肿瘤抑素41肽重组表达及活性研究

目的：构建肿瘤抑素41肽重组质粒,使其高效表达并纯化得到41肽,研究其抗肿瘤活性。方法人工设计并合成肿瘤抑素41肽基因序列,克隆到表达载体 pTYB21上,转化到大肠埃希菌 BL?21（DE3）中, IPTG诱导融合蛋白高效表达,几丁质亲和层析柱纯化后经Tricine?SDS?PAGE鉴定41肽。利用MTT法、吖啶橙／溴化乙锭（ AO／EB）荧光染色、小鼠H22腹水型转移型肝癌实体瘤模型抑瘤实验并结合组织病理切片来研究肿瘤抑素41肽的生物学活性。结果构建肿瘤抑素41肽重组质粒,获得可溶性肿瘤抑素41肽。体外实验显示,41肽具有抑制人脐静脉内皮 HUVEC 细胞、人胃癌 HGC?27细胞和人肝癌HepG2细胞增殖和促进HUVEC、 HGC?27细胞凋亡的作用。体内实验显示,41肽对小鼠H22腹水型转移肝癌实体瘤生长具有明显的抑制作用,抑瘤率达到34?35％。结论成功构建了pTYB21?41肽重组质粒,肿瘤抑素41肽具有显著的抗肿瘤活性,为肿瘤抑素机制研究和临床应用研究奠定了基础。     

肿瘤抑素30肽的重组表达及抗肿瘤活性研究

目的：重组表达肿瘤抑素30肽并研究其抗肿瘤活性。方法设计并合成30肽基因序列,将此序列与融合蛋白表达载体 PTYB21重组,转化到大肠埃希菌 BL-21(DE3)。 IPTG 诱导表达,几丁质柱纯化得到30肽,经 SDS-PAGE 及 Tricine-SDS-PAGE 对纯化产物进行鉴定。利用 MTT 法、吖啶橙/溴化乙锭(AO/ EB)荧光染色法、小鼠 H22腹水转移型肝癌实体瘤抑瘤实验,研究30肽的抗肿瘤活性。结果成功重组并表达肿瘤抑素30肽。体外实验显示,30肽具有抑制 HGC-27胃癌细胞、 HUVEC 人脐静脉细胞增殖和促进这两种细胞凋亡的作用。体内实验显示,30肽对小鼠 H22腹水型肝癌抑瘤率达43.18 ％ 。结论重组的肿瘤抑素30肽具有较强的抗肿瘤活性。     

人内皮抑素在大肠杆菌中的高效表达及活性研究

目的:表达人内皮抑素蛋白,制备多克隆抗体,检测其生物学活性。方法:采用PCR法扩增人内皮抑素基因,构建pGEX-ES融合表达载体,IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导表达。初步纯化的内皮抑素包含体蛋白制备兔多克隆抗体,Western-blot检测其在小鼠肝、肾等的表达。亲和纯化的内皮抑素蛋白用内皮细胞抑制实验检测其生物学活性。结果:诱导表达的人内皮抑素蛋白经凝血酶酶切后,分子量约为 20kD,具有抑制内皮细胞生长的活性。制备的多克隆抗体检测出内皮抑素在小鼠肝、肾等组织的表达。结论:人内皮抑素的成功表达及抗体制备为抗血管生成治疗实体瘤的研究及检测奠定实验基础.     

人内皮抑素抗肿瘤相关肽基因的克隆表达及活性研究

目的克隆并表达人内皮抑素抗肿瘤相关肽,检测其生物活性。方法人工合成人内皮抑素1~30位氨基酸(30肽,序列25~31由RGIRGAD改为RGDRGD)所对应的核苷酸序列,连接到质粒pTYB2中,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,几丁质亲和层析树脂一步纯化30肽。通过MTT法、鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验、小鼠体内抑瘤实验比较30肽和内皮抑素抗肿瘤活性。结果MTT证实30肽体外对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、胃癌7901细胞(SGC-7901)半数抑制浓度IC50为36μg/ml、47μg/ml,显著低于内皮抑素IC50179μg/ml、202μg/ml。CAM实验中30肽对血管的抑制作用更强。30肽在小鼠体内抑瘤率47.8%,效果优于内皮抑素28.7%。结论30肽具有更强抗肿瘤活性,有可能成为治疗肿瘤的一种新药物。     

突变型K5重组蛋白抑制小鼠肝癌血管生成和肿瘤生长的作用

目的：体内实验观察人纤溶酶原K5缺失突变体Ⅰ（K5 mut1）对HepA小鼠肝癌血管生成和肿瘤生长的影响。 方法:大肠杆菌中表达，组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得K5 mut1蛋白，SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定其表达；建立皮下种植肝癌小鼠模型，腹腔注射不同剂量K5 mut1重组蛋白，检测抑瘤率及肝癌组织微血管密度（MVD）。结果： SDS-PAGE及Western blotting鉴定获得K5 mut1纯化蛋白；K5 mut1剂量依赖性地抑制小鼠肝癌（HepA）实体瘤生长，不同剂量K5 mut1治疗组肝癌组织MVD低于对照组，并随K5 mut1用药剂量增加而降低。 结论： K5 mut1具有抑制小鼠肝癌生长的作用，抑制肿瘤血管生成可能是K5 mut1抑制肿瘤生长的主要机制。结果提示K5 mut1具有治疗肝癌的潜在临床价值。     

抗人整合素β3亚基单克隆抗体的制备及其抗肿瘤活性的研究

目的制备抗人整合素β3亚基的单克隆抗体(mAb),研究其对肿瘤治疗的作用。方法用RT-PCR方法扩增人β3胞膜外基因,将其克隆至原核表达载体pQE30中,获得含β3胞膜外基因的高效表达载体pQE30-β3,将其转化大肠杆菌M15,通过诱导表达及纯化,获得β3蛋白。将此蛋白免疫BALB/c小鼠,应用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗β3亚基mAb,Western blot鉴定mAb的特异性。通过小鼠体内抑制黑色素瘤生长实验筛选出具有抑制肿瘤生长作用的mAb。进一步用MTT法及流式细胞术观察该mAb体外抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及诱导其凋亡的作用。结果扩增获得了β3胞膜外基因,构建了β3蛋白的原核表达载体,表达纯化了β3蛋白,成功制备了8株mAb,Western blot证明了其特异性。经过体内抑瘤实验筛选出一株具有显著抑制肿瘤生长的mAb4F12。该mAb可抑制HUVEC细胞增殖并诱导其凋亡。结论成功表达了β3蛋白,并制备了有活性的mAb,抗体具有抑制肿瘤生长的作用,这可能是通过抑制血管内皮细胞的增殖和诱发凋亡实现的。     

抑瘤饮增加小鼠S180移植瘤巨噬细胞浸润及TNF-a和iNOS表达

目的 动态研究中药复方抑瘤饮对小鼠S180移植瘤内巨噬细胞(Mψ)浸润及TNF-a和iNOS表达的影响,揭示其体内抗瘤免疫机制.方法 Balb/c小鼠右腋皮下接种S180肿瘤细胞,24 h后,抑瘤饮组小鼠每日灌服抑瘤饮,对照组小鼠每日灌服等量凉开水.分别于第10、20、30天和第40天杀鼠取瘤制成切片,免疫组化染色法检测肿瘤组织内Mψ浸润及TNF-a和iNOS表达,以图像分析系统对染色结果进行测定.结果 所有4个时间点抑瘤饮组Mψ浸润均显著高于对照组;第10天时抑瘤饮组TNF-a和iNOS表达与对照组无差异,第20、30天和第40天时高于对照组.结论 抑瘤饮体内抗瘤作用可能与增加肿瘤组织中Mψ浸润及TNF-a和iNOS表达有关.     

重组人内皮抑素腺病毒抗肿瘤实验研究

目的肿瘤生长具有血管依赖性。内皮抑素为胶原X羧基末端裂解片段,是重要的内源性血管抑制因子。实验中利用重组人内皮抑素腺病毒(recombinanthumanendostatinadenorirus,Ad-hEndo)在肿瘤局部给药以探索其抗血管基因治疗的可行性。方法以Ad-hEndo感染体外培养肿瘤细胞,观察重组蛋白表达及其对培养的血管内皮细胞的抑制效应;在裸鼠A549肺癌模型中瘤内注射重组病毒,观察肿瘤抑制效应、剂量依从效应和毒副反应。结果不同感染复数的Ad-hEndo感染肿瘤细胞均表达重组内皮抑素蛋白,并能抑制血管内皮细胞的生长。动物实验中Ad-hEndo治疗组肿瘤体积及肺转移结节数明显低于对照组,且转移数与治疗剂量负相关。结论以腺病毒为载体的肿瘤局部血管基因治疗能抑制肿瘤新生血管形成进而有效抑制肿瘤生长和转移,其效应具有剂量依从性。     

人IL-17F融合蛋白在E.coli中表达及其生物学活性研究

目的：构建重组原核表达载体pCEX-5X-3／hIL-17F，使其在大肠杆菌中表达，获得GST-hIL-17F融合蛋白，并研究其生物学活性。方法：利用PCR法从自行构建的含hIL-17F基因的pUCm-T／hIL-17F载体中扩增其成熟肽基因序列，亚克隆于pGEX-SX-3中，构建原核表达载体pGEX-5X-3／hIL-17F，并在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达包涵体融合蛋白，经纯化后进行Western blot鉴定。MTT法分析GST-hIL-17F纯品蛋白对人脐静脉内皮细胞ECV304的生长抑制作用，EUSA法检测对ECV304内皮细胞表达IL-6、IFN-γ和TNF-α的生物学作用，并采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）法分析其对血管形成的影响。结果：GST-hIL-17F融合蛋白在大肠杆菌BL21中获得了高效表达，约占菌体总蛋白的55％，能产生约41kD的融合蛋白，且Western blot证实确为GST-hIL-17F目的蛋白。CST-ML-17F具有明显抑制ECV304内皮细胞增殖和上调表达IL-6的生物学效应，并具有显著的抗血管形成活性。结论：ML-17F重组原核表达和血管形成抑制效应的初步研究已获成功，为进一步研究rhIL-17F的抗血管形成机制和临床应用奠定了基础。     

重组内皮抑素联合靶向性preS2反义RNA对肝癌细胞的体内抑制作用

单纯抗血管生成治疗肿瘤 ,仅使肿瘤处于休眠状态 ,容易出现复发。如何将抗血管生成与其他肿瘤治疗方法有效结合 ,是目前肿瘤基因治疗中的研究热点。本研究首次提出重组内皮抑素联合靶向性preS2反义RNA抑制肝癌细胞的策略 ,并进行体内实验研究。构建肝癌细胞特异性HBVpreS2反义RNA表达载体 ,并将其与针对表皮生长因子受体(EGFR)的 16肽配体寡肽和流感病毒血凝素HA2 0寡肽混合 ,制备肝癌靶向性HBV反义RNA转移系统 ,即AFP增强型四元复合体。同时 ,以自行构建的毕赤酵母菌表达重组人内皮抑素蛋白 ,纯化后 ,进行动物实验。培养整合有…     

抗肝癌细胞噬菌体单链抗体库的构建及筛选

构建抗人肝癌细胞单链抗体库 ,从中筛选与肝癌细胞特异结合的高亲和力单链抗体。从HepG2细胞免疫的BALB/c小鼠脾脏提取总RNA ,RT PCR扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因 ,用 (Gly4Ser) 3 连接肽基因 ,经重叠延伸反应 ,在体外将VH 和VL 连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,构建噬菌体单链抗体库。以HepG2细胞为抗原对抗体库进行淘选 ,ELISA法鉴定各单克隆与肝癌细胞的结合活性 ,并对阳性克隆进行表达。成功构建了库容为 1 1× 10 6抗肝癌细胞的噬菌体单链抗体库 ,经筛选得到了与HepG2细胞具有较强结合能力的单链抗体 ,实现了scFv在大肠杆菌中的可溶性表达。序列测定结果表明 ,VH 和VL 基因符合小鼠抗体可变区特征 ,scFv基因拼接正确     

葡萄球菌肠毒素O表达及其生物学活性的初步分析

目的 克隆葡萄球菌肠毒素O(seo)基因,构建其两种原核表达载体,表达、纯化重组蛋白SEO,并对其生物活性进行初步研究.方法 设计引物PCR获得seo成熟肽基因,将其分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1、pET28a,转化E coli BL21、E coli BL21(DE3),重组蛋白分别经GST亲和层析、镍螫合层析纯化,利用Western blot验证重组SEO的免疫原性,MTT法测定重组SEO对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用,Caspase 3酶活及DNA电泳分析重组SEO诱导细胞凋亡的能力.结果 克降的seo基因序列与报道的序列完全相同.纯化获得重组蛋白GST-SEO和P28-SEO的表达量分别占菌体蛋白的25%和22%.免疫印迹表明两种蛋白均具有良好的免疫原性.生物活性检测表明,低剂量的肠毒素对小鼠脾淋巴细胞有刺激增殖作用,较高剂昔则会导致细胞凋亡.结论 两种重组的SEO仍具有超抗原的活性,对小鼠脾淋巴细胞具有诱导凋亡的能力.     

人内皮抑素基因改造、表达、纯化及活性检测

目的克隆诱变的人内皮抑素(human endostatin,hES)氨基端基因,并检测其活性。方法双酶切已诱变的人内皮抑素基因,电泳回收氨基端片段,与质粒pTYB-2重组,转化E．coli BL-21(DE3)。通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验,MTT实验,HE染色及流式细胞术检测重组小分子人内皮抑素对新生血管生成、细胞增殖和细胞凋亡的影响。结果基因重组小分子内皮抑素对鸡胚尿囊膜新生血管生成具有明显的抑制作用;对脐静脉内皮细胞和肝癌细胞增殖的抑制存在量效关系;作用24h后,观察到细胞凋亡现象;与对照组相比,细胞凋亡数增加。结论成功构建了人内皮抑素氨基端基因工程菌,得到了具有生物活性的氨基端小分子内皮抑素,为便利临床应用奠定了基础。     

TAT-HBX-EGFP融合蛋白的表达、纯化及在小鼠肝脏内的跨膜分布

目的 高效表达TAT-HBX-EGFP融合蛋白,研究其在小鼠肝脏内的分布.方法 构建TAT-HBX-EGFP重组载体,IPTG诱导使其在BL21中大量表达;蛋白经Ni柱纯化后注射入小鼠体内,免疫荧光观察TAT-HBX-EGFP融合蛋白在小鼠肝脏的分布.结果 TAT-HBX-EGFP在大肠埃希菌中获得高效表达;HBX蛋白可以在TAT的引导下进入小鼠肝脏.结论 TAT引导肽可以将HBX蛋白引导至小鼠肝脏.     

CEA 迷你基因串联体疫苗免疫小鼠脾细胞对CEA 阳性肿瘤细胞的杀伤作用及疫苗的安全性评价

目的:观察CEA 迷你基因串联体疫苗pcDNA-triCEA625-667 免疫小鼠脾细胞对肿瘤细胞特异性杀伤作用并对疫苗免疫小鼠后的安全性进行评估。方法: BALB/ c 小鼠随机分为空白载体组(pcDNA3.0)、单倍体疫苗实验组(pcDNA-CEA625-667 )、串联体疫苗实验组(pcDNA-triCEA625-667 ),肌肉注射法免疫动物,每隔10 d 免疫1 次,共免疫4 次,记录免疫小鼠的体重变化、存活情况以及检测血清ALT、肌酐水平。以疫苗免疫小鼠的脾细胞为效应细胞,以LDH 释放法检测其对CEA 阳性的小鼠肝癌细胞株(H22-CEA+ )、胃癌细胞株(MFC-CEA+ )、结肠癌细胞株(CT26-CEA+ )以及CEA 阴性小鼠肝癌细胞株(H22-CEA- )的特异性CTL 的杀伤活性。结果:两种疫苗对CEA 阳性的肝癌、胃癌及结肠癌细胞均具有较强的杀伤活性,与PcDNA3.0 空载体组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。而对CEA 阴性肿瘤细胞(H22-CEA- )则几乎无影响。迷你串联体基因疫苗pcDNA-triCEA625-667 对肝癌细胞H22-CEA+及胃癌细胞MFC-CEA+的杀伤活性强于单倍体基因疫苗pcDNA-CEA625-667(P<0.05)。疫苗免疫对小鼠的存活状态、体重变化及肝肾功能指标均无影响。结论:CEA 迷你基因疫苗安全有效,能够诱导肿瘤特异性CTL 产生,且三倍体串联体疫苗免疫效果优于单倍体疫苗。     

鸡tie-2受体胞外片段重组蛋白的制备及其抗血管生成作用的研究

目的　设法调控血管的生长发育 ,从而达到治疗疾病的目的。方法　用 PCR方法从既往构建含鸡 tie- 2受体胞外段基因的表达质粒中扩增目的片段 ,构建 p QE质粒原核表达载体并诱导目的蛋白的表达 ;将目的蛋白进一步纯化、复性并免疫小鼠 ,获得抗血清 ,用 EL ISA和 Western印迹检测抗血清中抗体的存在 ;分离纯化抗体 ,用流式细胞仪体外观察其对血管内皮细胞生长情况的影响用体内藻酸盐包裹肿瘤细胞实验和肿瘤内微血管 CD31免疫组化观察其对血管生成情况的影响。结果　经酶切分析及测序鉴定表明获得了鸡 tie- 2受体胞外目的片段的p QE原核表达载体 ,且高效表达目的蛋白 ,其免疫小鼠可产生抗重组蛋白的抗体 ;体外细胞培养结果显示免疫后产生的抗体明显的诱导血管内皮细胞凋亡 ;藻酸盐包裹实验表明此抗体能显著降低肿瘤新生血管的形成 ;CD31微血管计数显示此抗体能明显减少肿瘤内微血管数。结论　用原核表达的方法成功制备了鸡 tie- 2受体胞外片段 (配体结构域 )的蛋白疫苗 ,且此疫苗能明显产生抗血管生成作用。     

人可溶性B淋巴细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:钓取人B细胞刺激因子基因,构建其表达的大肠杆菌工程菌,并体外表达、纯化可溶性B细胞刺激因子方法:从人外周血单个核细胞(PBMC)中提取总RNA并逆转录得到cDNA,用PCR扩增目的基因,连接到原核生物表达载体pET-30a上。制备质粒后,酶切、进行菌落PCR及DN测序对其进行鉴定。然后转化大肠杆菌BL21(DE3)并表达对纯化的目的蛋白进行肽质量指纹分析、鉴定,并进一步做体外B细胞刺激试验。结果:RT-PCR钓取出可溶性B细胞刺激因子基因片段。DNA测序结果与报道序列完全一致。在IPTG诱导下,目的基因在工程菌中表达。利用镍金属螯合琼脂糖凝胶亲和层析柱分离。纯化目的蛋白的肽质量指纹图经Mascot搜索与B细胞刺激因子吻合。纯化的蛋白在体外可刺激B细胞增殖。结论:成功地克隆可溶性B细胞刺激因子基因,表达的纯化目的蛋白是具有生物学活性的B细胞刺激因子。     

电穿孔法转染GFP标记H22和S180的实验研究

采用电转染法将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入小鼠肝癌H22和肉瘤S180细胞,通过G418筛选,建立了稳定表达该蛋白的小鼠肝癌H22细胞株和肉瘤S180细胞株;光镜和电镜观察其细胞形态、超微结构及生长状况没有发生显著改变;建立相应的皮下和腹腔荷瘤动物模型,观察到其皮下和腹腔成瘤时间与腹腔荷瘤生存时间无显著改变(P＞0.05),在活体荧光成像系统能观察到其荷瘤部位荧光.期望利用gfpH22和gfpS180阳性细胞株,运用免疫荧光技术、活体荧光成像系统和激光共聚焦系统对肿瘤进行体内外直观、可视和半定量的深入研究.     

人NT-proBNP的克隆及原核表达

目的：克隆人氨基末端脑钠肽（amino—terminal pro—brain natriuretic peptide,NT—proBNP）基因,构建原核表达载体并纯化表达产物。方法：采用PCR从正常成人cDNA中扩增NT—proBNP基因,将其克隆至pGEM—T中,测定其核苷酸序列。然后构建原核表达载体pGXE4T-2-NT-proBNP,用IPTG诱导表达,GSH—agarose亲和纯化蛋白。结果：经PCR扩增获得NT—proBNP基因,测序正确,在大肠杆菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的20％,用SDS—PAGE和Western blot鉴定,显示其相对分子量34600。经亲和纯化后的GST—NT—proBNP的纯度可以达到96％,得率为1．8mg／100ml。结论：NT—proBNP的纯化成功,为建立NT—proBNP检测方法奠定了基础。