSHP-2). This construct was stably overexpressed in NIH3T3 cells (3T3-Gab1/DeltaSHP-2) and in the wild-type Gab1 cDNA (3T3-Gab1) or an empty expression vector (3T3-CTR). Our findings show that after EGF stimulation, Gab1/DeltaSHP-2 has a higher level of tyrosine phosphorylation at early time points than Gab1. Gab1/DeltaSHP-2 recruits more phosphatidylinositol 3'-kinase than Gab1 after EGF triggering, which accounts for a higher and more sustained AKT activation in 3T3-Gab1/DeltaSHP-2 cells relative to 3T3-Gab1 fibroblasts. Moreover, 3T3-Gab1/DeltaSHP-2 cells demonstrate a higher level of extracellular-regulated kinase 1 activation at early time points of EGF stimulation. However, there was an unexpected decrease in c-fos promoter induction in 3T3-Gab1/DeltaSHP-2 cells when compared with 3T3-Gab1 cells. Additionally, the 3T3-Gab1/DeltaSHP-2 cells show a reversion of the transformed phenotype, including fewer morphologic changes, an increase in stress fiber cytoskeletal organization, and a decrease in cell proliferation and anchorage independent growth. These results reveal that the Gab1/SHP-2 interaction is essential for cell growth and transformation but that this must occur through a novel pathway that is independent of extracellular-regulated kinase or AKT. On the basis of its role in growth and transformation, the Gab1/SHP-2 interaction may become an attractive target for the pharmacologic intervention of malignant cell growth.