重组人ω-干扰素的制备及活性分析

目的：建立人ω-干扰素（hIFN-ω）的大肠杆菌表达系统，为人ω-干扰素的生产及临床应用奠定基础。方法：自抗凝血中提取人基因组DNA，PCR扩增人ω-干扰素成熟肽编码序列克隆入pGEM—T—easy载体，进一步构建表达型重组质粒pBV-IFN-ω，温度诱导表达，表达产物行SDS-PAGE及Western blot鉴定。溶解并复性包涵体，细胞病变抑制法测定表达产物的抗病毒活性。结果：DNA序列分析证实，重组质粒pBV-IFN-ω含有开放读码框架正确的人ω-干扰素成熟肽编码序列。SDSPAGE显示，诱导表达碎菌后的沉淀中有大小约为20kD的外源蛋白，Western blot证明此外源蛋白为重组人ω-干扰素，并经体外活性测定证实有良好的抗病毒活性。结论：成功地构建了人ω-干扰素（IFN-ω）的大肠杆菌表达系统，表达出具有抗病毒活性的重组人ω-干扰素。     

人生长分化因子-5完整成熟肽基因的克隆

目的：克隆人生长分化因子-5(hGDF-5)完整成熟肽基因。方法：根据Genbank中hGDF-5的序列化学合成两条引物，从人胎儿软骨组织提取总RNA，通过反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)得到hGDF-5完整成熟肽基因。将所得基因片段插入克隆载体pMD18-T并转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒，酶切鉴定并测序。结果：DNA琼脂糖凝胶电泳显示：PCR产物为一长约380bp的带，阳性克隆质粒经双酶切可切出约380bp的片段。全自动DNA测序表明与Genbank中的序列完全相符。结论：通过反转录聚合酶链式反应从人胎儿软骨组织中成功克隆出人GDF-5完整成熟肽基因，基因序列完全正确。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体的构建及序列分析

目的构建单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体,并对序列进行分析,为进行高抗原性的真核表达重组gD蛋白奠定基础.方法PCR扩增HSV1-gD成熟肽基因,将该段基因克隆于pGEM-T克隆载体,转化鉴定后,与巴斯德毕赤酵母表达载体(pPIC9K)酶切连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选测序确定构建了pPIC9K-gD的真核表达载体,对克隆的序列进行分析,预测表达产物的理化特性及抗原性.结果获得了重组的酵母表达载体pPIC9K-gD.测序结果证实为HSV1-gD成熟肽基因,序列分析其高度保守,预测蛋白分子量为40.52 ku,pI为7.67,包含完整成熟肽分值达1.7的多个抗原决定簇.结论成功构建了HSV1-gD成熟肽基因的毕赤酵母表达载体.     

人骨形态发生蛋白4成熟肽cDNA的克隆及测序

背景：研究表明骨形态发生蛋白4的骨诱导能力最强,但在组织中含量甚微。 目的：克隆人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。 方法：从人胎盘组织中提取信使核糖核酸,根据基因库人骨形态发生蛋白4基因序列合成两条引物,利用一步法反转录聚合酶链式反应技术扩增出人骨形态发生蛋白4成熟肽的基因序列,将聚合酶链反应扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5α进行克隆筛选鉴定及测序。 结果与结论：琼脂糖凝胶电泳检测反转录聚合酶链式反应产物及阳性克隆质粒经双酶切产物显示一长约370 bp的条带,脱氧核糖核酸测序结果与基因库中的序列相符。结果证实,利用反转录聚合酶链式反应技术可成功的从人胎盘组织中克隆出人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。     

趋化因子配体18重组成熟肽段的表达

目的 构建PET SUMO-CCL18原核表达质粒,并表达、纯化获得重组趋化因子配体18成熟肽段.方法 从人卵巢癌组织中克隆CCL18基因全长,继而扩增表达成熟蛋白质的核酸序列,连接入PET SUMO载体,重组阳性克隆转入感受态细胞BL21(DE3)中IPTG诱导表达,基质辅助激光解吸/电离质谱技术(MALDI-TOF)验证后以SUMO蛋白酶切除载体部分,纯化浓缩,MALDI-TOF鉴定表达结果.结果 测序分析证实,克隆入PET SUMO载体的CCL18序列与Genbank中报道序列完全一致,纯化后蛋白质谱鉴定与天然CCL18成熟蛋白序列一致.结论 成功构建了高表达CCL18蛋白的表达系统,得到重组CCL18成熟肽段,为进一步研究CCL18蛋白在卵巢癌中的作用提供实验基础.     

庚型肝炎病毒NS5区部分基因的表达及其在EIA中的初步应用

目的　在大肠杆菌中表达HGVNS5抗原 ,以建立HGV抗体血清学检测方法。方法　利用反转录PCR(RT PCR)法从人血浆中分离庚型肝炎病毒NS5部分基因 ,克隆到pRSETA载体 ,经酶切初步鉴定后进行DNA序列分析 ,结果表明克隆序列正确。以pPROEX 1为表达载体 ,转化DH5α ,诱导表达后进行SDS PAGE和Westernblot分析。结果　克隆的基因片段在大肠杆菌中表达出相对分子质量 (Mr)约 2 0× 10 3 的可溶性蛋白 ,其氨基端含有 6个组胺酸肽段 ,可经Ni NTA亲和层析纯化。免疫印迹分析表明 ,该表达产物可与HGV感染患者体内的HGV抗体特异性结合。结论　克隆了HGVNS5部分基因并获得初步表达 ,表达的HGVNS5蛋白具有特异抗体结合活性 ,为建立检测HGVNS5抗体的血清学方法奠定了基础     

血管形成抑制因子tumstatin45-132的基因克隆、表达和生物学活性

目的: 克隆人tumstatin全长编码区基因及编码tum statin45-132的基因, 在大肠杆菌中表达。方法: 采用RT PCR从人胚肾细胞系 293细胞中克隆人的tumstatin全长编码基因, 继以PCR扩增tumstatin45-132 (45 -132位氨基酸 )编码基因, PCR产物克隆到pBV220载体中, 测序证实后, 转化E.coliBL21, 于 42℃进行热诱导表达。用SDS -PAGE分析表达产物, 对重组蛋白纯化后用内皮细胞增殖试验测定其生物学活性。结果: RT- PCR扩增出tumstatin全长编码基因, 以PCR扩增出tumstatin45-132的编码基因, 经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致。以含有tumstatin45-132编码基因的表达载体转化E.coliBL21后, 可表达出相对分子质量(Mr)为 9 600的重组蛋白。表达产物的蛋白量占菌体蛋白量的 10%, 纯化后能抑制内皮细胞的增殖。结论: 成功克隆全长tumstatincDNA, 并在大肠杆菌中表达重组tumstatin45-132蛋白, 证实其具有抑制内皮细胞增殖的活性。     

人组蛋白H1基因的原核表达、纯化及其活性检测

目的:克隆人组蛋白H1全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化以及活性检测.方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人组蛋白H1全长编码区基因,将其克隆到pGEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达与纯化产物.结果:从人乳腺文库中扩增获得约650 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为52 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H1,激酶实验证明该蛋白活性良好.结论:成功获得了活性良好的重组蛋白GST-H1,为后续研究细胞周期蛋白调控奠定了实验基础.     

OPG与MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人骨保护素（OPG）成熟肽段编码区基因，并在大肠杆菌中表达。方法 采用RT－PCR法，扩增人OPG成熟肽段编码区cDNA，并克隆入原核表达载体pMAL-c2x中，转化BL21（DE3）PlysS大肠杆菌感受态细胞，经0.1mmol/L IPTG诱导后，收集菌体蛋白，进行SDS－PAGE及Western blot鉴定。结果 获得人OPG成熟肽段编码区cDNA，以构建的原核表达载体pMAL-OPG转化菌株后，可表达人OPG和麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白，相对分子质量（M）为85000。表达产物的蛋白量约为菌体总蛋白的13％。Western blot表明，融合蛋白能与抗人OPG多克隆抗体特异性结合。结论 获得人OPG成熟肽全长cDNA，并在大肠杆菌中以OPC－MBP融合蛋白的形式表达。     

可溶型人干细胞因子cDNA的克隆表达、复性与纯化

目的 :构建可溶型人干细胞因子 (hSCF)基因的表达载体。优化培养条件 ,实现hSCF基因在大肠杆菌中的高表达。方法 :利用PCR技术 ,以人淋巴结cDNA为模板扩增并克隆hSCF基因。用简并PCR对hSCF基因 5′端的序列进行修饰 ,以实现在大肠杆菌中的高效表达 ;用MTT比色法测定初步复性和纯化的hSCF蛋白的生物学活性。结果 :扩增并克隆了hSCF成熟肽cDNA。将其插入表达载体pBV2 2 0构建了hSCF基因的表达质粒 ,并在大肠菌中初步表达。表达量占总菌体的 2 0 %以上 ,优化培养条件后表达量可达到 4 0 %以上 ,表达产物为包涵体。将包涵体溶解在 8mol/L脲或 7mol/L盐酸胍中 ,用疏水色谱法进行复性并同时纯化 ,得到具有天然生物学活性的rhSCF蛋白。结论 :成功地克隆hSCF基因 ,并实现在原核系统中的高表达 ,所获表达菌株可用于生产以获得具有生物学活性的rhSCF蛋白产品。     

重组人可溶性B淋巴细胞激活因子的制备及活性分析

目的　制备具有功能活性的人TNF家族的B细胞激活因子 (BcellactivatingfactortotheTNFfamily ,BAFF)胞外区 134～ 2 85氨基酸残基段 ,为BAFF的深入研究创造条件。方法　提取人新鲜扁桃体组织总RNA ,经RT PCR扩增编码人BAFF胞外区 134～ 2 85氨基酸残基cDNA ,经序列测定后 ,构建于原核表达载体 pQE 80L并转化大肠杆菌DH5α ,经IPTG诱导表达及Ni2 NTA柱层析纯化目的蛋白 ,行SDS PAGE和Western印迹检测。最后经MTT法检测其增殖活性。结果　RT PCR扩增得到了 4 5 9bp的cDNA片段 ,序列分析与GenBank中报道的编码人BAFF13 4 2 85的cDNA序列一致 ,SDS PAGE及Western印迹证实表达蛋白确实为 6×His BAFF13 4 2 85融合蛋白并存在于包涵体中。活性检测证实其能明显刺激肿瘤细胞的增殖。结论　利用大肠杆菌可高效表达rhBAFF13 4 2 85,得到的纯化蛋白具有较高的生物学活性 ,为进一步的研究奠定了基础。     

人BDNF成熟肽基因克隆及序列分析(英文)

为研究人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗 Alzheimer病中的作用 ,本文作者等克隆了其成熟肽基因并进行了序列分析。提取健康成人末梢血白细胞基因组 DNA作为模板 ,应用 PCR技术扩增人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段 ,并将其插入 p GEM-T质粒。限制性内切酶鉴定重组质粒并进行序列测定和分析。与 Gen Bank提供的已知序列(M61181)比较 ,所克隆的人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段长 3 5 7bp,序列完全相同。人脑源性神经营养因子成熟肽基因的克隆 ,为其在原核细胞中的表达、抗体的制备及神经系统疾病的治疗奠定了基础     

人瘦素基因在胎盘中的分离鉴定及在大肠杆菌中的融合表达

目的 克隆人瘦素(leptin)基因,构建融合表达载体,实现在大肠杆菌中的高效表达.方法 从人胎盘中提取RNA,利用反转录聚合链式反应(RT-PCR),克隆到人的leptin基因编码序列,对该基因片段进行T载体克隆、酶切和PCR鉴定,并且对其进行序列分析.将leptin基因插入到原核表达载体PET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,并利用脱氧胆酸钠对表达蛋白进行纯化.结果 DNA序列分析表明,从胎盘中克隆的人leptin序列与文献报道的一致,酶切鉴定证实leptin基因正确地插入到了表达载体中,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳分析,人leptin基因在大肠杆菌中实现了高效融合表达,表达产物的分子量为20kD,经过纯化,得到了较纯的融合表达蛋白.结论 从人胎盘中成功克隆了leptin基因,构建了原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究leptin的生物学功能奠定基础.     

人LIGHT胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人LIGHT胞外段基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:从人外周血单核细胞来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR得到LIGHT胞外段基因,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果:RT-PCR扩增出了大小为543 bp 的LIGHT胞外段基因,经测序证明序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的蛋白.结论:成功地克隆了人LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

小鼠canstatin cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:从小鼠肝脏组织克隆canstatin cDNA并在大肠杆菌(E.coli)中表达, 为进一步研究其抗肿瘤血管生成活性奠定基础。方法: 用Trizol试剂提取小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin(m canstatin)的cDNA,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatin cDNA 定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中, 在大肠杆菌E.coli BL21中经IPTG诱导表达。结果:小鼠canstatin的cDNA长度为684bp,编码227个氨基酸,与已知的人canstatin的cDNA同源性为89%,氨基酸的同源性为96%。IPTG诱导原核表达载体pET30a(+)/m canstatin在大肠杆菌E.coli BL21中表达。结论: 首次成功克隆了小鼠canstatin的cDNA, 其原核表达载体pET30a(+)/m canstatin在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达,小鼠canstatin抗肿瘤血管生成活性有待进一步研究。     

杀菌/通透性增加蛋白N端片段在原核细胞中的表达及其临床应用的初步探讨

目的：构建编码杀菌，通透性增加蛋白(BPI)N端片段基因原核表达载体，并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法：采用RT-PCR技术，从人外周血中性粒细胞的总RNA中扩增BPI蛋白N端片段cDNA编码区基因，DNA序列分析鉴定；将测序证实的BPI蛋白N端片段编码区基因PCR产物直接克隆于原核表达载体pBAD／Thio-TOPO中，再次测序鉴定；通过在大肠杆菌中以L-阿拉伯糖进行诱导表达，然后以SDS-PAGE、Westerm blot对表达的重组蛋白进行分析。重组蛋白经初步纯化处理后，进行生物学活性检测。结果：RT-PCR扩增出一个835bp的DNA片段，DNA测序表明为所需目的基因。限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明，BPI蛋白N端片段正确克隆到大肠杆菌表达载体pBAD／Thio-TDPO中，SDS-PAGE和Wester blot结果表明在大肠杆菌中成功表达了BPI蛋白N端片段。对该蛋白进行初步活性测定显示其可与BPI单克隆抗体结合并具有杀灭耐药铜绿假单胞菌的活性。结论：成功构建了BPI蛋白N端片段编码区基因原核表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达，表达的重组蛋白具有一定的生物活性。     

人骨形成蛋白2基因克隆及真核表达载体的构建

在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因并获得真核表达载体。由人成骨瘤细胞中提取总RNA，利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA；将此基因片段重组到pGEM-T克隆载体中，转化到大肠杆菌DH5α后，蓝白斑筛选阳性克隆，利用限制性酶切、PCR扩增和核苷酸序列分析鉴定重组质粒；将pGEM-T克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体中，用限制性酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。结果表明：重组在两种质粒中的基因片段为人骨形成蛋白2基因全编码序列。克隆获得人骨形成蛋白2基因．并得到此基因的真核表达载体，为人骨形成蛋白2的表达打下了基础。