比较不同浓度CFSE荧光标记脐血细胞后存活率的实验研究

目的比较使用CFSE作为荧光标记物标记脐血细胞后各组细胞存活率的实验研究。方法使用5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L浓度的CFSE工作液对脐血细胞进行标记并计算每组细胞的细胞存活率,进行统计分析。结果 6组不同CFSE终浓度之间的细胞存活率存在显著性差异(P<0.05),且随着CFSE终浓度的增加,细胞存活率有一定程度的下降。不同时间之间的细胞存活率存在显著差异(P<0.01),随着时间的推移,细胞存活率不断下降,且时间差异要比浓度之间的差异显著。结论 CFSE标记的脐血细胞随培养时间延长存活率下降,而浓度对细胞存活率影响较时间小。     

荧光染料CFSE差异浓度标记活细胞体内示踪方法

背景:利用荧光染料标记活细胞体内示踪的方法较多,但是应用荧光染料浓度差异实现不同细胞体内示踪的方法目前仍不成熟.目的:观察不同浓度荧光活性染料CFSE标记的小鼠脾细胞体内示踪情况,建立稳定的单染料差异浓度标记活细胞的体内示踪方法.方法:取C57BL/6J及BALB/c小鼠脾脏制备脾细胞单细胞悬液,分别用不同浓度CFSE染色后制备1:1混合细胞悬液;锥虫蓝染色鉴定细胞活性:将染色的混合细胞输注BALB/c小鼠后不同时间点,流式细胞仪检测小鼠外周血两种荧光细胞的比例.结果与结论:CFSE标记的小鼠脾细胞活力良好,荧光显微镜下见全部细胞标记后均发绿色荧光,形态正常,CFSE标记阳性率为95%.CFSE染色时,在浓度相差20倍时流式直方图才显示为两个完全独立的峰,即CFSE低浓度用0.3 μmol/L,高浓度用6 μmol/L.异基因的C57BL/6J脾细胞在输注1 d后就快速消失,而同基因BALB/c脾细胞能够在BALB/c小鼠外周血中长期存在,但是两种细胞荧光强度均未见降低,说明荧光染料CFSE差异浓度标记活细胞进行体内示踪是一种稳定的示踪方法.     

牛垂体提取物、碱性成纤维细胞生长因子及Forskolin影响嗅鞘细胞增殖的量效关系

背景: 生长因子参与调节嗅鞘细胞增殖、分化及代谢功能,因此有望通过应用其合理的序贯刺激形式,达到细胞数量地大量扩增.目的: 观察牛垂体提取物、碱性成纤维细胞生长因子及Forskolin对嗅鞘细胞增殖的影响及剂量-效应关系.方法: 采用原代培养技术,从新生大鼠的嗅球分离培养嗅鞘细胞,并用差速贴壁+化学药物+胰酶快速消化法纯化培养嗅鞘细胞,添加牛垂体提取物、碱性成纤维细胞生长因子及Forskolin 3种促增殖因子及其组合.MTT法检测各组嗅鞘细胞生长的情况.根据NGFRp75抗体的免疫细胞化学染色统计嗅鞘细胞的纯度和计算嗅鞘细胞的增殖率.结果与结论: 在嗅鞘细胞原代培养和纯化后,添加牛垂体提取物具有促进嗅鞘细胞增殖的效应,但未见典型的剂量-效应关系;添加碱性成纤维细胞生长因子具有促进嗅鞘细胞增殖的效应,且呈现典型的剂量-效应关系;添加Forskolin并不具有促进嗅鞘细胞增殖的效应.说明合理应用不同质量浓度的碱性成纤维细胞生长因子与Forskolin进行联合刺激,能有效促进细胞的增殖.结果表明序贯的使用合适浓度的生长因子组合,将是有效促进嗅鞘细胞增殖的合理策略,有助于解决脊髓损伤治疗中种子细胞来源不足这一问题.     

基于CFSE染色的小鼠淋巴细胞体内示踪方法的建立

目的确定CFSE标记小鼠淋巴细胞的条件,建立简单快速、稳定可行的淋巴细胞体内示踪方法。方法利用流式细胞术分别检测不同浓度CFSE、不同悬浮溶液(1640培养基、PBS溶液)对小鼠淋巴细胞标记效果的影响,确定合适的标记条件;输注同品系CFSE标记的小鼠淋巴细胞,于不同时间点检测受鼠主要脏器内CFSE+细胞在淋巴细胞中的比例,并确定供鼠细胞的注射剂量;按照合适的注射剂量分别在注射后不同时间点测定供鼠细胞在受鼠体内的分布,考察本方法的稳定性及阳性信号的持续时间。结果 PBS组CFSE+细胞平均荧光强度分别为596、793、1123、1596、1737,明显高于1640培养基组(P<0.05);1640培养基组CFSE+细胞死亡率分别为8.7%、8.4%、8.6%、9.0%(P>0.05),而PBS组CFSE+细胞死亡率随着CFSE终浓度的上升而增加(P<0.05);按照不同剂量输注同品系淋巴细胞24h后,在受鼠各组织中检测到CFSE+细胞;每只小鼠尾静脉注射5×106个CFSE+淋巴细胞后,到d63仍可在组织中检测到阳性信号细胞。结论以PBS作为孵育液、CFSE终浓度选择10μmol/L对小鼠淋巴细胞标记、注射剂量为细胞5×106个/只,可使CFSE+细胞信号在同系小鼠体内持续2个月。     

嗅鞘细胞移植促进脊髓损伤修复的长期实验和临床观察

目的:嗅鞘细胞在大鼠完全损伤脊髓内长期存活和修复作用的研究以及嗅鞘细胞移植治疗人类脊髓损伤的观察。方法:解放军北京军区总医院全军骨科中心实验室用新生Wistar大鼠嗅球做嗅鞘细胞原代纯化培养,大量增殖后植入完全损伤的大鼠脊髓内,同时设立注入DMEM培养液和单纯椎板切除的对照组。术前及术后2,4,8,16和24周进行动物神经功能评定BBB评分();术后24周取损伤段及其邻近脊髓标本,行苏木精-伊红染色、嗜银染色,及透射电镜观察了解脊髓再生情况;同时荧光显微镜下观察Hoechst标记的嗅鞘细胞在体内存活情况。选择解放军北京军区总医院2003-06/12住院的脊髓损伤患者进行嗅鞘细胞移植,术后随访。结果:①手术后4周,嗅鞘细胞移植组,DMEM注射组开始有运动功能恢复,嗅鞘细胞移植组运动功能好于DMEM注射组(P<0.01);在各个时间段BBB分值嗅鞘细胞移植组均高于DMEM注射组(P<0.01)。②苏木精-伊红及嗜银染色显示,嗅鞘细胞移植组,DMEM注射组脊髓损伤区及其近端都有神经纤维,排列紊乱,嗅鞘细胞移植组数量多于DMEM注射组P<0.01),但都少于相应节段的对照组P<0.01)。③((24周后荧光显微镜下观察到Hoechst标记的嗅鞘细胞仍存在于OEG移植组脊髓损伤段周围。④透射电镜结果见嗅鞘细胞移植组胶质瘢痕近端大量新生有髓神经纤维并     

肉苁蓉总苷对大鼠嗅鞘细胞及其分泌神经营养因子的影响

目的:研究不同浓度肉苁蓉总苷对体外培养大鼠嗅鞘细胞及其分泌神经营养因子水平的影响。方法:采用MTT测定法和流式细胞计测定法检测肉苁蓉总苷对嗅鞘细胞(OECs)增值的影响;用ELISA法测定OECs分泌胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的含量。结果:MTT测定结果显示10μg/ml和100μg/ml浓度肉苁蓉总苷能明显促进OECs增殖;流式细胞计测定结果表明肉苁蓉总苷能促进嗅鞘细胞G1周期的增殖,并能减少嗅鞘细胞凋亡数量;ELISA测定结果表明100μg/ml浓度肉苁蓉总苷能对OECs分泌GDNF有显著的促进作用。结论:肉苁蓉总苷能促进OECs增殖,并能有效促进其GDNF的分泌。     

荧光染色技术检测细胞杀伤能力

目的:用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酶(CFSE)及碘化丙锭(propidium iodide,PI)两种荧光染料标记方法检测小鼠脾细胞杀伤能力,并探讨其应用价值。方法:采用CFSE标记靶细胞,PI标记被杀伤细胞,并通过直接杀伤实验和双向杀伤实验验证方法可行性。分离各组C57BL/6小鼠脾细胞作为攻击细胞,Balb/c小鼠脾细胞经5μmol/LCFSE染色后作为靶细胞。将攻击细胞与靶细胞按20∶1的比例混合,培养6h后用PI染色10min,经流式细胞术分析。比较Balb/c小鼠脾细胞致敏C57BL/6小鼠组(免疫组)和地塞米松处理组的脾细胞杀伤能力。结果:CFSE及PI两种荧光染色细胞可以在流式细胞仪上明显区分。CFSE和PI双阳性细胞是被杀伤的靶细胞。免疫组与地塞米松处理组的杀伤能力差异存在显著性(P<0.05)。结论:CFSE与PI两种荧光染料染色的杀伤实验方法操作简单、方便,有良好的应用价值。     

体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法：差速贴壁＋阿糖胞苷＋胰酶法

目的:通过细胞形态学观察及生物学特性鉴定,建立一种经济实用的体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法。方法:实验于2006-06在武汉理工大学完成。①阿糖胞苷(Sigma,批号w10562);胎牛血清(杭州四季青产品);胰蛋白酶(Amresco);多聚赖氨酸(Sigma);胶质纤维酸性蛋白,神经生长因子受体蛋白抗体(博士德)。②选取出生3d内的Wistar大鼠5只,乙醇浸泡后断头处死,取嗅球的最外两层,通过1.25g/L胰蛋白酶消化分离嗅鞘细胞,体外原代培养。③采用Nash差速贴壁 阿糖胞苷 胰酶法纯化嗅鞘细胞。培养18h后将未贴壁的细胞悬液转种于另一未涂层的器皿中,再培养36h,重复上述步骤移入0.1g/L多聚赖氨酸包被的塑料培养瓶中进行培养,纯化后的细胞在24h内陆续贴壁,常规培养2d,加入终浓度为2mg/L的阿糖胞苷,作用48h后,换上新的培养基,继续培养1d,弃去培养基,用无钙镁的Hanks液清洗2次,然后用1.25g/L的胰酶消化10min,待细胞突起回缩、胞体变圆时,立刻加入纯血清终止,其血清终浓度为20%,制备单细胞悬液。④倒置显微镜下观察其形态变化,苏木精-伊红染色,同时行神经生长因子受体蛋白和胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定嗅鞘细胞,并计算嗅鞘细胞阳性百分率。结果:①活细胞形态观察:分离培养的嗅鞘细胞具有双极或多极突起,且突起细长,相互交织。②嗅鞘细胞的苏木精-伊红染色鉴定:细胞呈三角形或梭形,有长的突起,胞浆被染成粉红色,胞核呈蓝紫色,胞核内深染的为核仁,有1～3个核仁。③嗅鞘细胞的胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定:细胞呈现棕黄色,胞核淡染,阳性细胞成网状连接,胞体多为三角形,有细长突起,阳性率91.5%。④嗅鞘细胞的P75免疫组化染色鉴定:阳性细胞呈绿色,多数细胞染色阳性,阳性率89%。结论:实验所采用的Nash差速贴壁 阿糖胞苷 胰酶法分离纯化培养嗅鞘细胞切实可行,为神经诱导修复材料的研究提供种子细胞。     

嗅鞘细胞与神经干细胞共培养后增殖及向神经元的分化

背景: 影响神经干细胞增殖分化的外在因素包括细胞因子和微环境,嗅鞘细胞能分泌多种细胞因子,与神经干细胞共培养时改变其微环境.目的: 观察不同浓度嗅鞘细胞对神经干细胞增殖及分化的影响.方法: 体外分别培养Wistar大鼠神经干细胞和嗅鞘细胞,5×107L-1神经干细胞分别和1×107L-1,1 ×109L-1,1×1011L-1嗅鞘细胞共培养,同时设立正常对照组,不加嗅鞘细胞.倒置荧光显微镜下观察神经干细胞增殖情况,诱导7 d后行NSE免疫细胞化学染色,计算阳性细胞,细胞总数得出阳性细胞百分比.结果与结论: ①3种浓度嗅鞘细胞与神经干细胞共培养3 d后,均促进了神经干细胞增殖,以1×109L-1嗅鞘细胞共培养组作用最显著,明显优于1×107L-1嗅鞘细胞组、1×1011L-1嗅鞘细胞组.②神经干细胞与1×109L-1嗅鞘细胞共培养7 d后,神经干细胞分化为神经元样细胞的百分比最高,与正常对照组相比差异有显著性意义(P<0.01).     

改良Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法体外分离培养大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞

背景:目前常用的嗅鞘细胞培养方法有差速贴壁法、化学抑制法、抗体亲和吸附法、补体法等,各自均存在优缺点,单一使用某种方法时细胞纯化率较低.目的:拟采用改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法体外分离纯化大鼠嗅球及嗅黏膜来源的嗅鞘细胞.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察.于2007-11/2008-05在武汉大学人民医院骨科实验室和消化内科实验室完成.材料:10周龄Sprague-Dauley大鼠10只,由武汉大学人民医院实验动物中心提供,阿糖胞苷由武汉大学人民医院制备.方法:完整取大鼠双侧嗅球及剪取鼻中隔后1/3嗅黏膜,剪碎后胰酶消化,制成单细胞悬液,按1×109L-1密度接种于末包被的25 cm2玻璃培养瓶中,18～20 h后将细胞悬液转移至另一未包被的25 cm2玻璃培养瓶中(第1次差速贴壁),24 h后再将细胞悬液转移至经多聚右旋赖氨酸包被的25 cm2塑料培养瓶或经多聚右旋赖氨酸包被的6孔培养板中(第2次差速贴壁),接种培养48 h后半量换液以去除杂细胞.在差速贴壁培养后二三天,加入3.0～5.0 pmol/L阿糖胞苷去除残余成纤维细胞.主要观察指标:嗅鞘细胞的形态观察、分裂增殖情况、免疫荧光染色鉴定结果及纯度测定.结果:体外培养24 h嗅球源性嗅鞘细胞即可贴壁,而嗅黏膜源性嗅鞘细胞多在培养四五天后贴壁,两种来源的嗅鞘细胞形态相似,以双极或梭形细胞为主,少量为3极及多突起形多级细胞,同时夹杂扁平、煎鸡蛋形细胞.纯化培养10 d的嗅鞘细胞,胶质纤维酸性蛋白、神经生长因子受体p75免疫荧光染色及神经生长因子受体p75+hoechs免疫荧光双染后大部分双极或多极细胞膜、胞体、突起呈阳性,细胞纯度可达90%以上.结论:改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法可在体外成功分离培养出高纯度的嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞,嗅球源性嗅鞘细胞贴壁时间及分裂增殖程度优于嗅黏膜源性嗅鞘细胞.     

SPIO标记浓度对BMSCs生物学特性的影响及体外MRI表现

目的：观察不同浓度超顺磁性氧化铁（SPIO）标记对干细胞生物学特性的影响及SPIO标记后BMSCs体外的MRI特征。材料与方法分离、培养SD大鼠的BMSCs,取第四代的BMSCs,通过流式细胞仪检测表面抗原。不同浓度的SPIO标记液标记BMSCs,通过普鲁士兰染色检测标记效率,台盼兰活细胞计数检测细胞活力,MTT法检测细胞增殖活性。通过MRI检查,观察体外不同浓度SPIO标记细胞的信号变化情况。结果 SPIO在25～50μg/ml的浓度范围可以安全、高效地标记BMSCs,不会影响BMSCs的表型、活力和增殖等生物学特性;当SPIO浓度在75μg/ml以上时,BMSCs活性及增殖能力逐渐降低。随着SPIO标记浓度的增加,细胞内摄入的铁逐渐增多,而T2信号强度则逐渐降低;当SPIO浓度≥50μg/ml,标记细胞的T2信号强度与普通BMSCs相比较均有明显差异（P〈0.05）。结论适当浓度的SPIO标记BMSCs对其生物学活性没有明显影响,且MRI扫描能够有效检测其信号变化。     

全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记

背景：要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节。目的：采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法。方法：通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞。经传代扩增,细胞进一步纯化。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果。利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线。结果与结论：全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱。PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变。结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法。     

立磁胞内标记食蟹猴骨髓基质细胞

背景: 有关利用菲立磁体外细胞标记研究选择的动物主要是啮齿类动物,而研究灵长类动物食蟹猴的报道目前仍是空白.目的:观察利用菲立磁和转染试剂体外磁性标记食蟹猴骨髓基质细胞方法的可行性.方法:无菌条件下取食蟹猴骨髓,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞,使用菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞,普鲁士蓝染色、电镜和锥虫蓝排除实验等方法鉴定菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记食蟹猴骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,倒置相差显微镜和免疫细胞化学方法检测骨髓基质细胞的增殖和分化能力.结果与结论:菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞,标记效率在99%左右.光镜和电镜下骨髓基质细胞胞质内分别可见细小的蓝色铁颗粒和许多包裹铁颗粒的囊泡.菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显影响.提示菲立磁可以用来体外标记食蟹猴骨髓基质细胞.     

5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记大鼠骨髓间充质干细胞的有效性

背景：深入准确地研究骨髓间充质干细胞在体内外增殖、分化的规律,寻找安全、有效、灵敏度高、特异性强、简便的标记活细胞的方法至关重要。目的：探索5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的有效性及对其增殖能力的影响。方法：全骨髓贴壁法培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞至第3代。将细胞以5×107L-1浓度接种于96孔板中,掺入法加入终浓度为0,10,20,50μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷,分别在培养24,48和72h检测5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记细胞的阳性率、标记后的细胞形态,并绘制标记细胞的生长曲线。结果与结论：各浓度组标记率均随标记时间延长而升高（P〈0.05）;各时间点标记率随标记浓度的升高而增加,但其差别无显著性意义（P〉0.05）。10μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶标记骨髓间充质干细胞72h即可获得良好的标记率。标记前后各组间充质干细胞生长曲线均呈＂S＂形。说明在实验浓度范围内应用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷体外标记骨髓间充质干细胞有效,不影响细胞的增殖,且10μmol/L5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞72h即可获得良好的标记率。     

铁羧葡胺磁化标记大鼠骨髓间充质干细胞的有效性及安全性研究

目的:探讨超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)铁羧葡胺(SHU555A,商品名为Resovist)标记大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的有效性及安全性。方法:分离培养大鼠骨髓MSCs,将其与50μg/mL Resovist共孵育24 h,并暴露于中心表面磁感应强度0.6 T磁场,采用普鲁士蓝染色、细胞透射电镜、原子吸收分光光度法检测细胞标记效率,采用细胞增殖试验及细胞活力检查观察细胞的标记毒性。结果:大鼠MSCs经Resovist标记后,普鲁士蓝染色显示,细胞内均可见大量着色颗粒,标记率接近100%;电镜检查显示,胞质内有含铁致密颗粒囊泡,未见氧化铁对细胞微细结构的破坏和毒性作用;原子吸收分光光度法测定结果显示,细胞平均铁含量(21.77±3.62)pg。Resovist标记和外加磁场对细胞增殖能力、细胞活力均无明显影响。结论:Resovist标记大鼠骨髓MSCs高效、安全,在细胞磁靶向方面具有临床应用潜力。     

藏红花素对缺氧环境下Wistar大鼠视网膜Müller细胞活性和胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的 观察不同浓度藏红花素对缺氧条件下RMC活性和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响.方法 改良Reichenbach等方法原代培养Müller细胞,并采用GFAP和Vimentin染色鉴定RMC.RMC培养基中加入终浓度10 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L藏红花素,于1~7 d计数细胞,于24 h和48 h台盼蓝染色测定细胞活性,对照组RMC培养基中未加入藏红花素.培养液中加入终浓度为200 μmol/L的CoCl2建立化学缺氧模型.实验分4组:缺氧组(H组)、藏红花素处理组(C组)、缺氧+藏红花素处理组(HC组)和正常对照组(NC组),其中C和HC组培养液中加入10 μmol/L藏红花素.处理24 h,台盼蓝染色检测细胞活性,采用Western blot法半定量检测GFAP的表达.结果 含10 μmol/L和50 μmol/L藏红花素的培养液中,细胞生长无抑制;100 μmol/L 藏红花素的培养液中细胞增生受到抑制,培养24 h和48 h RMC活性分别为(68±7)%、(59±9)%,与对照组相比,明显降低(t24h=3.723,P<0.05;t48h=4.103,P<0.05).在缺氧条件下,正常细胞和10 μmol/L 藏红花素的培养液中细胞活性受到明显抑制,藏红花素可减轻缺氧环境对细胞活性的抑制作用.在缺氧条件下,GFAP表达明显升高(t=2.945,P<0.05);藏红花素可部分抑制GFAP高表达(t=3.362,P<0.05).结论 缺氧能诱导体外培养视网膜Müller细胞死亡,适合浓度藏红花素可抑制缺氧诱导的视网膜Müller细胞死亡.     

人胚嗅鞘细胞与鼠胚胎脊髓组织联合移植对大鼠脊髓损伤的治疗

背景:脊髓损伤高发且后果严重,至今尚无有效措施挽救丧失的神经功能。哺乳动物嗅觉系统的一类特殊胶质细胞的移植引起关注。目的:观察人胚嗅鞘细胞和大鼠胚胎脊髓共同移植在促进大鼠横断脊髓轴索再生方面是否产生协同作用。设计:开放性实验。单位:无锡第三人民医院细胞室,苏州大学附属第一医院神经外科,东南大学附属中大医院神经外科。材料:实验于2002-09/2004-10在无锡市第三人民医院细胞实验室完成。①选取清洁级成年雌性SD大鼠36只,随机数字表法分成4组:人胚嗅鞘细胞组10只、鼠胚胎脊髓组10只、联合移植组10只,模型组6只。②取12周左右的流产新鲜人胚胎(产妇知情同意)用于嗅鞘细胞的培养纯化。③取孕14d的SD大鼠1只,施行剖腹手术将胎鼠连同胎膜一同取出,用于新鲜胚胎脊髓的制备。方法:①4组大鼠均建立脊髓半切洞模型。模型组在损伤洞腔内填塞明胶海绵加全培养基8μL,在损伤上下各1mm处注射相同培养基2μL;人胚嗅鞘细胞组明胶上给予嗅鞘细胞悬液8μL,损伤上下各1mm处注射细胞悬液2μL;鼠胚胎脊髓组将组织碎块直接填塞在洞腔内,外覆明胶;联合移植组将同样大小的胚胎脊髓填塞在洞腔内,然后用微量加样器将8μL的嗅鞘细胞悬液注入洞腔,外覆明胶,在洞腔上下各1mm处注射细胞悬液2μL,按层缝合肌层皮肤。②定期对各组大鼠进行行为学评定,结合病理学观察,并通过辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺逆行示踪技术,评价嗅鞘细胞和胚胎脊髓对神经元存活、纤维再生的影响。主要观察指标:①人胚嗅鞘细胞体外培养及纯化。②体外免疫细胞化学分析。③大鼠后肢运动功能BBB评分测定结果。④移植物及受损脊髓修复的免疫组化检测结果。⑤辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺示踪对各组被标记的皮质及中脑红核神经元的定量分析情况。结果:①人胚嗅鞘细胞大部分呈双极纺锤型,培养5～7d左右,细胞相互交织成网状,可见大量细胞分裂相。纯化后的细胞纯度为85%。②P75阳性细胞率为(83±7)%,大约(81±6)%的细胞呈胶质纤维酸性蛋白阳性,(91±9)%的细胞呈Vimentin阳性,Nestin阳性率为(77±5)%。③术后3～5d,模型组伤肢开始挛缩,正常侧下肢活动稍受限,其余3组少见明显挛缩症状。从术后2周开始,各组动物行为功能的恢复幅度明显增快,联合移植组BBB评分明显高于人胚嗅鞘细胞组、鼠胚胎脊髓组、模型组[(6.2±1.13),(5.0±1.15),(3.9±0.88),(3.3±1.03)分,P<0.05]。④人胚嗅鞘细胞组、联合移植组均在移植部位及移植区2.0～5.0mm范围内见到P75及胶质纤维酸性蛋白阳性双极或多极细胞,同时多极细胞中发现碱性蛋白( )颗粒。鼠胚胎脊髓组、联合移植组脊髓缺损灶内存在大量MAP2阳性反应的细小神经元。人胚嗅鞘细胞组、鼠胚胎脊髓组、联合移植组在脊髓缺损区内都不同程度观察到神经丝阳性纤维存在,尤以联合移植组最为明显,模型组未能找到神经丝阳性纤维存在。⑤模型组损伤侧神经元基本无辣根过氧化物酶标记,而联合移植组标记的皮质、中脑红核神经元的数量均显著高于人胚嗅鞘细胞组、鼠胚胎脊髓组(P<0.05)。结论:嗅鞘细胞和胚胎脊髓联合移植对损伤脊髓具有明显保护作用且促进宿主脊髓轴突再生,在加快大鼠的功能恢复中起到了互补和协同的作用。     

嗅鞘细胞和神经干细胞联合移植阿尔茨海默病大鼠脑内的增殖和定向分化

背景:阿尔茨海默病大鼠脑内神经元减少,神经干细胞移植后增殖和向神经元分化能力有限。目的:观察联合移植嗅鞘细胞和神经干细胞在阿尔茨海默病大鼠脑内,嗅鞘细胞对神经干细胞的增殖和向胆碱能神经元分化的影响。方法:体外培养嗅鞘细胞和神经干细胞,移植前用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记神经干细胞。将生理盐水,神经干细胞和神经干细胞+嗅鞘细胞分别移植入阿尔茨海默病模型大鼠海马。移植7,14,21,28d后,进行大鼠脑组织切片免疫组织化学染色检测BrdU和ChAT阳性表达。结果与结论:联合移植组神经干细胞的增殖和分化情况明显优于其他两组,联合移植组BrdU阳性细胞数和ChAT阳性细胞数明显高于神经干细胞移植组和生理盐水组(P<0.01)。提示嗅鞘细胞能促进移植的神经干细胞在阿尔茨海默病大鼠脑内增殖和向胆碱能神经元的分化。     

SPIO标记猪脂肪干细胞的生物学特性与多向分化潜能及体外3.0T MR成像

背景：不同种类细胞的最佳化标记方案需要大量实验证明,而每种细胞对应标记策略的安全性检测至关重要。目的：应用超顺磁性氧化铁联合多聚左旋赖氨酸标记猪脂肪干细胞,探讨磁标记对细胞生物学特性和多向分化潜能的影响以及标记细胞体外3.0TMR成像特性。方法：五指山小型猪皮下脂肪分离培养脂肪干细胞;超顺磁性氧化铁-多聚左旋赖氨酸复合物标记液标记脂肪干细胞;应用3.0TMR对不同浓度标记细胞进行T1WI、T2WI及T2＊WI序列体外成像。结果与结论：普鲁士蓝染色显示标记细胞胞质内含有多少不等的蓝染铁颗粒,细胞标记率近100%;标记细胞向心肌、骨、脂肪方向诱导分化成功;不同浓度标记细胞MR扫描显示,随细胞浓度升高,3种序列信号变化率均增加;相同浓度细胞T2＊WI信号变化率最大,T1WI最小,同一浓度3种MR序列间信号变化率差异均有显著性意义（P〈0.01）;3.0TMR成像能检测到至少1×106L-1标记细胞。结果显示应用超顺磁性氧化铁联合多聚左旋赖氨酸标记方案可有效标记脂肪干细胞,不影响细胞活力、增殖及多向分化能力;T2＊WI序列检测标记细胞最敏感。