编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体.为进一步研究其蛋白功能提供工具.方法:穿梭质粒pAdTrack-CMV-PGC1α线性化后与骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183菌中完成同源重组,筛选并提取重组正确的腺病毒质粒,PacI线性化,脂质体转染293细胞包装出成熟的具有感染活力的腺病毒颗粒,TCID50法测定病毒滴度,Western bloting检测PGC1α蛋白在293细胞的表达.结果:测序及酶切鉴定表明目的基因正确插人穿梭质粒,读码框未发生移位.重组腺病毒扩增后滴度约3×1010TCID50/ml,能在293细胞中表达PGC1α蛋白.结论:利用细菌内同源重组的方法成功构建了编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体,并观察到其蛋白表达.     

Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶重组腺病毒载体的构建、鉴定及初步应用

目的：构建携带Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶（PKGII）基因的重组腺病毒载体,并以此初步研究PKGⅡ对增殖相关的MAPK信号转导的影响。方法：将PKGⅡcDNA片段自载体pRC／CMV-GKⅡ（wt）中切出,克隆至穿梭质粒pENTR1A,用ClonaseⅡ将pENTR—PKG11中的PKGⅡcDNA片段定向克隆到pAd／CMV／V5．DEST中构建pAd／CMV／V5-DEST—PKGⅡ（Ad—PKGⅡ）。重组质粒Ad—PKGⅡ用PacⅠ酶酶切,使其线性化,再用脂质体转染法转染HEK293A细胞进行包装和扩增,微量全细胞病变法检测病毒滴度,蛋白质印迹法检测重组腺病毒Ad—PKGⅡ感染细胞后PKGⅡ的表达以及MAPK通路关键成分胞外信号调节激酶（ERK）活性的变化。结果：重组腺病毒滴度达5×10^9 pfu／ml,蛋白质印迹法检测显示重组腺病毒感染CS54细胞后使其PKGⅡ表达明显增高;在BGC-823胃癌细胞株,PKGⅡ对EGF导致的ERK的激活有明显抑制作用。结论：成功构建了携带PKGⅡ基因的重组腺病毒,初步证明PKGⅡ对细胞增殖相关信号转导有抑制作用,为进一步研究PKGⅡ与肿瘤细胞发生发展的关系提供了基础。     

PML重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的：构建携带PML目的基因的重组腺病毒载体（Ad-pml）。方法：应用基因重组技术将PSG-CMV和PSG5-PML分别用EcoRI和BglII双酶切,构建PSG-PML载体。将质粒PSG-PML与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3共转染至293细胞,产生含PML基因的重组腺病毒（Ad-pml）,并经PCR及DNA测序鉴定。结果：经PCR反应可扩增出1767bp大小的片段,测序结果检测Ad-pml序列正确,通过免疫荧光反应证明病毒包装成功并且具有感染力。结论：成功构建了重组腺病毒载体（Ad-pml）,为研究肿瘤基因治疗提供了基础。     

小鼠HSP27基因腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的:为深入研究热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)的生理与病理功能,应用PAdEasy腺病毒载体系统构建带荧光蛋白的小鼠HSP27重组腺病毒,并进行鉴定.方法:采用基因技术,将目的基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,通过PCR、序列测定、酶切鉴定;利用PAdEasy系统进行重组,在293细胞中包装和扩增,然后体外感染小鼠精原母细胞,Westernblot检测HSP27蛋白表达.结果:测序和酶切鉴定重组腺病毒质粒构建正确;经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获高滴度重组腺病毒体外感染小鼠精原母细胞,并且可正确表达HSP27.结论:应用PAdEasy系统重组技术成功构建了小鼠HSP27带荧光蛋白腺病毒载体,并在小鼠精母细胞系进行体外有效表达,为进一步研究HSP27的功能奠定基础.     

携带野生型p53基因的重组腺病毒载体的构建

应用同源重组方法成功地构建了携带野生型Ｐ５３基因的复制缺陷型重组腺病毒，通过光镜电镜、酶切、ＰＣＲ共扩增等方法证实了构建载体的正确性，并使常规的同源重组方法进一步改进，简化了载体构建的操作程序，结果准确，成功率高。本结果可用于以腺病毒为载体进行肿瘤、心血管疾病等基因治疗的研究。     

hNET基因重组腺病毒载体构建和体外表达

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,用细菌内同源重组法构建含有人的去甲肾上腺素转运子(human neurotransmitter transporter,hNET)基因的腺病毒载体。方法利用限制性内切酶KpnⅠ XbaⅠ从pCMV5质粒中切下目的基因hNET,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,形成重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-hNET,PmeⅠ酶切线性化后,与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组体质粒Ad-hNET,PacⅠ酶切后用脂质体Lipofectamine2000转染HEK293细胞,包装成重组体腺病毒。采用PCR技术和Western Blotting对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有绿色荧光蛋白报告基因检测表达,经过扩增和纯化,测定病毒滴度。结果测序结果证明hNET序列的正确,PCR、PacⅠ酶切电泳和Western Blotting证实腺病毒重组质粒Ad-hNET构建成功。扩增纯化后测定重组病毒Ad-hNET的滴度为1.2×1010pfu/mL。结论成功构建了能表达hNET基因的重组腺病毒载体,为肿瘤的靶向治疗提供前期的研究工作。     

Nemo样激酶在肿瘤发生发展中的双重作用

Nemo样激酶(Nemo-like kinase,NLK)是一种进化上保守的促分裂原活化蛋白激酶类似的激酶,属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶超家族成员。NLK可以通过参与Wnt、Notch、FoxO等多条通路调节细胞增殖、分化、胚胎发育早期形态学变化和脊椎动物神经系统发育等生物过程。NLK还是肿瘤调控中的一个关键分子,在不同的肿瘤中起到不同的作用,在前列腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌中NLK可以抑制肿瘤的发生与发展,在肝癌、口腔鳞癌、胆管癌等肿瘤中却有着相反的作用。     

人生长终止特异性同源盒基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 生长终止特异性同源盒(growth arrest-specific homeobox,Gax)基因表达产物是核转录因子,主要存在于心血管系统中,对胚胎发育、细胞生长、分化和迁移等起基因调控作用,其表达异常与多种疾病相关.为深入研究Gax基因在临床疾病中的作用,文中构建表达了人Gax基因的重组腺病毒载体.方法 根据pEGFP-N1-Gax质粒的多克隆位点,用NheⅠ和Hind Ⅲ双酶切获得人Gax基因片段,连接至穿梭质粒pDC18-mCMV上,构建穿梭质粒pDC318-mCMV-Gax,然后与骨架质粒pPE3共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-Gax,反复感染293细胞扩增病毒后,氯化铯梯度离心纯化病毒,并测定病毒滴度.结果 穿梭质粒pDC318-mCMV-Gax经双酶切和测序证实构建成功;PCR鉴定人Gax基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为4.5×1010pfu/ml.结论 该研究成功构建了重组腺病毒载体Ad5-Gax,为进一步在体内外研究Gax基因参与多种疾病的发生发展提供了材料.     

PTG重组腺病毒过表达载体的构建

目的 构建及鉴定携带小鼠PTG基因(NM＿016854)的过表达重组腺病毒载体,为深入研究PTG的功能奠定基础。方法 化学合成小鼠PTG基因的编码序列,经聚合酶链式反应(PCR)扩增、酶切,后插入GV314载体(CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP),得到重组穿梭质粒pGV314-PTG;进一步BamHⅠ/AgeⅠ双酶切,产物交换入线性化表达载体pDC315,构建重组腺病毒Ad-PTG,将其转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,进行纯化及滴度检测,最后利用PCR、Western blot及测序验证重组腺病毒。结果 经PCR、Western blot及测序后,结果显示成功构建pGV314-CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-PTG过表达腺病毒载体(Ad-PTG),终点稀释法测得病毒滴度为4×10¹⁰ PFU/ml, Western blot和荧光定量PCR显示PTG的蛋白和mRNA表达水平显著升高。结论 成功构建携带小鼠PTG基因的重组过表达腺病毒载体,且能有效上调肝细胞中PTG基因的表达。     

Cx43和GFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建间隙连接蛋白43（Cx43）和绿色荧光蛋白（GFP）双基因共表达重组腺病毒载体。方法利用PCR方法从真核表达载体pcDNA3.0-Cx43扩增Cx43片断,利用DNA重组技术,将目的基因Cx43克隆至含有报告基因GFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV,然后在BJ5183细胞中将重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体pAd-Cx43-GFP,用PacⅠ单酶切鉴定重组载体;将pAd-Cx43-GFP转入293细胞中包装,荧光显微镜观察报告基因GFP的表达,Western blot方法检测293细胞中Cx43表达。结果（1）通过PCR方法从载体pcDNA3.0-Cx43扩增出单一条带,与Cx43片断大小相符;（2）重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后,电泳可见2个大小约为9、1kb条带,证明pAdTrack-Cx43构建成功;（3）同源重组产物pAd-Cx43-GFP经PacⅠ酶切后,电泳可观察到2个大小约为31、4kb左右条带,与预期结果相符,提示同源重组成功;（4）荧光显微镜下观察可见转染pAd-Cx43-GFP后293细胞在培养1-2d即有绿色荧光表达;（5）利用WesternBlot法检测到转染pAd-Cx43-GFP后293细胞中Cx43的表达较未转染组增强。结论Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体构建成功。     

人BMP-7基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建含有人骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对肾小管上皮细胞株(HKC)细胞的转染情况.方法 用基因工程技术将人BMP-7基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-BMP-7转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒Ad5-BMP-7,并在其中包装扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HKC细胞感染效率的检测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明BMP-7基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25 × 1010PFU/ml,对HKC有较强感染能力.结论 应用细胞内同源重组方法成功构建了含人BMP-7基因的重组腺病毒载体.     

人p16基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建含有人p16基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定.方法用基因工程技术将人p16基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,然后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞,并在其中包装扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果酶切鉴定及PCR结果证明p16基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6.1×1010pfu/ml,对人成纤维细胞有较强感染能力.结论应用细菌内同源重组方法成功构建了含人p16基因的重组腺病毒载体.     

小鼠Osf2／Cbfal基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况。方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012)pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体。     

Construction and Expression of Human PTEN Tumor Suppressor Gene Recombinant Adenovirus Vector

Phosphatase and tensin homologue deleted onchromosome10(PTEN)is a newtumor suppres-sor gene and possesses mutation in multiple kindsof tumors which include breast cancer[1].Teng[2]found the incidence for loss of heterozygosity(LOH)in breast cancer speci mens was48%(32/67),and the mutation and inactivation of PTENgene plays a central role in cell migration,growthandinvasion of breast cancer[3].This study ai ms atestablishing a kind of proliferative defective recom-binant adenovirus vector A…     

大鼠ZnT1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的利用GatewayTM技术构建含大鼠锌转运体1(ZnT1)基因重组腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达。方法采用化学合成的方法,合成ZnT1/RES/EGFP目的基因片段,通过PCR方法在基因片段两端加入attB重组位点,与含有attP重组位点的pDonr221供体载体BP反应形成入门载体pDown-ZnT1。将含有attL重组位点的入门载体与含有attR位点目的载体Ad/CMV/V5-DEST通过LR反应形成腺病毒表达载体pAd-ZnT1。酶切和测序鉴定后,由PacⅠ酶切线性化转染HEK293A细胞包装,提取病毒颗粒。采用终点稀释法测定重组腺病毒滴度;Western blotting技术分析目的蛋白表达情况。结果目的基因按正确的方向重组入克隆载体中,重组腺病毒表达载体在HEK293A细胞中包装成功,获得成熟的腺病毒颗粒,病毒滴度为1.6×108 pfu/L,在HEK293A细胞中高表达。结论该实验采用GatewayTM技术构建了含有大鼠ZnT1基因的重组腺病毒载体,为下一步研究该基因在脊髓神经细胞中的表达以及与BDNF/TrkB信号调节通路的关系奠定了基础。     

乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3．1-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV中,得到pAdTrack—CMV—HBx,将其PmeI酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd—HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad—HBx。结果、PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad—HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础。     

人IL-24基因重组腺病毒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建含有人IL-24基因的重组腺病毒载体,并转染肺腺癌细胞A549细胞观察其感染能力,为进一步的基因治疗奠定实验基础.方法采用基因工程技术将人IL-24基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞以包装并扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检定;最后采用免疫组化法对IL-24在A549中的表达进行检测.结果酶切和PCR结果证实IL-24基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.2×1010 pfu/ml,能够成功转染A549细胞并在其中进行表达.结论成功构建了有较强感染能力的含人IL-24基因的重组腺病毒载体.     

Rac1及其突变体重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠Rac1及其突变体Rac1Q61L、Rac1G12V、Rac1T17N腺病毒表达载体,并制备出病毒,为进一步研究Rac1在间充质干细胞（MSCs）迁移中的作用奠定基础。方法以pMD-19-T-Rac1、pMD-19-T-Rac1Q61L、pMD-19-T-Rac1G12V、pMD-19-T-Rac1T17N为模板,扩增Racl及其突变体Rac1Q61L、Rac1G12V、Rac1T17N,酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack-CMV上,PmeI线性化重组质粒pAdTrack-CMV-Rac1及其突变体重组质粒,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体,经PacI线性化后转染QBI-293A细胞包装病毒,收获腺病毒重组病毒子,检测病毒滴度并进行间充质干细胞病毒感染复数的鉴定。结果测序结果显示,Racl及其突变体Rac1Q61L、Rac1G12V、Rac1T17N序列正确,成功包装出重组病毒子后经2～3次扩增得到约为107pfu/ml高效价重组病毒子,感染间充质干细胞后发现150 MOI为最适病毒感染复数。结论成功构建了Racl及其突变体重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-Rac1、pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-Rac1Q61L、pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-Rac1G12V、pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-Rac1T17N,获得了Racl重组病毒子Ad-Rac1、Ad-Rac1Q61L、Ad-Rac1G12V、Ad-Rac1T17N。     

腺病毒穿梭质粒pAdCMVlacZ的构建及鉴定

目的 为了构建复制缺陷型腺病毒AdCMV—lacZ，我们首先构建了腺病毒穿梭质粒PAdCMVlacZ。方法 将含lacZ cDNA基因克隆到腺病毒穿梭质粒PAdCMV的Hind Ⅲ和Hind Ⅲ位点。结果 PAdCMVlacZ经双酶切鉴定图谱正确，在含诱导剂和X—gal的氨苄平板上显示蓝色菌落。结论 成功构建了pAdCMVlacZ。     

虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建表达虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为腺病毒中和抗体流行水平的定量检测奠定基础?方法:采用腺病毒表达系统(ViraPower Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体?首先利用PCR的方法扩增虫荧光色素酶基因使其具备特定的CACC接头,以连接?转化?提取质粒等方法克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆,经PCR及测序鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆rAd-Luci?表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒?经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测rAd-Luci载体是否能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并检测此酶蛋白的功能活性?结果:用PCR的方法扩增到具有CACC接头的虫荧光色素酶基因,其重组入门和腺病毒表达克隆经PCR和测序鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.8×1011 pfu/ml,此病毒能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并且具有较强的功能活性?结论:成功构建了虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为此重组载体用于腺病毒中和抗体的定量检测奠定基础?